Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Гепатоцеллюлярная карцинома 11
1.2 Клеточное строение печени в норме и при развитии ГЦК 13
1.3 Гетерогенность опухолевой ткани 17
1.4 Эпителио-мезенхимный переход в процессе канцерогенеза 19
1.5 Влияние микроокружения на рост опухоли 21
1.6 Изменение внеклеточного матрикса при канцерогенезе 22
1.7 Молекулярные пути канцерогенеза 25
1.8 Сигнальный путь инсулиноподобных факторов роста 28
1.9 IGF-1 и IGF-связывающие белки при канцерогенезе 31
1.10 Моделирование гепатоцеллюлярной карциномы у мышей 33
Глава 2. Материалы и методы 38
2.1 Моделирование химически индуцированной гепатоцеллюлярной карциномы у мышей 38
2.2 Стратегия отбора экспериментального материала 39
2.3 Гистологический анализ 39
2.4 Получение первичных клеточных культур гепатоцеллюлярной карциномы мыши 40
2.5 Выделение тотальной РНК из ткани печени и клеточных культур ГЦК 41
2.6 Синтез кДНК библиотек 42
2.7 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ПЦР в реальном времени 43
2.8 Статистическая обработка результатов, полученных методом ПЦР в реальном времени 44
2.9 Выявление белков методом Вестерн-блот 46
2.10 Иммуноцитохимическое окрашивание клеточных культур ГЦК 47
Глава 3. Результаты 49
3.1 Модель гепатоцеллюлярной карциномы мыши 49
3.2 Гистологический анализ ткани при развитии гепатоцеллюлярной карциномы мыши 50
3.3 Экспрессия мРНК гена Igf-1R в динамике развития гепатоцеллюлярной карциномы мыши 52
3.4 Экспрессии мРНК генов Igfbp1 – Igfbp-7 в динамике развития гепатоцеллюлярной карциномы мыши 53
3.5 Получение первичных клеточных культур из опухолевой ткани гепатоцеллюлярной карциномы 56
3.6 Экспрессия генов Vimentin и CD44 в первичных культурах ГЦК 59
3.7 Паттерн экспрессии Igf-1, Igf-1R, Igfbp-1 – Igfbp-7 в первичных культурах гепатоцеллюлярной карциномы мыши 61
3.8 Анализ первичных культур ГЦК на маркеры эпителио-мезенхимного перехода 63
3.9 Анализ экспрессии транскрипционных факторов, участвующих в эпителио-мезенхимном переходе в первичных культурах ГЦК 64
3.10 Паттерн экспрессии генов, регулирующих синтез, связывание и деградацию гиалуроновой кислоты в первичных культурах ГЦК 65
3.11 Выявление белков-маркеров ГЦК методом вестерн-блот на первичных культурах ГЦК 67
3.12 Выявление белков CD44 и Has2 методом иммуноцитохимии 67
3.13 Экспрессия Tgf-1 и Tgf-1R в первичных культурах ГЦК под воздействием факторов TGF- и IL-6 69
3.14 Изменение экспрессии маркеров эпителио-мезенхимного перехода в первичных культурах ГЦК под воздействием факторов TGF- и IL-6.71
3.15 Выявление белка CD44 в первичной культуре ГЦК под воздействием смеси факторов TGF- и IL-6 72
Глава 4. Обсуждение результатов 74
4.1 Связь лиганд Igf-1 – рецептор Igf-1R в динамике развития гепатоцеллюлярной карциномы 74
4.2 Паттерн экспрессии мРНК генов Igfbp1 – Igfbp-7 в динамике развития гепатоцеллюлярной карциномы мыши 76
4.3 Молекулярная характеристика первичных клеточных культур гепатоцеллюлярной карциномы мыши 80
4.4 Паттерн экспрессии Igf-1, Igf-1R, Igfbp-1 – Igfbp-7 в первичных культурах гепатоцеллюлярной карциномы мыши 81
4.5 Паттерн экспрессии генов, регулирующих синтез, связывание и деградацию гиалуроновой кислоты 81
4.6 Анализ первичных культур ГЦК на экспрессию генов, участвующих в процессе эпителио-мезенхимного перехода 83
4.7 Смена клеточного фенотипа первичных культур ГЦК под воздействием TGF- и IL-6 85
Заключение 87
Выводы 88
Список литературы 89
Список публикаций и тезисов 110
- Моделирование гепатоцеллюлярной карциномы у мышей
- Экспрессии мРНК генов Igfbp1 – Igfbp-7 в динамике развития гепатоцеллюлярной карциномы мыши
