Содержание к диссертации
Введение
Нуклеосомная фибрилла (10 нм) 8
30-нм фибрилла 9
Топология нуклеосомной фибриллы внутри 30 нм-фибриллы 9
Прерывистость 30-нм фибриллы 10
Артефактность 30-нм фибриллы 12
Хромонема 14
Внутренняя организация хромонемы 19
200-250 нм фибриллы 23
Высшие уровни компактизации хромосом растений 25
Топология реплицирующегося хроматина у растений 27
Материалы 29
Биологический материал 29
Расходные материалы 29
Реагенты 29
Оборудование 30
Методы 30
Введение репликационной метки в клетки корневой меристемы Nigella damascena 30
Выявление репликационной метки на полутонких срезах 30
Приготовление хромосомных препаратов 31
Электронная микроскопия 32
Разработка метода мечения реплицирующегося хроматина в корешках растений 34
Solanum lycopersicum 38
Nigella damascena 42
Два варианта структурной организации митотических хромосом растений 49
Распределении репликационной метки в митотических хромосомах Nigella damascenа 57
Компактизация и декомпактизация хромосом Nigella damascena во время митоза 60
Морфометрический анализ фибриллярных субструктур митотических хромосом 63
Заключение 78
Выводы 81
Список сокращений 82
Список использованной литературы 83
- Артефактность 30-нм фибриллы
- Топология реплицирующегося хроматина у растений
- Выявление репликационной метки на полутонких срезах
- Компактизация и декомпактизация хромосом Nigella damascena во время митоза
Артефактность 30-нм фибриллы
Артефактность 30-нм фибриллы
Организация 30-нм фибриллы до сих пор остается малопонятной (van Holde and Zlatanova, 2007), а последние данные заставляют усомниться в самой реальности существования этой фибриллы (Razin and Gavrilov, 2014; Joti et al., 2012). Прогресс в этой области связан с достаточно быстрым развитием методов криоэлектронной микроскопии, т.е. анализа клеток или макромолекулярных комплексов с витрифицированном состоянии. Считается, что витрификация позволяет сохранить клетки в состоянии идентичном живому, а возможность изготовить криосрезы дает возможность изучать образцы в электронном микроскопе.
В 1986 году в революционной работе группы Дубочета с помощью криоэлектронной микроскопии было продемонстрировано, что в хромосомах митотических клеток CHO и HeLa не выявляются 30-нм фибриллы, а хромосомы формируются в результате плотной упаковки 10-нм фибриллы (McDowall et al., 1986). В последующих работах с помощью криоэлектронной микроскопии были исследованы интерфазные ядра, в которых также не были выявлены 30 нм фибриллы (Dubochet and Sartori Blanc, 2001; Bouchet-Marquis et al., 2006; Fakan and van Driel, 2007). В дальнейшем отсутствие 30 нм фибрилл было показано методами фиксации конформации хромосом (Dekker, 2008), электронно-спектроскопической томографии (Fussner et al., 2012, 2011а; 2011b) и крио-электронной томографии (Gan et al., 2013; Mahamid et al., 2016). Недавно были описаны супрамолекулярные структуры, сформированные с помощью обратимой, магний-зависимой самоорганизации из линейных нуклеосомных комплексов. Эти реконструированные структуры хроматина были глобулярными и в их составе выявлялись только 10-нм фибриллы, но не 30-нм фибриллы (Maeshima et al., 2016). Таким образом, данные как in situ, так и in vitro свидетельствуют об артефактности 30 нм фибриллы.
В чем же причина того, что при стандартной альдегидной фиксации в ядрах и хромосомах четко выявляются 30-нм фибриллы? Сравнительный анализ клеток после различных типов фиксации показал, что при криоэлектронной микроскопии 30-нм фибриллы выявляются только после альдегидной фиксации, т.е., по-видимому, являются артефактом фиксации (Eltsov et al., 2014).
