Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Структурно-функциональные и метаболические изменения печени и поджелудочной железы при введении химических агентов 11
1.1. Структурно-функциональные и метаболические изменения в печени при введении химических агентов 12
1.2. Структурно-функциональные и метаболические изменения в поджелудочной железе при введении химических агентов 21
Глава 2. Материал и методы исследования 23
2.1. Синтез модифицированной формы препарата 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентана 23
2.2. Объект исследования 24
2.3. Методы исследования 26
2.4. Статистические методы анализа 29
Глава 3. Морфометрический и биохимический анализ после внутрибрюшинного введения 1,5-бис (3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентан диацетатомеди 30
3.1. Результаты биохимического исследования 30
3.2. Результаты массометрического исследования 39
Глава 4. Структурные изменения печени и поджелу дочной железы после внутрибрюшинного введения 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил) 3-оксапентандиацетатомеди 42
4.1. Гистологические изменения печени после внутрибрюшинного введения 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентан-диацетатомеди 42
4.2. Количественная оценка клеточных популяций печени в динамике эксперимента 50
4.3. Гистологические изменения поджелудочной железы после внутрибрюшинного введения 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди з
4.4. Количественный анализ панкреацитов в динамике эксперимента 56
4.5. Гистохимические изменения печени после внутрибрюшинного введения 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди 59
4.6. Гистохимические изменения поджелудочной железы после внутрибрюшинного введения 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди 64
4.7. Иммуногистохимическое выявление Bcl-2 в печени после внутрибрюшинного введения 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди 67
4.8. Иммуногистохимическое выявление Bcl-2 в поджелудочной железе после внутрибрюшинного введения 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди 72
Глава 5. Обсуждение результатов исследования 75
Выводы 89
Список используемых сокращений 91
Список литературы
- Структурно-функциональные и метаболические изменения в поджелудочной железе при введении химических агентов
- Статистические методы анализа
- Результаты массометрического исследования
- Гистологические изменения поджелудочной железы после внутрибрюшинного введения 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди
Введение к работе
Актуальность темы. По данным Всемирной организации здравоохранения, хронические диабетические поражения являются главной причиной инвалидности и смертности больных сахарным диабетом (Гурьева И.В., 2007; Мамедов М. Н., 2010; Боженко В.К. и др., 2011). Сахарный диабет, как правило, сопровождается осложнениями – болезнями сердца, почек, повреждениями нервной системы (Claire M.S., 2001; Richard I.G., 2010).
Обменные нарушения при сахарном диабете приводят к дискоординации деятельности всех органов и систем организма, включая один из наиболее функционально значимых сегментов эндокринной системы «гипоталамо-гипофизарно-тиреоидную ось» (Мариотти С., 2003).
Имеющиеся литературные данные свидетельствуют об использовании в лечении сахарного диабета разнообразных пероральных гипогликемических средств (Dulin W.E., 1963; Gerritsen G.C., Dulin W.E., 1965). При этом по-прежнему продолжается поиск высокоэффективных антидиабетических средств среди химических веществ и продуктов растительного происхождения (Williams R.H. et al., 1957; Goldner M.G., 1958).
Известно, что экзогенные химические вещества, попадающие в организм, вызывают токсичные и стрессовые реакции, ряд изменений в структурно-метаболических процессах, а также приводят к поражениям многих внутренних органов и изменениям в крови (Семе-нюк А.В., 1996; Байматов В.Н., 2000; Bend J.R. et al., 1985; Spencer P.S. et al., 1985; Krishna C.R., 1989; DeVito M.J. et al., 1995). Чужеродные химические вещества влияют на структуру печени, вызывают гемодинамические расстройства, внутрисосудистую или внутриклеточную активацию свободно-радикальных процессов и некротические изменения паренхимы печени (Мильто И.В., Суходоло И.В., 2002; Toyokuni S., Sagripanti J.L., 1994; Cisternas F.A. et al., 2005).
Поиск высокоэффективных терапевтических лекарственных средств для профилактики и лечения сахарного диабета в настоящее время является одной из приоритетных задач современной медицины (Дедов И.И., 2007).
Степень разработанности темы исследования. Известно, что производные пиразола проявляют разнообразные фармакологические свойства (Крохина Н.Ф., 1968; Козаченко А.И. и др., 1982; Богословская С.И., 1986; Калинкина М.А., 2001). Так, в частности, им свойственна антиоксидантная, антивирусная активность, антидепрессивный эффект, противовоспалительные, иммуномодулирующие свойства, действие на иммунный ответ на вирусный антиген, а также противоопухолевый эффект, реализуемый за счет ингиби-рования ферментов, которые играют важную роль в делении клеток (Гриценко Л.H., 1990; Евстропов А.Н. и др., 1998; Мелетова О.К., 2007).