- Паттерн экспрессии мРНК генов Igfbp1 – Igfbp-7 в динамике развития гепатоцеллюлярной карциномы мыши
- Смена клеточного фенотипа первичных культур ГЦК под воздействием TGF- и IL-6
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) занимает пятое место в списке онкологических заболеваний во всем мире и второе место – по смертности. Терапевтические подходы при лечении данного заболевания показывают низкую эффективность (Bruix et al, 2014). Сложность в лечении ГЦК обусловлена гетерогенностью опухолевой ткани вследствие генетических изменений в клетках печени, глубокими изменениями в микроокружении опухоли и неполным пониманием биологии рака (Li, Wang, 2016). Важную роль в обеспечении прогрессии рака и метастазировании играет микроокружение опухоли, которое содержит иммунные клетки, стромальные и внеклеточные компоненты, различные белки и факторы роста, имеющие взаимную сигнализацию (Whiteside, 2008). Среди сигнальных путей в процессе канцерогенеза существенная роль показана для инсулиноподобного фактора роста (IGF) (Samani et al., 2007). Пониженный уровень анаболического пептида IGF-1, вырабатываемого преимущественно печенью, коррелирует с низкой выживаемостью пациентов с ГЦК различной этиологии (Naguib, El-Shikh, 2011). На мышиной модели ГЦК с использованием ДЭНА показано, что экспрессия Igf-1 понижается в опухолевой ткани аденомы (8 мес) и остается низким на стадии карциномы (12 мес), в то время как в окружающей ткани Igf-1 достоверно повышается только на стадии карциномы (Зиневич, Микаелян, 2012).
В последние годы активно изучается роль в канцерогенезе одного из основных не белковых компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ) гиалуроновой кислоты (гиалуронан), увеличение количества которого обычно коррелирует с плохим прогнозом во многих типах рака, включая рак желудка, кишечника, груди, яичника, мочевого пузыря, поджелудочной железы и т.д. (Whatcott et al., 2011). Известно, что избыточное накопление гиалуроновой кислоты характерно для цирроза печени, однако данных о ее количестве и роли в канцерогенезе печени недостаточно.
Возможно, изменение фенотипа клетки искусственно под воздействием различных факторов и/или изменение состава ВКМ поможет в дальнейшем управлять эпителио-мезенхимным переходом (ЭМП) раковых клеток и откроет возможность предотвратить метастазирование ГЦК.
Цель исследования. Оценить влияние Igf-связывающих белков в опухоли и окружающей опухоль ткани, а также различных компонентов внеклеточного матрикса опухолевой ткани на рост и прогрессию экспериментально вызванной гепатоцеллюлярной карциномы мыши in vitro и in vivo.
Задачи исследования:
-
Проанализировать динамику развития ГЦК, экспериментально вызванной диэтилнитрозамином у мышей, на тканевом и клеточном уровне.
-
Определить уровни экспрессии компонентов Igf-зависимого пути (Igf-1R, Igfbp-1 – Igfbp-7) в опухолевой и окружающей ее ткани печени в динамике развития ГЦК.
-
Создать первичные клеточные культуры из опухоли ГЦК, необходимые для детального исследования популяционного состава опухолевой ткани, и охарактеризовать их на морфологическом и молекулярном уровне.
-
Провести анализ экспрессии генов, кодирующих белки синтеза, связывания и деградации гиалуроновой кислоты (Has2, Has3, CD44, Rhamm, Hyal1, Hyal2) в первичных культурах ГЦК.
-
Определить паттерн экспрессии компонентов Igf-зависимого пути (Igf-1, Igf-1R, Igfbp-1 – Igfbp-7) в выделенных из ГЦК первичных клеточных культурах.
-
Оценить способность к смене клеточного фенотипа первичных культур ГЦК под воздействием фактора индукции эпителио-мезенхимного перехода TGF- и провоспалительного цитокина IL-6.