Удивительно то, что в некоторых типах клеток в ядрах 30 нм фибриллы, все-таки, удается выявить. Это было показано для эритроцитов курицы (Langmore and Schutt, 1980; Woodcock, 1994; Scheffer et al., 2011) и спермы морской звезды (Scheffer et al., 2012; Woodcock, 1994). Это клетки терминально дифференцированные, и транскрипция в них почти полностью подавлена. Интересная ситуация описана в ядрах палочек сетчатки глаза мыши. В этих ядрах в центре расположен сильно конденсированный домен гетерохроматина (не содержащий 30 нм фибрилл), окруженный гетерохроматином упакованным в 30 нм фибриллы (Kizilyaprak et al., 2010). Возможно, образование 30 нм фибрилл в этих клетках является естественным способом подавления экспрессии генов (Maeshima et al., 2014). Присутствие 30 нм фибриллы может говорить о более эффективном взаимодействие нуклеосом внутри фибриллы, чем между фибриллами. Облегчению взаимодействия внутри нуклеосомных фибрилл может способствовать большее количество линкерных гистонов (Hansen, 2002; Kowalski and Payga, 2011; Woodcock et al., 2006) и специфические модификации гистонов (Kowalski and Payga, 2011), например, их ацетилирование (Kizilyaprak et al., 2010). В целом, эти данные явно выбиваются из основного массива данных, но косвенно свидетельствуют о принципиальной возможности формирования 30 нм фибрилл в некоторых условиях.
Наиболее наглядное объяснение имеющихся экспериментальных данных было дано в рамках модели «плавления полимера» («polymer melt»), согласно которой 10 нм фибриллы существуют в неупорядоченном перемешанном состоянии, похожем на расплавленные полимеры (Eltsov et al., 2008; Maeshima et al., 2010). Важно отметить, что хроматиновые фибриллы способны достаточно свободно перемешиваться друг с другом. Например, показано, что хромосомные территории перемешиваются по периферии (Branco and Pombo, 2006), а домены, подвергнутые репрессии белковыми комплексами Polycomb (PcG), характеризуются высокой степенью перемешивания хроматина внутри домена (Boettiger et al., 2016). Возможность перемешивания связана со способностью нуклеосом достаточно свободно двигаться. Прижизненные наблюдения показали, что нуклеосомы в составе интерфазных ядер и митотических хромосом подвижны, наблюдаются достаточно значительные флуктуации положения нуклеосом (50 нм/30 мсек) (Hihara et al., 2012; Mazza et al., 2012; Nozaki et al., 2013). По-видимому, динамические свойства нуклеосом объясняют эффект перемешивания хроматина на микроуровне.
Накопленные данные о компактизации нуклеосомной фибриллы свидетельствуют о возможности получить на выходе различные морфологические структуры, причем, в составе хроматина отдельные фибриллы могут фактически исчезать в результате «перемешивания» нуклеосом. Таким образом, представления о 30 нм фибрилле являются, до некоторой степени, упрощением реально существующей ситуации, а полученные преимущественно на реконструированных фибриллах данные о тонкой организации 30 нм фибриллы требуют пересмотра с использованием современных методов исследования. Реальная ситуация может оказаться намного динамичнее и полиморфнее, чем это кажется сейчас, а получаемые данные могут описывать усреднение, которое скрывает особенности процессов происходящих в хроматине живых клеток.
Топология реплицирующегося хроматина у растений
Морфология хромосом Nigella damascena на разных стадиях митоза На левой и центральной картинках полутонкие срезы корешков Nigella damascena (общий вид и фрагмент), окрашенные DAPI. Правая панель показывает график распределения плотности вдоль линии, проведенной на центральной панели. a Ранняя профаза (хромосомы показаны треугольными стрелками). b Средняя профаза (фибриллы, образующие хромосомы и соответствующие ранне-профазным хромосомам, выделены треугольными стрелками). c Поздняя профаза. d Метафаза. e Анафаза. f Ранняя телофаза (полости в аксиальной области показаны стрелочками, а фибриллы, формирующие телофазные хромосомы, треугольными стрелками). g Поздняя телофаза. h G1 фаза. Масштабная линейка – 1 мкм. С использованием полутонких срезов удается разделили профазу на три этапа, которые условно назвали ранней, средней и поздней профазой. Подчеркнем, что такое деление очень условно, так как большинство профазных клеток соответствовало по морфологии средней профазе, т.е. длительности морфологических стадий, обозначенных нами как ранняя и поздняя профазы, были относительно невелики. Т.е. обозначение стадий (ранняя, средняя, поздняя) связано не со временем, а с этапами морфологического формирования митотической хромосомы.