Известно, в частности, что 3,5-диметилпиразол (U-6245) достоверно снижает уровень глюкозы в крови и активно используется в лечении сахарного диабета (Dulin W.E.; Gerritsen G.C., 1963; George C.G., 1965). Следует добавить, что данное средство обнаруживает еще и антилиполитические свойства, которые проявляются в его способности подавлять липолиз (Bergamini E. et al., 1987; Cavallini G. et al., 2007; Donatia A. et al., 2008; Straniero S. et al., 2009). Механизм гипогликемического эффекта 3,5-диметилпиразола отличается от механизма действия инсулина (Donatia A. et al., 2008; et al., 2014). При этом есть эффекты 3,5-диметилпиразола, аналогичные таковым для инсулина – в частности, они оба увеличивают окисление глюкозы, уменьшают содержание в плазме крови свободных жирных кислот и сахара у здоровых крыс (Donatia A. et al., 2008, 2013). При этом 3,5-диме-тилпиразол, в отличие от инсулина, эффективно снижает содержание сахара в крови экспериментальных крыс, у которых наблюдается резистентность к инсулину (Schein P.S. et al., 1971; Jacobsson B. et al., 1972; Claire M.S. et al., 2001).
По данным ряда исследователей, в эксперименте на животных 3,5-диметилпиразол увеличивает окисление глюкозы, снижает плазменное содержание жирных кислот и сахара в крови в интервале времени от 15 мин до 3 ч после его введения здоровым крысам (Судовцев В.Е., 1992; Locci C.T. et al., 1985; et al., 2002).
Учитывая, что комплексы меди(II) с производными пиразола проявляют биологическую активность как регуляторы активных форм кислорода и миметики супероксиддисму-тазы (СОД-миметики) (Potapov A.S. et al., 2009), целесообразно было изучить влияние некоторых из этих комплексов на состояние органов экспериментальных животных. Для исследований был выбран наиболее синтетически доступный представитель пиразолсодержащих комплексов меди(II) – 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди.
Цель исследования – изучить характер и выраженность морфофункциональных изменений печени и поджелудочной железы крыс при многократном воздействии 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди.
Задачи исследования:
-
Оценить эффект воздействия 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентан-диацетатомеди на общее состояние организма крыс в зависимости от кратности и продолжительности времени введения химического агента.
-
Изучить характер и выраженность структурных изменений печени и поджелудочной железы крыс при многократном внутрибрюшинном введении 1,5-бис(3,5-диметил-пиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди.
-
Исследовать гистохимические показатели в тканях печени и поджелудочной железе крыс при многократном внутрибрюшинном введении 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди.
-
Изучить динамику количественных изменений Bcl-2-позитивных гепатоцитов при многократном внутрибрюшинном введении 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-окса-пентандиацетатомеди.
-
Оценить общее состояние печени и поджелудочной железы крыс с учетом всех анализируемых показателей (морфометрических, биохимических, гистологических, гистохимических и иммуногистохимических).
Научная новизна. Впервые проведено комплексное морфологическое исследование печени и поджелудочной железы после многократного введения крысам 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди. Установлено, что данный химический агент характеризуется умеренным токсическим эффектом (снижение массы тела на 6 – 11% и печени на 11 – 14%, повышение уровня аланинаминотрансферазы и аспартатамино-трансферазы, снижение уровня альбумина в сыворотке крови) и выраженными гипогли-кемическими (снижение уровня глюкозы в сыворотке крови и увеличение количества гликогена в печени) и антилиполитическими (снижение уровня свободных жирных кислот в крови) свойствами.
Впервые показано, что многократное введение крысам 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди в течение 6 нед обусловливает развитие дистрофических и некробиотических изменений гепатоцитов, выраженность которых нарастает по мере увеличения продолжительности воздействия. При этом количество двуядерных гепа-тоцитов прогрессивно снижается на протяжении эксперимента, что свидетельствует о снижении регенераторных реакций печени.
Впервые установлено, что многократное введение крысам 1,5-бис(3,5-диметил-пиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди в течение 6 нед вызывает дистрофические и некробиотические изменения ацинарных клеток и клеток островков Лангерганса поджелудочной железы. При этом количество двуядерных ацинарных клеток возрастает ко 2-й неделе, а затем снижается до контрольного уровня, что свидетельствует о сохранении регенераторного потенциала поджелудочной железы.