Научная новизна. В динамике развития гепатоцеллюлярной карциномы мыши впервые показан паттерн экспрессии генов, кодирующих Igf-связывающие белки – внеклеточные регуляторы IGF. Впервые проведен сравнительный анализ паттерна экспрессии исследуемых генов в опухолевой и окружающей опухоль ткани печени. Выявленное повышение экспрессии Igfbp-1, Igfbp-5, Igfbp-6, Igfbp-7 в окружающей ткани указывает на влияние микроокружения на прогрессию опухоли ГЦК.
Отработана методика выделения первичных клеточных культур из опухолевой ткани ГЦК мыши. Выделенные культуры охарактеризованы и проанализированы на маркеры ГЦК, маркеры и регуляторы ЭМП, что позволило доказать злокачественность первичных культур ГЦК. Анализ генов сигнального пути Igf-1 в первичных культурах ГЦК выявил аналогичную опухолевой ткани динамику экспрессии Igf-1R и Igfbp-3 и отсутствие экспрессии Igf-1. Эти данные можно отнести к общей характеристике ГЦК, а повышенный уровень Igfbp-3 может рассматриваться как маркер злокачественной стадии гепатоцеллюлярной карциномы.
Теоретическая и практическая значимость работы. Выявленное изменение экспрессии внеклеточных регуляторов сигнального пути Igf-1 существенно дополняет данные, полученные на клиническом материале, а также расширяет представление о молекулярных механизмах развития ГЦК под действием микроокружения. Мы показали, что Igfbp-3 и Igfbp-1, синтезируемые опухолью, и Igfbp-1, Igfbp-5, Igfbp-6, Igfbp-7, синтезируемые окружающей тканью, необходимы для связывания и доставки к рецептору лиганда Igf-1, который активно вырабатывается окружающей тканью опухоли. На основе полученных данных могут быть разработаны новые методы диагностики и лечения, направленного на модулирование различных компонентов системы Igf-1. В частности, регуляция активности Igfbps, возможно, позволит предотвращать не только прогрессирование и метастазирование ГЦК, но и рецидивы, вызванные резистентностью опухолевого микроокружения к терапии.
Полученные данные позволят углубить знания о взаимодействии гетерогенных популяций опухолевых клеток в пределах опухоли, об изменении фенотипа раковых клеток и состава ВКМ, что даст возможность для воздействия на процесс метастазирования и прогрессии такого тяжелого заболевания как рак.
Апробация результатов. Полученные в ходе работы результаты были неоднократно доложены в форме устных (9) и стендовых (1) докладов на российских и международных конференциях: 1) Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (г. Москва; 2013, 2014, 2015, 2016); 2) Конференция молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва; 2013, 2014, 2016); 3) Международная научная конференция «Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы» (г. Минск; 2015, 2016); 4) Всероссийская научная конференция молодых учёных "Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия" (г. Санкт-Петербург; 2016).
Личный вклад автора состоял в анализе научной литературы по исследуемой теме, планировании исследования и выполнении экспериментов, освоении молекулярных и биохимических методов анализа материала, проведении статистической обработки и интерпретации полученных данных, подготовке и представлению результатов исследования на российских и международных конференциях. Основные результаты работы получены лично автором. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих ВАК – 3, тезисов докладов и материалов конференций – 11.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 112 страницах, содержит 24 рисунка, 3 таблицы и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, заключение, выводы, список литературы, включающий 190 цитируемых источников.
Моделирование гепатоцеллюлярной карциномы у мышей
Для исследования патогенеза ГЦК и эффекты возможных методов лечения был разработан ряд мышиных моделей. Идеальная модель рака печени должна точно воспроизводить поведение раковых клеток, адекватно имитировать микроокружение опухоли человека, быть доступной и легко воспроизводимой (Li Y. et al., 2011). К настоящему моменту не существует идеальной мышиной модели для исследования рака печени, однако разработанные модели могут расширить понимание процесса канцерогенеза, если учитывать ограничения каждой модели.
В настоящее время разработаны имплантационные, генетические, химические и спонтанные модели рака печени (He L. et al., 2015).
