Введение к работе
Актуальность проблемы. Развитие молекулярной генетики одело возможным конструирование специальных нуклеотидных последо-тельностей, состоящих из функционально завершенных блоков, лючающих сигналы управления транскрипцией и собственно гены и их кДЖ-когши (Щелкунов.1987). Использование техники реком-нации фрагментов ДНК позволило создать конструкции, обладающие особностью встраиваться в геном организмов любых систематичес-х групп и там нормально экспрессироваться (Горман. 1988). Тем мым была открыта возможность клонировать отдельные гены и ис-льзовать их для генетической трансформации про- или эукариоти-зких клеток, а также многоклеточных организмов (Jaenlsch, 38). В настоящее время их принято называть генетически модифи-рованными организмами (ГМО).
Новая область естествознания, получившая название генети-зкой инженерии, привлекла к себе внимание биологов не только тому, что с ее помощью стало возможно получать животных с та-т признаками, которых ранее у них не было, но и в силу того, з инсерция трансгена в хромосомную ДНК представляет собой вве-гае в геном информации, написанной на том языке, который гено-понятен. и следовательно, ответ на интеграцию новых фрагмен-з ДНК будет с его стороны адекватен. Надо полагать, изучение жцнй генома, особенно в плане его онтогенетического раскры-ї, получит значительный толчок благодаря развитию генной инже-зии.
Начало эпохи трансгенных животных может быть датировано
12 г. Именно тогда Пальмитер и Бринстер опубликовали первые
зультаты по введению с помощью микроинъекций гена гормона рос-
человека в пронуклеус и цитоплазму зигот мыши (Palmiter.
.nster. 1982)
Уже через 2-3 года практически одновременно в разных іанах внимание исследователей было обращено к рыбам (Maclean, iwer, 1984; Rokkones. et al.,1985; Chourrout, et al..1986). эбенности биологии развития - большое число созревающих прак-їески одновременно яйцеклеток, наружное оплодотворение, отно-:ельной короткий период эмбрионального развития, проходящего шостью в контролируемых и доступных для наблюдения условиях, ібнчайно широкие возможности по клонированию, получению гете-шоидных жизнеспособных потомков, пол которых можно переопре-
- 2 -делять гормональными воздействиями, а также высокая хозяйственная значимость и доступность,- сделали рыб самым перспективным объектом генетической инженерии и прекрасной моделью для биотехнологии, сельского хозяйства и медицины (Lewis, 1988; Maclean, 1989).
Генетическая модификация высших эукариотических организмов, за исключением некоторых специальных случаев, выполняется на стадии зрелого оплодотворенного яйца. Поэтому весь эмбриогенез протекает под влиянием трансгена, который в этот период может пребывать в разных состояниях: эписомном. ассоциированном и интегрированном. Понятно, что как его присутствие, так и возможная экспрессия могут влиять на ход нормального развития. Кроме того, сами генноинженерные манипуляции часто являются причиной появления уродств и аномалий развития, нередко приводящих к летальному исходу (Мерфи, Хэнсон. 1989; Capecchi et al.,1989; Chen, Powers,1990). Нормальное эмбриональное развитие рыб исследовано достаточно полно (Игнатьева Т. И.,1975,1985.; Павлов Д.А., 1990, Малюкина А. П. и мн.др.). Данные же о влиянии на него процессов генетической трансформации появились лишь в последнее время.
Цель и задачи исследования. Ііель настоящей работы состояла в том. чтобы получить трансгенных карпов путем микроинъекций растворов рекомбинантной ДНК. исследовать применимость метода импрегнации спермиев этими же растворами с последующим использованием их в качестве носителей ("живых" векторов) чужеродной ДНК при оплодотворении интактных яйцеклеток, а также определить влияние этих методов генетической модификации на общие параметры эмбрионального развития карпа. Кроме того, в лабораторных условиях предстояло более полно исследовать эмбриональное развитие данио (Danlo rerlo) и модернизировать методику использования его яйцеклеток для микроинъекодй, что объясняется большой значимостью этого вида аквариумных рыб в проведении модельных экспериментов. Достижение указанной цели связывалось с решением следующих задач:
1. Исследовать корреляцию между ядерным и клеточным циклами в раннем эмбриогенезе данио и карпа, уточнить значения т0 для развития в температурном оптимуме, выполнить сравнительный анализ продолжительности клеточных циклов у контрольных и трансформированных эмбрионов.
-
Изучить характер и динамику связывания ДНК со спермиями карпа в зависимости от экспозиции, в присутствии ДМСО и некоторых полиэлектролитов.
-
Разработать среду для культивирования эмбрионов данио, ферментативно или хирургически лишенных внешних яйцевых оболочек, и выполнить с использованием этой среды микроинъекции.
-
Провести эксперименты по микроинъекяионному введению растворов ДНК (рекомбинанткые зекторы интеграции, несущие гены гормона роста - быка и белого толстолобика) в бластодиск оплодотворенных яйцеклеток карпа.
-
Выполнить эксперименты по оплодотворению яйцеклеток карпа спермой, импрегнированной ДКК, и исследовать эффективность ее переноса по экспрессии гена р-галактозидазы.
-
Получить образцы тканей презумптивно трансгенных особеГ карпа и провести их исследование с помощью PCR и блот-г:*??идкзо--ции по Саузерну.
-
Классифицировать аномалии развития и уродства у трансгенных эмбрионов карпа.
Решение этих задач дает новый материал для создания аналитических основ в изучении генетически модифицированных организмов, расширяет методическую базу исследований, позволяет более полно и точно охарактеризовать процессы, происходящие в ранний период развития трансгенных рыб, новых, по сути, биологических существ, созданных в лабораторных условиях.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на семинарах~кафедры эмбриологии, представлены на Y Международном Симпозиуме по генетике в аквакультуре (июнь 1994, Галифакс, Канада), I Международном Симпозиуме по полноцикличному рыбоводству (август 1994, Осло, Норвегия), Всероссийской конференции "Новые направления в биотехнологии" (май 1994, Нущино-на-Оке, Россия), Всероссийского съезда Вавиловского Общества генетиков и селекционеров (декабрь 1994. Саратов. Россия) и в статье (Онтогенез, том 26, N2, в печати).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, объектов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения и выводов. Завершается диссертация сшскок использованной литературы. Работа изложена на 110 страницах, включает в себя 12 таблиц, 19 рисунков. В библиографическое описание включено 125"названий.