Введение к работе
Актуальность теш.В 70-о гг.,в особенности посла работ ДЛфза & Cootos» 1973; 1975) .продемонеурпроваїжиг принцгаїиаль-вуо соаглгаость иорфогекеттгаапос двягэния в раннем эмбрио-геиогв окфйбия при сяачптельном подавлении клеточных делэ-insS,постепенно утвзрдилось представление,соглашо которому плеточная репродукция лкбо вообще не принимает участие в кор-фоггнезз, либо ээ участие сводится в вспомогательной роли поетапна клеточного материала (Еіреша,І958; Белоусоа,І990).
Везете с тем при рассмотрении причинно-следственных от-ксггяпї! гзіщу пролігфзравпвй,дііф$ереягшацией и морфогенезом в последяез время вез большее внаташа приобретает систекныя {надалеточнна) acnes?. Ограгением этой тенденция стало фор:„"у-дпроггнпэ рода пологзяий о тон,что в развертывании слогной програми цорфэгеяезоэ и зійриональноя дифференциации боль-сгез еяачгпкэ газет физиологическая гетерогенность клеточных спстет, обусловленная состодтеи кгаютяга пролиферации к срог^э всего Еоіяоспцлей шієточяїпг noayauactft (Доіідуа, 1983; Лщгрозпа,І950). Два этом предполагасгея.чго спецпфжа яоідо-сзцпі кого? бігь oSECT'csseairofl па дтфЗзрспцпальяув чувстзи-гелыгоегь пгеточя2Х севозупностез п расносбравніга їдарфоїчята-^птезези йзггерга СЙреік»з,І97о) в ряда случаев клеточжЗ щзз пэгз? иддуаагъ в роли своеобразного гайяра.садас^зго р:т?а пагштсрз: пгрподй»ггсгзі повтсрггг^Еся газоа іарфогеявга { Stoza a=d Воііоігз Д985; Srln=:rt ей ol. ,1?8Э) Л стелу г-езяг Егргедзчзсззг кзрйгпрецзесаз, сбеезз'лггзг;^ ста-гговлезгэ пегга строспя разгтэгг^сгося ергкшпгз, сгпссптся езг^гжззя' ппгйгспгльлсЯ езгедер^а у srptysrsa egsbcho^hs (сеіггтогсзез).
ІЬесззеїїі сс*^тогспзса авзо прпзле^агя гапялкэ пспл*-дс:гя?злгЯ*по ссебегггэ енгезелпзо е?ст прсцесе начал раергбэ-енггзься в 70-Ш-о го. Пзутег-тэ ccttnsorcrxssa у ггазпкгечнк: г ггасгстрэ грз:;л вздется спрекгм Грс^гкз э езегяяггпз пгвртэ-гепппз; а стдеглнгз пз їгпз десгзгаугп сазеггеягге-э услоп. Г~п пэ стггз thorns с5ст;с::л стогэ пкгеггпя ст гжгпна прогз""»-
'!*730т*Г,Т1а Сї:Г?СЗ "О CSCfc-ГЛ СС'іСЗГСТ-ІПО СЇЇТ.*?ПГСіС17 И ГГСС1~в"3'-
ненными.К числу таких интегрирующих аспектов сомитогенвза можно отнести вопросы: как и чем определяется удивительное видовое постоянство числа сомитов в вгрсдызе; что запускает, хронометрирует и терминирует сегментаяив; в каком отношении находятся скорость сегментации и размеры сомитов,и наконец, каковы регуляционные потенции параксиальной мезодермы и с чем они связаны.
Выполнено достаточное количество исследования клеточной репродукции и особенностей митотических циклов мезодермы при сомитогенезе (Дондуа и Федорова,I964;I967; Priaaet et al. 1989), но все они,как правило.носят описательный характер. До сих пор только на эародыааг амфібий были предприняты попытки экспериментально оценить роль клеточного размножения в этом процессе (Cooke ,1975; Eledale and Davidson ,1986). Как выяснилось, продолжительное ингибирование иитотическях циклов и делений клеток не влияло на процесс сомитогенеза. Однако автоматическое перенесение сделанного заключения на другие группы позвоночных вряд ли оправдано .поскольку хорошо известив принципиальныэ различия в характере и длительности протекания некоторых событий раннего эмбриогенеза (в т.ч. и в способах гаструляциа) у амфибий и ашиот. Более того,показано, что осевая мззодерьа зеродызей птиц в илекопктащвх при сегментации отличается от таковой у аифибнй Еначительыо более высоким пролифератпвнш статусом.
В представленной работе предпринята попытка восполнить существующий пробел в вкспериыентальном анализе участия и роли пролиферации в сомитогенезе,проведя такое исследование на зародышах цыпленка и уделив особое внимание очень вашой количественной характеристико процесса - скорости сагызнтацип.
БЫЛ ИСПОЛЬВОВЗН ТраДИЦВОННЫЙ ПОДХОД,СОСТОЯЩИЙ В BHSSS-
чении на разные сроки клеточной репродукции с помощью ингибитора мятоза-аолхамина. Выбор этого цитостатика в качестве ингибитора клеточного цикла был сделан не случайно. Превде всего хотелось по возмошости избежать проявления несбалансированного синтеаа РНК и белка, вызывающего неконтролируемую гибель клеток. Применение ингибиторов митоза в этом случае предпочтительнее ( HUl«r-?aar*a et.aU , 19Ы). В то as время известно, что колцемид (колхамин) отличается от колхицина менее вы-
раивинш питотоксическкм аффектом .Наконец,как обнаружилось ухе в ходе выполнения данной работы.длительность митостати-дасхой активности колхамина в тканях зародыша зависит от ис-польяуввоа концентрации; после полного связывания его с тубу-лкнами в аародыве блок снимается и клетки оказываются в состоянии продолвйть митотический цикл .Эти результаты показали,что с помощью колхамина при определенных условиях можно получить временный блок митозов и,следовательно,вызвать контролируемую синхронкзашго клеток эмбриона ia ото . При зтом возникла воэмоетость расширить круг изучаемых аспектов, включив сюда вопрос о влиянии композиционных перестроек популяции сегмен-тируших клеток.