Имплантационные модели характеризуются коротким периодом моделирования, относительно низкая стоимость и адекватностью в оценке различных методов лечения ГЦК. Имплантировать в мышей-реципиентов можно фрагменты опухолевой ткани, а также клеточные линии ГЦК (He X. et al., 2012; Hu H. et al., 2015; Killion J., Radinsky R., Fidler I., 1998; Fan Z. et al., 2012). В зависимости от места имплантации трансплантата выделяют эктопические и ортотопические модели. В зависимости от вида используемых животных доноров и реципиентов разделяют модели аллотрансплантатов и ксенотрансплантатов. С 70-х годов XX века после публикации данных о росте человеческой опухоли в иммунодифицитных мышах (Rygaard J, Povlsen C.O., 1969) наибольшую распространенность получили модели ксенотрансплантатов.
Развитие технологий трансгенного и генного таргетинга способствовала развитию генно-инженерной модели для изучения биологии опухоли. Наиболее распространенными способами регенерации ГЦК у мыши являются активация онкогенов или инактивация генов-супрессоров опухолей in vivo (Li Y., Tang Z., Hou J, 2011; Koike K., 2002; Feitelson M., Larkin J., 2001).
Модели спонтанного развития ГЦК представляют собой определенные линии мышей, например, C3H и CBA, которые склонны к спонтанной гепатоцеллюлярной неоплазии (Maronpot R., 2009; Soga M. et al., 2003).
Однако воспроизведение такой модели занимает много времени, процентность заболевания мышей низкая, развита гетерогенность опухолевого генеза. Поэтому в настоящее время спонтанные модели ГЦК почти не используются и рассматриваются как непредсказуемые и неуправляемые модели.
Химически индуцированный гепатоканцерогенез начинается с необратимого процесса, сопровождаемого структурными изменениями ДНК (Pitot H., Dragan Y., 1991). К канцерогенам, увеличивающим нестабильность ДНК, можно отнести диметилнитрозамин, афлатоксин, тетрахлорметан, диэтилнитрозамин, тиоацетамид. Наиболее распространена диэтилнитрозамин (ДЭНА) индуцированная модель ГЦК.
Методом кДНК microarray показано, что ГЦК, индуцированная с помощью ДЭНА у мышей, имеет высокое сродство с процессом развития ГЦК у человека и признана генетически достоверной моделью ГЦК человека (Lee J.S. et al., 2004).
Канцерогенная способность ДЭНА заключается в алкилировании структуры ДНК. На первом этапе ДЭНА гидроксилируется до -гидроксилнитрозамина. Эта стадия биоактивации является кислород-зависимой и NADPH-зависимой и опосредуется цитохромом Р450 – ферментом, который обладает наивысшей активностью в гепатоцитах. После расщепления ацетальдегида образуется электрофильный ион этилдиазония, который повреждает структуру ДНК (Williams G.M. et al., 2000).
Органы-мишени, на которые действует ДЭНА, видоспецифичны. У мышей главным образом развиваются злокачественные опухоли в печени.
ДЭНА действует дозозависимым образом, алкилируя структуры ДНК. Однократное введение низкой концентрации ДЭНА не приводит к образованию опухолей, однако доза с высокой концентрацией ДЭНА индуцирует ГЦК после периода латентности. Время, необходимое после однократной инъекции ДЭНА для развития ГЦК, зависит не только от вводимой дозы, но и от пола, возраста, штамма мышей (Rao K.V., Vesselinovitsh S.D., 1973). Чем моложе мыши, тем быстрее будут образовываться опухоли ГЦК, поскольку у молодых мышей высока скорость пролиферации гепатоцитов (Vesselinovich S.D., Mihailovich N., 1983).
Гендерное различие экспериментальных животных влияет на интенсивность процесса развития ГЦК, что обусловлено ингибирующим действием эстрогенов и стимулирующим действием андрогенов на гепатоканцерогенез.
Поэтому предпочтительней брать в эксперимент самцов (Natakani T. et al., 2001). Существует несколько схем введения ДЭНА для достижения канцерогенного эффекта. Дозозависимое образование карцином наблюдается через 45-104 недели после однократной инъекции 5-90 мкг/кг ДЭНА мышам 2-х недельного возраста. Время развития ГЦК зависит от выбранной линии мышей. Например, при введении 90 мг/кг ДЭНА мышам линии C3H ГЦК развивается в 80%-100% случаев через 30-35 недель. В то время как инъекция 5 мг/кг ДЭНА мышам линии C57Bl/6 приводит к образованию 84% ГЦК через 40-70 недель (Zimmers T.A. et al., 2008).