В ранней профазе внутри ядер выявлялись преимущественно тонкие хромосомы (диаметр 0.6 мкм). В средней профазе в ядрах выявляются хромосомы, диаметр которых был примерно в два раза выше, чем диаметр хромосом в ранней профазе ( 1.2 мкм). Внутри этих хромосом удавалось выявить тонкие фибриллярные субструктуры, диаметр которых примерно соответствовал диаметру ранне-профазных хромосом. В поздней профазе хромосомы приобретали однородную структуру, и в их составе уже было невозможно визуализировать какие-либо субструктуры. Таким образом, в профазе наблюдался процесс формирования и утолщения профазных хромосом, причем наблюдения свидетельствуют в пользу того, что это утолщение происходит за счет сворачивания (фолдинга) ранне-профазных хроматид.
В метафазе и анафазе структура хромосом была однородной, но уже в ранней телофазе в осевой области хроматид появлялись полости, которые постепенно увеличивались в размере. Стенка хроматид в этом случае имела диаметр похожий на диаметр ранне-профазных хроматид ( 0.4 мкм). Можно предполагать, что в этом случае наблюдался процесс обратный, произошедшему в профазе. Анализ сворачивания (фолдинга) хроматиновых фибрилл с помощью репликационного мечения хроматина
Схема эксперимента по проверки двух гипотез о механизме профазного утолщения хромосом При анализе морфологии митотических хромосом наименее однозначные данные были получены при рассмотрении перехода от ранне-профазной к поздне-профазной хромосоме (Рис. 13). Хотя полученные изображения свидетельствуют скорее в пользу сворачивания (фолдинга) ранне-профазной хромосомы, но отсутствие возможности провести прижизненные наблюдения не позволяет подтвердить это предположение прямыми наблюдениями. Теоретически возможен и другой механизм утолщения хромосомы – равномерное укорочение, что могло бы приводить к градуальному утолщению ранне-профазной хромосомы. Проверить эту гипотезу можно внеся метки в обособленные участки хромосом. В этом случае при переходе от ранней к поздней профазе произойдет либо сплющивание отдельных меченный районов (укорочение хромосом), либо меченые районы будут распределяться по объему поздне-профазной хромосомы (фолдинг) (Рис.14).
Распределении репликационной метки в митотических хромосомах Nigella damascenа
Для постановки эксперимента, описанного выше (Рис. 14) мы использовали репликационную метку, т.е. включение меченного нуклеотида в ходе репликации ДНК. Для решения поставленной задачи нам было необходимо, чтобы метка распределялась в дискретных, обособленных друг от друга областях хромосом. Так как метка может включаться в хромосомы по разному, в зависимости от стадии S-фазы, в которую происходило мечение, мы проанализировали распределение меченого хроматина в хромосомах. Было выявлено три основных варианта распределения меченого хроматина (Рис. 15). (1) В первом варианте метка располагалась в плечах хромосом в виде отдельных точек, в центромерной части метка не выявлялась. (2) Во втором варианте метка была равномерно распределена в плечах хромосом, однако центромеры не были окрашены. (3) Третий вариант характеризовался равномерным распределением метки по всей длине хромосомы, включая прицентромерной участки (с небольшими вариациями яркости вдоль оси хромосомы).
Nigella damascena Синим показан хроматин, окрашенный DAPI; красным хроматин, включивший EdU. Выявленные варианты не имели четких границ и, казалось, что происходит плавный переход между ними. Чтобы определить стадии S-фазы, когда был мечен хроматин каждого из выявленных вариантов, мы провели стандартный анализ меченых митозов на разных сроках после введения метки. Результаты анализа приведены на рисунке 16.
Эти данные помогли отнести паттерны к разным стадиям S-фазы. Так первый вариант преобладает в препаратах, фиксированных через 4 часа после введения метки, т.е. соответствует мечению хроматина поздней S-фазе. Хромосомы с равномерным распределением метки в плечах (варианты 2 и 3) преобладает в средней и ранней S-фазе, мечение прицентромерных районов (вариант 3) характерен для границы средней и ранней S-фазы (7-8 часов после введения метки).
Для целей настоящего исследования важно, что первый вариант можно использовать для мечения хромосомных районов, так как метка была распределена в виде обособленных точек. Мечение было специфичным, так как в гомологичных хромосомах распределение метки было похожим (рис. 17).
Выявление репликационной метки на полутонких срезах
Разрешающая способность световой микроскопии не позволяет изучать тонкую организацию выявленных фибриллярных компонентов. Поэтому в дальнейшем мы провели стандартный электронно-микроскопический анализ митотических клеток корневой меристемы Nigella damascena. В ходе работы мы столкнулись с тем, что визуально в хромосомах можно выявить несколько типов фибрилл, без количественной оценки их размера (диаметра) установить их природу представляется достаточно сложным. Поэтому мы дополнительно провели морфометрический анализ выявляемых фибрилл.