По данным иммуногистохимического исследования, многократное введение крысам 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди вызывает экспрессию Bcl-2 в гепатоцитах, интенсивность которой возрастает по мере увеличения продолжительности воздействия химического агента (объемная плотность Bcl-2-позитивных гепатоцитов возрастает к концу эксперимента в 6 раз), что свидетельствует об активации антиапоптотиче-ских реакций. Многократное введение крысам 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-4
оксапентандиацетатомеди вызывает экспрессию Bcl-2 во всех ацинарных и островковых клетках поджелудочной железы. При этом интенсивность реакции в ходе эксперимента меняется незначительно.
Впервые установлено, что многократное введение крысам в течение 6 нед 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентанди-ацетатомеди оказывает цитотоксическое воздействие на паренхиматозные клетки, при этом не подавляет регенераторные процессы и цитопротекторные реакции.
Методология и методы исследования. Методологически работа построена на принципах системного анализа комплекса данных, включавших результаты биохимического анализа крови, гистологического, гистохимического и иммуногистохимического исследования образцов печени и поджелудочной железы, полученных от 91 самца белых крыс после применения 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди. В работе использованы современные гистологические, гистохимические, иммуногистохи-мические, морфометрические и биохимические методы исследования, применены адекватные методы статистического анализа.
Теоретическое и практическое значение работы заключается в том, что получены новые знания о структурных реакциях печени и поджелудочной железы после воздействия на организм 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди.
Полученные данные могут быть использованы для разработки новых лекарственных средств на основе 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди, но после дальнейших химических модификаций химического соединения.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди оказывает гипо-гликемический, антилиполитический и токсический эффекты, которые проявляются и сохраняются только при многократном применении у экспериментальных животных.
-
1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди при его многократном применении вызывает выраженные структурные изменения печени и поджелудочной железы крыс.
-
При многократном введении 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентан-диацетатомеди в печени снижается регенераторный потенциал гепатоцитов.
Степень достоверности результатов диссертации. Все использованные методические приемы и способы статистической обработки соответствуют поставленным цели и задачам, позволяют получить достоверные и доступные анализу результаты. Диссертация выполнена на достаточном экспериментальном материале с использованием сертифицированного оборудования, современных высокоинформативных методов морфофункцио-нального исследования и анализа результатов. Сформулированные научные положения и выводы основаны на результатах собственных исследований, не носят характера умозрительных заключений и вытекают из результатов работы.
Апробация исследования. Материалы проведенного исследования доложены и обсуждены на V Международной научно-практической конференции для иностранных студентов и аспирантов «Иностранный студент в профессионально-образовательном пространстве технического вуза» (Барнаул, 2014), Международной конференции по математическому моделированию в физических науках (IC-MSQUARE) (Испания, 2014), 2-й Международной конференции «Новые горизонты в области фундаментальных и прикладных наук» (ICNHBAS) (Арабская Республика Египет, 2015); расширенном заседании кафедры зоологии и физиологии биологического факультета ВГБУ ВО «Алтайский государственный университет» Минобрнауки РФ и кафедры химической технологии ФГБОУ ВО «Алтайский государственный технический университет им. И.И.Ползунова» Минобрнау-ки РФ (Барнаул, 2016).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 2 статьи опубликованы в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК Минобрнауки России для публикаций основных результатов исследования.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материала и методов исследования, глав с изложением результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка сокращений и списка цитируемой литературы, который содержит 328 источников, из них 78 на русском языке и 250 источников иностранных авторов. Работа изложена на 121 страницах компьютерного текста, содержит 18 таблиц и иллюстрирована 55 рисунками.
Личный вклад автора. Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.
Структурно-функциональные и метаболические изменения в поджелудочной железе при введении химических агентов
С каждым новым десятилетием в мире отмечается неуклонный рост и большая распространенность заболеваний печени (Кизюкевич Л.С., 2009). Болезни печени прогрессируют параллельно с ожирением и диабетом (Burkitt M.J. et al., 1998; Erl W. et al., 2000; Cai D. et al., 2005; Jason J. et al., 2013).