Многократные внутрибрюшинные инъекции приводят к появлению новообразований за более короткий промежуток времени. Например, внутрибрюшинные инъекции в течение 6 недель (3 недели доза ДЭНА составляет 75 мкг/кг, следующие 3 недели – 100 мкг/кг) 5-недельным самцам линии BALB/c приводят к 100% появлению опухолей ГЦК через 30 недель (Shiota G. et al., 1999).
В модели ГЦК с использованием ДЭНА возможно одновременное введение промотирующих агентов, например, фенобарбитала, усиливающего канцерогенный эффект ДЭНА за счет увеличения экспрессии цитохрома Р450 (Waxman D.J., Azaroff L., 1992).
Наличие широкого спектра экспериментальных моделей ГЦК на мышах дает возможность оценивать взаимодействие опухоли с организмом в целом или с печеночным микроокружением, проводить скрининг лекарств, имитировать сложный многоступенчатый процесс злокачественной трансформации гепатоцитов. При выборе модели ГЦК для исследований необходимо ознакомиться с ограничениями и преимуществами описанных в научной литературе моделей. ДЭНА является одним из факторов риска возникновения ГЦК у человека, поскольку содержится во многих продуктах питания. Мышиная модель ГЦК, вызванная этим канцерогеном, имеет достаточно много сходства с ГЦК у человека, что дает возможность для моделирования данного заболевания, а полученные результаты исследования могут интерпретироваться на ГЦК человека.
Экспрессии мРНК генов Igfbp1 – Igfbp-7 в динамике развития гепатоцеллюлярной карциномы мыши
Транспортировку лиганда Igf-1 к рецептору Igf-1R обеспечивают Igf-связывающие белки, циркулирующие в крови.
Методом ПЦР в реальном времени были получены и в дальнейшем проанализированы данные по экспрессии мРНК генов, кодирующих Igf-связывающие белки, Igfbp-1 – Igfbp-7 через 4, 6, 8 и 12 месяцев после инъекции ДЭНА. На более ранних стадиях развития ГЦК – 4 и 6 месяцев после инъекции ДЭНА – в экспериментальных образцах дисплазии печени и узелковых образованиях не выявлено достоверных отличий в экспрессии исследуемых генов относительно нормальной печени (Рис. 6).
Через 8 месяцев уровень экспрессии печеночной мРНК генов Igfbp-1, Igfbp-2, Igfbp-4, Igfbp-6 в опухоли, а также Igfbp-2 в окружающей ткани был выше (p 0.05), чем в нормальной ткани печени. Уровень экспрессии мРНК Igfbp-3, Igfbp-5 и Igfbp-7 не отличался от уровня контроля и в опухолевой, и в окружающей ткани. При этом повышенный уровень экспрессии в опухоли по сравнению с окружающей тканью наблюдался для генов Igfbp-1 (p 0.05), Igfbp-4 (p 0.1) и Igfbp-6 (p 0.05) (Рис. 7).
Через 12 месяцев после инъекции ДЭНА изменения в экспрессии мРНК генов, кодирующих Igf-связывающие белки, становятся более выраженными (Рис. 8). При сравнении экспериментальных образцов и здоровой печени было выявлено повышение уровня экспрессии мРНК Igfbp-1 и Igfbp3 (p 0.05) в опухоли, Igfbp-1, Igfbp-5, Igfbp-6, Igfbp-7 (p 0.05) в окружающей ткани, а также значительное понижение уровня экспрессии генов Igfbp-2, Igfbp-4 (p 0.05) в опухоли по сравнению с контролем. При сравнении опухолевой и окружающей ткани были выявлены пониженные в опухолевой ткани уровни экспрессии мРНК почти всех Igfbps (p 0.05), за исключением Igfbp-1 и Igfbp-3 (p 0.1 и p 0,05 соответственно).
Таким образом, анализ паттерна экспрессии генов-участников сигнального пути Igf-1 показал повышение уровня экспрессии Igf-1R на стадии гепатоцеллюлярной карциномы по сравнению с его экспрессией на стадии аденомы в опухолевой и окружающей ткани печени. Уровни экспрессии Igfbp-1 – Igfbp-7 изменяются на стадиях аденомы и карциномы, что указывает на вовлеченность белков, кодируемых данными генами, в процесс развития ГЦК.