Любой морфометрический анализ с использованием ультратонких срезов очень сильно страдает от невозможности объективного выбора сечений через середину измеряемых объектов. В результате любой результат измерений диаметра фибрилл даст несколько заниженную среднюю величину, однако вклад этого занижения удается оценивать по форме распределений (ошибки в выборе объектов приводят к появлению избыточного числа измерений с заниженными значениями. В рамках данного исследования мы выбирали сечения через середину хромосом визуально, т.е. субъективный фактор очень велик. Поэтому для контроля качества измерений мы во всех случаях приводим не только результаты измерений, но и гистограммы распределения диаметров фибрилл.
Для подсчетов были исследованы продольно срезанные через середину хромосомы/хроматиды. Четкие, регулярные полости внутри позволяли выявлять несколько типов фибрилл, различающихся диаметром. Для примера на рисунке 20 приведен пример телофазной хроматиды и обозначены измеряемые типы фибриллярных субструктур. Сначала измерялся диаметр всей хромосомы (Рис. 20, красная линия). При наличии в ней четкой полости в центре измеряли толщину стенок (Рис. 20, желтые линии), в которых, в свою очередь, при наличии четких полостей по центру выделялись фибриллы с меньшим диаметром (Рис. 20, зеленые линии).
Мы последовательно проанализировали интерфазные клетки и все стадии митоза (от 9 до 18 клеток на одну стадию). Для анализа интефазных клеток выбирались крупные ядра с хорошо выраженными интерфазными хромонемами что, по данным литературы, соответствует стадии G2 (Hao et al., 1994). В интерфазных ядрах выявляется сеть неупорядоченных фибрилл – интерфазных хромонем. Интерфазные хромонемы имеют средний диаметр 234 ± 50 нм (Таблица 4, Рис. 21).
Наибольшие сложности представлял анализ профазных ядер. Мы, как и в случае свето-микроскопического изучения смогли выделить три стадии профазы. Важно подчеркнуть, что стадии профазы при свето-микроскопическом и электронно-микроскопическом изучении, вероятно, не соответствуют друг другу. В обоих случаях стадии выделялись не в привязке ко времени, а на основе морфологических особенностей хромосом. Разделение на стадии в нашей работе преследовало целью классификацию выявляемых структур.
Ранняя профаза характеризовалась началом конденсации хромосом. Хромосомы на этой стадии еще плохо обособлены друг от друга, хотя промежутки между хромосомами уже появлялись. В итоге, мы не проводили измерения диаметра хромосом на этой стадии. Хромосомы (или, возможно, группы не разделившихся хромосом) были образованы фибриллами, которые, по аналогии с клетками животных, можно называть хромонемами1. В ранней профазе выявляются фибриллы со средним диаметром 148 ± 30 нм (хромонемы) (Таблица 4, Рис. 22).
Утоньшение хромонем в ранней профазе по сравнению с интерфазой может объясняться либо конденсацией интерфазных хромонем, либо, наоборот, их деконденсацией и выявлением субструктур. В пользу второй гипотезы свидетельстуют данные работы Горнунг с соавт. (Gornung, E. M.; Polyakov, V. YuD; Chentsov-Yu, 1986), в которой было показано, что интерфазные хромонемы образованы тонкими (60-80 нм) фибриллами. К таким же выводам пришли и авторы другого исследования процесса конденсации хромосом в профазе (Hao et al., 1994). Мы также обратили внимание, что внутри интерфазных хромонем достаточно часто видны небольшие полости, что может свидетельствовать о формировании интерфазных хромонем в результате компактизации хромонем, которые и обособляются в ранней профазе. Мы будем придерживаться данной трактовки, понимая, что этот вопрос требует отдельного изучения, выходящего за рамки данной работы.
В средней профазе (Рис. 23) хромосомы были уже хорошо обособлены и могли быть прослежены на достаточно большом расстоянии. Их диаметр составлял 527 ± 110 нм (Таблица 4). Эти хромосомы могут быть соотнесены с ранне-профазными хромосомами, видимыми при свето-микроскопическом изучении. В их составе также выявлялись фибриллярные комплексы диаметром 158 ± 50 нм (Таблица 4), т.е. хромонемы.