Функциональное состояние структуры гепатоцитов при стрессорных воздействиях представляет несомненный интерес, поскольку реакция печени на стресс-факторы определяет во многом и общую реакцию организма (Подымова С.Д., 1999; Байматов В.Н., 2000; Мильто И.В., Суходоло И.В., 2012; Rao M.S. et al., 1988), особенно учитывая роль печени в энергетическом обмене (Бондарева В.М., 1970; Houslay M.D., 1986; Jungermann К., Katz N., 1986; Jungermann K., Kietzmann T., 1997; Riggio O. et al., 1997; Kruszynska Y.T., 1999), синтезе ряда важнейших соединений (Подымова С.Д., 1999;
Decker K., 2003), процессах детоксикации, преобразованиях гормонов и ферментов (Locci C.T., Bergamini E., 1982; Aida K., Negishi M., 1991).
Внутрибрюшинное введение мышам пиразола (в дозе 150 мг/кг, ежедневно в течение 2 дней), приводит к повреждению и патологическим изменениям в печени и к некрозу (Tu, Y.Y. et al., 1981; Lu Y., Cederbaum A.I., 2006), вызывает заметное увеличение числа мутаций и активности ферментов печени (Судовцев В.Е., 1992; Ritva P.E. et al., 1983). Активность ферментов углеводного обмена в гепатоцитах зависит от локализации клеток в дольках печени, а также фазы клеточного цикла, в которой они находятся (Кудрявцев Б.Н. и др., 1980; Jungermann К., Katz N., 1986; Jungermann K., Kietzmann T., 1997).
В мембранах гепатоцитов, различных по стереотипам и повреждениям, выявляются изменения в содержании фосфолипидов, гликолипидов и жирных кислот печени крыс при введении им этанола (Рахимова М.М., и др., 1987; Судовцев В.Е., 1992). Изменения в структуре и функциях биологических мембран являются важным признаком в цепи происходящих нарушений (Судовцев В.Е., 1992; Сабирова Р.А., 1994). Повреждающие вещества, как правило, действуют на саму мембрану или косвенно влияют на любой промежуточный фактор (Кусень С.И. и др., 1989). Мембраны реагируют на воздействия, происходят изменения в структурных компонентах и активности мембрано-связанных ферментов (Кусень С.И. и др., 1989; Есакова Т.В., Иванов М.В., 1994; Chen S.Y., Van der Meer B., 1994; Liang A. et al., 2008).
Структурные и функциональные изменения в мембранах митохондрий гепатоцитов и эритроцитов вызывают изменения в содержании белков при поражении поджелудочной железы (Рахимова М.М. и др., 1987; Сабирова Р.А., 1994). Так, введение 3,5-диметилпиразола крысам в эксперименте сопровождалось появлением метаболических и эндокринных эффектов (Locci C.T., Bergamini E., 1982, 1983), которые снижали в крови уровень свободных жирных кислоты (СЖК) менее чем за 7.5 мин, глюкозы и инсулина – за 15 мин, но повышали уровень глюкагона и кортикостерона в течение 15 мин (Locci C.T. et al., 1985; Bergamini E. et al., 1993, 1994; Masiello P. et al., 2002).
Введение голодным крысам антилиполитических препаратов (Acipimox /Аципимокс, 50 мг/кг веса тела) привело к уменьшению уровня свободных жирных кислот и глюкозы в крови в течение 5 – 10 мин и значительному увеличению в плазме крови глюкагона по отношению к инсулину в течение 15 мин (Donatia A. et al., 2004). Значительное увеличение глюкагона по отношению к инсулину могло быть индуцировано введением голодным крысам антилиполитических препаратов (3,5-диметилпиразол, 12 мг/кг массы тела). Эти гормональные изменения являются физиологическим ответом на быстрое снижение уровней свободных жирных кислот и глюкозы в крови (Bergamini E. et al., 1987).
Различные антилиполитические препараты проявляют очень похожее воздействие на активность ферментов, уровень глюкозы и свободных жирных кислот в крови. На восстановление требуется 8 – 10 ч после окончания действия эффектов антилиполитических веществ (Locci C.T. et al., 1985; Ber-gamini E. et al., 1987).
Аутофагические вакуоли образуются в течение нескольких минут, и их количество увеличивается до максимального значения в течение нескольких часов (Arstila A.V., Trump B.E., 1968). Введение антилиполитических веществ приводит к аутофагии и внутриклеточной деградации белков в клетках печени крыс (Marzella L., Glaumanu H., 1980; Schworer, C.M. et al., 1981; Mortimore, G.E. et al., 1983; Mortimore G.E., Poso A.R., 1984; Bergamini E. et al., 1995).