Паттерн экспрессии мРНК генов Igfbp1 – Igfbp-7 в динамике развития гепатоцеллюлярной карциномы мыши
Транспортировку лигандов Igf-1 и Igf-2 к рецепторам обеспечивают Igf связывающие белки, циркулирующие в крови. Белки Igfbps могут изменять активность Igf-1 и Igf-2, обеспечивая регуляцию пролиферации и дифференцировки раковых клеток (Karna E. et al., 2002). Необходимо заметить, что в исследуемой модели не было обнаружено экспрессии гена Igf-2 в ткани печени экспериментальных мышей.
По описанным в литературе данным считается, что большинство Igfbps деактивируют Igf-1 (Igfbp-1,-3,-4,-6,-7), причем наиболее мощными ингибиторами являются белки Igfbp-1 и Igfbp-3. В то время как Igfbp-2 и Igfbp-5 чаще всего активируют Igf-1, способствуя его связыванию с рецептором Igf-1R. Однако функциональность Igfbps может изменяться при определенных условиях. Кроме того, некоторые Igfbps могут функционировать Igf-1-независимо (Rosenfeild R.G. et al., 1999; Cunming D., Quikin X., 2005; Frommer K.W. et al., 2006; Tripathi G. et al., 2009; Bach L.A., 2015).
Мы показали, что уровень экспрессии Igfbp-1 повышается в опухолевой ткани в аденомы, а также в опухолевой и окружающей ткани карциномы. На клиническом материале показан повышенный уровень IGFBP-1 в сыворотке крови (Rutanen E.M., 1994), а также повышенный уровень IGFBP-1 в около опухолевой ткани у больных ГЦК (Gong Y. et al., 2000). Повышение экспрессии Igfbp-1 может ассоциироваться с гипоксией, возникающей внутри опухоли, а также на границе опухоли и ее микроокружения (Wu X.Z. et al., 2000). Белок Igfbp-1, секретируемый гепатоцитами, необходим для нормальной регенерации печени, является фактором выживания клеток за счет снижения уровня проапоптотических сигналов, а также может ингибировать митозы путем удаления Igf-1 из внеклеточной среды (Leu J.I. et al., 2003). Считается, что во взрослом организме Igfbp-1 защищает от гипогликемии (Collet-Solberg P.F., Cohen P., 2000). С одной стороны, полученные нами данные несомненно указывают на вовлечение Igfbp-1 в процесс канцерогенеза, что позволяет использовать Igfbp-1 в качестве тканевого маркера ГЦК. С другой стороны, увеличение Igfbp-1 в крови также наблюдается при дефиците питательных веществ и/или при гиперинсулинемии (Lewitt M.S. et al., 1991; Crossey P.A. et al., 2000), поэтому такое повышение нельзя считать специфичным для ГЦК.
Белок IGFBP-2 может стать одним из маркеров канцерогенеза. Показано, что у пациентов с ГЦК в сыворотке крови повышается уровень IGFBP-2 наряду с маркером альфафетопротеином (Ranke M.B. et al., 2003). Белок IGFBP-2 может не только способствовать активации IGFs, но и способен транслоцироваться в ядро IGF-независимым путем для активации фактора роста сосудов (VEGF) и последующего ангиогенеза (Azar W.J. et al., 2014). Экспрессия гена IGFBP-2 имеет функциональное значение для пролиферации, клеточной адгезии, миграции клеток и апоптоза как Igf-зависимо, так и Igf-независимо (Frommer K.W. et al., 2006).
В нашей модели экспрессия мРНК Igfbp-2 повышается в опухолевой ткани и имеет тенденцию к повышению в окружающей ткани на стадии аденомы. Напротив, на более злокачественной стадии карциномы экспрессия Igfbp-2 понижена в опухолевой ткани относительно нормальной печени и окружающей опухоль ткани. Корреляция между высоким уровнем экспрессии IGFBP-2 в опухолях и плохим прогнозом заболевания показана во многих типах рака человека (Mehrian-Shai R. et al., 2007; Ben-Shmuel A. et al., 2013; Baxter R., 2014).