Цель и вадачи исследования. Цель работы состояла во всестороннем анализе участия и роли клеточной пролиферации, ее организации в процессе сомитогенеза эмбрионов цыпленка на стадиях детерминации сонитогекных свойств клеток мезодерма и в период ее видимой сегнентадни.В связи с этим были поставлены сяедугоие задачи:
I.Отработать технические условия продояянтельных (до 2-х суток) экспозиций эмбрионов in ото с инъецированным под бластодерму интостатиком и,преаде всего .решить проблему фиэиоло-гпческого растворителя активной субстанции (он ев контрольная среда).
2 .Дать подробную и по возмошости более полную характе-рисгкку иорфо-цитояогических и кинетических изкзнений в изученных популяциях клеток зародышей в момент и после снятия блока кятоаов; оценить уровень и длительность сохранения синхронного состояния.
ЗЛровести дифференцированный анализ ыорфоэффекта колхамина (через ынкротрубочки цитоскелета или через блок пролиферации) на сокктогенез и другие исрфогеяетические процес-сы,уделнв особое вникание скорости езгшктацгок
4.Оценить регуляцяониве воакогности жяетол шзодеркы после рагной степени порадапШ,юзБ&нннх длительным блоком пролиферации.
Научная пошана. Bnepsa? проведен детальный морфоцито- ' логический я авторздаогра<|д'пский анализ кяистшш клвточнкз популяций в еачакюх пурини: е?.;бр:!Сиов в ходе продолгатегь»
ной обработки митостатичаскими агентами - колхамниои и еол-хицином. Обнаружен феномен спонтанного прекращения блока като-
аОВ,ы*эьшаемуГи пилламшіиміл dwuuuiWimimihw «««—— —-^-a** —**
кого цикла. Описаны последовательныэ этапы восстановления веретена деления и превращения к-метафаз в нормальные ыетафазы, анафазы и т.д. Установлена прямая линейная зависимость длительности блока от концентрации колхамнна. Обнаружение факта спонтанного деблокирования и способа произвольно изменять продолжительность блока предоставило возможность вызывать контролируемую синхрониэацкв клеточного цикла в тканях зародыша ia ovo .
Установлена критическая продолжительность пребывания клеток в состоянии к-ыетафязы; клетки,находящиеся в этой состоянии свыше 6-8 часов.претерпевалт пикнотическое перерождение и гибнут .Сделана попытка обосновать предположение,согласно которому наблюдаемая пикнотичаская деградация обусловлена непрерывающейся в к-матафазе суперконденсацией хроматина.
В работе впервые описаны и проанализированы зависящие от концентрации митостатика нарушения скорости новообразования сомитов,степень которых коррелирует с продолжительностью блока митозов.
Научная и практическая значимость. Теоретический интерес представляет главный вывод диссертанта,состоящий в установлении большой зависимости "распространяющихся" морфогенезов,таких как образование и рост первичной полоски.формирование трубчатого сердца и сомитогенеза от количества клеток в местах развертывания этих событий .Баяны полученные доказательства того,что источником (поставщиком) клеток для этих морфопроцессов у зародышей птиц и,по-видшоыу,млекопитающих служит клеточная пролиферация,что,несомненно,является важной особенностью эмбрионального развития амниот .Дефицит клеток,вызванный временным прекращением митотических делений или гибелью клеток,преиде всего отражается на темпах протекания указанных морфопроцессов и неизбежно приводит к дисгармонии раэвития.В этом автор видит значение таких количественных ха-рактеристик,яак скорость сегментации.
Открытие спонтанной обратимости ыитостатического эффекта колхамина и основанный на ней относительно простой способ
- 5-сянхронивацив митотических циклов клеток зародышей цыпленка в ягое, делает эту систему перспективной в исследованиях некоторых современных вопросов цитологии .эмбриологии и молекулярной биологии. Возмовность вызывания с поыощью варьи-руппнх до» колхамина регулируемой гибели клеток несомненно может быть использована при изучении явлений регуляции типа "реставрационного роста" Сноу, а также механизмов возникновения змбриопатий в тератологических исследованиях.
Учитывая,что колхамин как противоопухолевый препарат применяется в клинической практике,полученные в работе данные, доооляядпяе сведения о фармакологических свойствах этого агента,могут быть использованы в медицине.
Апробация работы. Материалы диссертации были доловены и обсукдены на научных семинарах кафедры эмбриологии С-Пе-тербургского университета и лаборатории экспериментальной цитологии Биологического научно-исследовательского института СПбІУ в 1991-92 гг.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введе-няя,4 глав,содервацих обзор литературы,кетодичвсхую часть, результаты я обсуддение; выводов и списка литературы,вклоча-вщего 136 нсточников,иэ которых 91 - Еностранных.Объем руко-mtca 160 с,в т.ч. 8 таблиц, 41 - рисунков и фотографій.