Компактизация и декомпактизация хромосом Nigella damascena во время митоза
Согласно известному афоризму, приписываемому классику изучения ультраструктуры хромосом Х. Рису, хромосомы слишком велики для электронной микроскопии и слишком малы для световой микроскопии. Недавно разработанные методы микроскопии с супер-разрешения позволили добиться беспрецедентного разрешения хромосомных субструктур (Matsuda et al., 2010; Ricci et al., 2015; Boettiger et al., 2016). Однако растения не являются удобных объектом для работы с использованием данных методик. Наилучшие результаты получаются при работе с тонкими объектами, например, с хорошо распластанными культивируемыми клетками животных. При работе с растениями приходится использовать тканевые образцы, в которых клетки не распластаны, и толщина их является препятствием для получения качественных изображений.
В данной работе мы использовали комбинацию методов световой и электронной микроскопии для исследования хромосом растений с гигантским геномом. Чтобы улучшить разрешение при световой микроскопии мы разработали метод анализа хромосом на полутонких (200-250) срезах корневой меристемы, заключенной в акриловую смолу. Это позволило улучшить аксиальное разрешение, что особенно важно при работе с клетками растений с гигантским геномом.
В отличие от хромосом животных, у которых хроматин в хромосомах равномерно конденсирован, в хромосомах некоторых растений наблюдаются полости в аксиальной области (Lafontaine, 1963; Sparvoli et al., 1965; HAO et al., 1988; Hao et al., 1990). Мы проанализировали опубликованные данные и дополнительно изучили хромосомы 12 видов растений и обнаружили, что организация хроматина с полостями в центре характерна для видов с гигантскими хромосомами. А именно: принцип конденсации хромосом менялся при среднем размере хромосомы больше 0,8 пг на хромосому. Вероятно, что именно это изменение организации позволило растениям в дальнейшем увеличивать диаметр и, как следствие, размер хромосом. Стоит отметить, что подобная организация хромосом (с полостями в аксиальной области) была найдена в эволюционно далеких видов, как у однодольных, так и у двудольных. Это может указывать на независимое появление данной особенности строения в разных группах.
Нам удалось выявить два высших уровня компактизации хроматина. Это так называемые хромонемы и фибриллы диаметром 285 ± 102 нм в поздней профазе (в наиболее конденсированном состоянии), которые можно назвать 300 нм фибриллами. Эти фибриллы соответствуют ранне-профазным хромосомам. По-видимому, эти уровни компактизации соответствуют фибриллами диаметром 100-130 нм (хромонема) и 200-250 нм, описанным у животных (Рис. 30).
Рис.30. Модели конденсации хромосом животных и растений. a Хромосомная организация у млекопитающих. b Хромосомная организации у растений с гигантскими хромосомами. Хромонемы в хромосомах Nigella damascena были несколько толще (примерно 150 нм), чем в хромосомах животных (Zatsepina et al., 1983; Belmont and Bruce, 1994; Kireeva et al., 2004). Это может свидетельствовать в пользу предположения о том, что увеличение диаметра фибриллы является одним из механизмов, приводящих к увеличению размера хромосом. Однако, в профазных хромосомах Allium cepa были обнаружены фибриллы диаметром 106 и 122 нм (Hao et al., 1994), поэтому кажется, что сделать окончательный вывод без детального изучения хромонем большого числа видов растений и животных невозможно.
Следующий уровень конденсации хроматина соответствует ранне-профазным хромосомам, также описанным в хромосомах животных (Kireeva et al., 2004). Диаметр этих фибрилл был в среднем больше, чем в хромосомах млекопитающих, и варьировал от 527 ± 107 нм в ранней до 285 ± 102 нм в поздней профазе. Из-за этой конденсации было невозможно обнаружить хромонемы в поздней профазе. Стадии компактизации-декомпактизации у животных были ранее описаны (Liang et al., 2015). Важно, что топология фолдинга 300 нм фибриллы принципиально отличается от таковой у животных. Хотя нам не удалось точно определить топологию хроматиновых фибрилл в митотических хромосомах, периферическое расположение 300 нм фибрилл было хорошо видно в телофазных хромосомах. Широко распространено мнение, что для хромосом растений характерна спиральная упаковка слагающих ее компонентов. Никаких надежных доказательств этого нет.
Таким образом, увеличение размера и диаметра хромосом Nigella damascena произошло за счет изменений топологии хроматиновых фибрилл, а не за счет изменения количества уровней компактизации хроматина.