Несмотря на большое разнообразие Igf-связывающих белков, более 80% инсулиноподобных факторов роста связываются белком Igfbp-3. В данной работе мы показали, что уровень экспрессии мРНК гена Igfbp-3 достоверно повышается в опухолевой ткани карциномы лишь на поздней стадии ГЦК. Белок Igfbp-3 может подавлять сигнал роста, инициировать апоптоз, как Igf-зависимо, так и Igf-независимо (Shi-MinLuo et al., 2005; Gong Y. et al., 2000). Напротив, Igfbp-3 может участвовать в выживании клеток, восстановлении двухцепочечных разрывов ДНК (Buckbinder L. et al., 1995). При канцерогенезе не выявлено мутаций в гене Igfbp-3 (Hanafusa T. et al., 2002), поэтому необходимо исследовать его в качестве возможной цели для таргетной терапии ГЦК. Кроме того, Igfbp-3 имеет свой Igf-независимый рецептор на поверхности клеток (Shi-Min Luo et al., 2005; Gong Y. et al., 2000). На клиническом материале показано, что низкий уровень белка IGFBP-3 ассоциирован с низкой общей выживаемостью пациентов с ГЦК (Yan J. et al., 2017). Гиперэкспрессия или внутриопухолевая инъекция Igfbp-3 ингибирует канцерогенез, как было показано на животных моделях (Oh S.H. et al., 2012). В то же время есть работы, в которых глобальная делеция Igfbp-3 ингибирует прогрессирование рака (Mehta H.H. et al., 2011). Таким образом, циркулирующий Igfbp-3 по литературным данным показывает противоположные эффекты и определить точную функцию Igfbp-3 и его гена в используемой модели проблематично.
Белок IGFBP-4 ингибирует развитие и прогрессирование опухоли путем изолирования IGF-1 (Durai R. et al., 2006). Некоторые исследования показывают, что IGFBP-4 может подавлять гибель клеток (Severino V. et al., 2003) и стимулировать миграцию клеток (Bartling B. et al., 2010) Igf-независимо. Кроме того, IGFBP-4 обладает анти-ангиогенными и анти-опухолевыми функциями.
В исследуемой нами модели ГЦК, уровень экспрессии Igfbp-4 показал тенденцию к повышению в тканях аденомы и понижение в опухолях карциномы по сравнению с окружающей тканью и контролем. На поздней стадии ГЦК сильно нарушена функциональность гепатоцитов, которые не способны защитить пораженные участки печени от повышенного ангиогенеза, который необходим васкуляризированным опухолям. На клинических образцах опухоли ГЦК человека показан пониженный уровень экспрессии IGFBP-4 (Gong Y. et al., 2000), однако прогностическая роль IGFBP-4 пока не выявлена.
Экспрессия мРНК гена Igfbp-5 достоверно повышается в опухолевой и окружающей ткани только на стадии карциномы. Функции Igfbp-5 в физиологических и патологических процессах не ясны. Одни исследования указывают, что гиперэспрессия IGFBP-5 имеет антипролиферативный и проапоптотический эффект (Butt A. et al., 2003). Напротив, в других работах показано, что ингибирование IGFBP-5 оказывает антипролиферативное действие (Umemura A. et al., 2008). Белок Igfbp-5 может выступать в качестве самостоятельного транскрипционного фактора при взаимодействии с Igf-независимыми рецепторами на мембране клетки и белками-переносчиками интегринами в цитоплазме клетки (Tripathi G. et al., 2009; Veraldi K.L., Feghali-Bostwick C.A., 2012).
Уровень экспрессии Igfbp-6 на стадии 8 месяцев показывает картину схожую по динамике с Igfbp-4: его экспрессия достоверно повышена в опухоли по сравнению с контролем и окружающей тканью. Однако на стадии 12 месяцев экспрессия Igfbp-6 повышена лишь в окружающей ткани по сравнению с опухолевой и нормальной тканью печени, в которых Igfbp-6 находится на одном уровне. По литературным данным, Igfbp-6 участвует в процессах ингибирования пролиферации и метастазировании (Gong Y. et al., 2000). Однако на используемой модели ГЦК не было обнаружено метастаз в другие органы у мышей всех экспериментальных групп. Igfbp-6 преимущественно связывает Igf-2, селективно ингибируя его действие, включая пролиферацию, выживание, дифференцировку широко круга клеток. В нашей модели мРНК Igf-2 не детектировалась на всех исследуемых стадиях развития ГЦК. Мы предполагаем, что повышение в окружающей ткани экспрессии Igfbp-6 может объясняться паракринными и аутокринными эффектами окружающей ткани по ингибированию пролиферации раковых клеток опухоли или не раковых клеток микроокружения. Кроме того, недавно было показано, что Igfbp-6 имеет ряд Igf-независимых действий, включая апоптоз и ингибирование ангиогенеза (Bach L.A., 2015).
Поздние стадии опухолеобразования при ГЦК сопровождаются не только обильной васкуляризацией, но и сильным давлением опухоли на микроокружение (Yang Y.D. et al., 2011). Поэтому локальные факторы, такие как Igfbp-7, который активирует синтез простациклина, отвечающего за предотвращение образования тромбов, необходимы для обеспечения жизнедеятельности опухоли. Мы показали, что уровень экспрессии Igfbp-7 достоверно повышался только в окружающей опухоль ткани на 12-й месяц после инъекции ДЭНА, что, возможно, позволяет улучшить кровоток в поврежденных тканях печени.
Таким образом, анализ паттерна экспрессии генов-участников сигнального пути Igf-1 показал повышение уровня экспрессии Igf-1R на стадии гепатоцеллюлярной карциномы по сравнению с его экспрессией на стадии аденомы в опухолевой и окружающей ткани печени.
Уровни экспрессии Igfbp-1 – Igfbp-7 изменяются на стадиях аденомы и карциномы, что указывает на вовлеченность белков, кодируемых данными генами, в процесс развития ГЦК. Повышение в окружающей ткани уровня экспрессии генов Igfbp-1, Igfbp-5, Igfbp-6 и Igfbp-7 наблюдается только на стадии карциномы. Это может указывать на паракринное влияние микроокружения на рост опухоли.
Смена клеточного фенотипа первичных культур ГЦК под воздействием TGF- и IL-6
Методом ПЦР в реальном времени показано, что лишь 4 первичные культуры ГЦК из 11 экспрессируют мРНК гена Tgf-1, при этом экспрессия рецептора Tgf-1R не нарушена во всех 11 исследуемых культурах ГЦК. Это может свидетельствовать о том, что раковые клетки в основном получают белок-лиганд TGF- из микроокружения, а не синтезируют его сами.
В агрессивных опухолях показана высокая экспрессия TGF-, которая коррелирует со способностью к активной миграции. Однако в исследуемых культурах ГЦК активная миграция не наблюдалась.
Были выбраны четыре культуры ГЦК, имеющие изначально разный фенотип, выявленный по соотношению кадгеринов, а также характеризующиеся повышенной экспрессией Has2, CD44, Vimentin, что свидетельствует о большой степени злокачественности выбранных клонов. Среди выбранных культур ГЦК 4.2sc, 4.2, 4.4, 4.6 повышенная экспрессия Tgf-1 показана только в культуре 4.2sc, при этом рецептор Tgf-1R экспрессируется во всех 4х культурах, но в большей степени в культуре 4.2sc.
С использованием флуоресцентной микроскопии было показано, что без экзогенного воздействия раковые клетки могут образовывать конгломераты, активной миграции клеток при этом не наблюдается. Однако под воздействием TGF- клетки становятся более вытянутыми и обладают фибробластоподобной морфологией. Методом ПЦР в реальном времени показано, что воздействие TGF- приводит к повышению уровня экспрессии TGF-1 и TGF-1R, но не во всех 4-х культурах ГЦК. Возможно, первичные культуры ГЦК по-разному отвечают на экзогенное воздействие.
Анализ экспрессии мРНК генов Е- и N-кадгеринов после культивирования с TGF- показал сдвиг клеточного фенотипа в сторону мезенхимного всех 4-х культур ГЦК вне зависимости от их изначального соотношения кадгеринов.
Изменение фенотипа клеток и запуск ЭМП под воздействием TGF- показан во многих экспериментах (Kokudo T. et al., 2008). При воспалении, имеющем место в процессе канцерогенеза, в ткани активируются свободные макрофаги, которые способствуют высвобождению активного TGF- из ВКМ (Katz L. et al., 2013), что усугубляет процесс ЭМП.
Поэтому был проведен эксперимент с экзогенным воздействием на раковые клетки ГЦК индуктором воспалительного процесса – IL-6. Воздействие IL-6 не показал смену фенотипа клеток. Однако при одновременном добавлении IL-6 и TGF- эффект эпителио-мезенхимного перехода усиливался (Рис. 23-24).