Введение 3,5-диметилпиразола вызывает увеличение экспрессии гена LC3, который связан с аутофагией (autophagy related gene) (Donatia A. et al., 2008) и формированием аутофагических вакуолей (Bergamini E. et al., 1987; Pollera M. et al., 1990; Donatia A. et al., 2006, 2008).
Внутрибрюшинная инъекция свежего раствора антилиполитического вещества 3,5-диметилпиразол индуцирует аутофагию в естественных условиях (in vivo) (Bergamini E. et al., 1987; Del Roso A. et al., 2003), аутофагические вакуоли наблюдаются в клетках печени через 60 мин, изменения в лизосо-мальных отделах – через 30 мин (Bergamini E., Gori Z., 1957; Bergamini E. et al., 1993; Cuervo A.M., Dice F., 2000; Masiello P. et al., 2002; Donatia A. et al., 2008).
Введением антилиполитических веществ подтвердили, что изменения в скорости распада белка в клетках печени в естественных условиях (in vivo) связаны с возрастом (Del Roso A. et al., 1991, 2003). У молодых самцов белых крыс 3,5-диметилпиразолом стимулировали аутофагию в печени и выброс аминокислот, а у старых самцов белых крыс наблюдали длительную временную задержку при проявлении ответной аутофагии (Del Roso A. et al., 1991; Cuervo A.M. et al., 2005). Изменения возраста для развития аутофагии вторичны к связанной со старением альтерации метаболизма глюкозы и гормонального уровня, появление которых отсрочено ограничением калорий (Del Roso A. et al., 2003; Bergamini E. et al., 2007). Введение крысам 3,5-диметилпиразола в дозе 12 мг/кг массы тела показало, что пероксисомальная активность ферментов значительно уменьшилась в течение 2 – 3 ч (Locci C.T., Bergamini E., 1983, 215). Пероксисомальная активность многих ферментов, в том числе активность не--окисления (non--oxidative), таких как уриказа (uricase) и D-аминокислотная оксидаза (D-amino acid oxidase), показали аналогичные изменения с той же самой задержкой (Locci C.T. et al., 1982, 1985). Снижение деятельности пероксисомального фермента может быть следствием повышенной деградации пероксисом за счет стимуляции процессов аутофагии в клетках печени (Locci C.T. et al., 1985; Bergamini E. et al., 1987; Bereziat J.C. et al., 1995; Cuervo A.M. et al., 2005). На электронномикроскопическом уровне многие аутофагические вакуоли, обнаруженные в клетках печени, часто содержали пероксисомальные структуры (Locci C.T., Bergamini E., 1982, 1983, 1985).
Введение антилиполитических препаратов вызывает значительное снижение -окислительного фермента в пероксисомальной активности в печени крыс (Locci C.T., Bergamini E., 1983; Locci C.T. et al., 1985). Система пе-роксисом -окисления играет важную роль в контроле метаболизма липидов (Swank R.T. et al., 1978; Locci C.T. et al., 1985; Masiello P. et al., 2002; Cuervo, A.M. et al., 2005).
Статистические методы анализа
В начале эксперимента, через 2, 4 и 6 нед после начала эксперимента определяли массу тела у контрольных и опытных животных. Использованы прецизионные лабораторные весы CUX-420H (CAS Corporation, Южная Корея), НПВ 420 г, дискретность 0,001г.
Биохимические исследования. Биохимические исследования проводили с использованием биохимического анализатора Stat Fax 1904 Plus (Awarenes Technology, USA). Забор крови у животных производили из орбитальной глазной вены через 30 мин, 1 ч 45 мин., 2 ч 30 мин, 24 ч после однократного введения; и через 2 ч после инъекции спустя 2, 4 и 6 нед после ежедневного введения контрольным и опытным животным. Собранную кровь использовали для получения сыворотки, в которой определяли содержание глюкозы, свободных жирных кислот, альбумина, АЛТ и АСТ. Образцы крови помещали на коагуляцию при 37C в инкубатор Heratherm General Protocol IGS100 (Термо Фишер Сайнтифик), центрифугировали со скоростью 174 г/мин. в течение 15 минут (центрифуга Шанхайской фабрики хирургических инструментов, Модель 9-1). Сыворотку хранили при -20C до дальнейшего анализа. Глюкоза в сыворотке крови была определена по методу Bergmeyer H.U. et al. (1974). Свободные жирные кислоты анализировались согласно методикам Bergamini E. и Segal H. L. (1987). Сывороточный альбумин был определен по методу Doumas B.T. et al. (1971). Аспартатаминотрансфераза (АСТ) и аланинаминотрансфераза (АЛТ) были определены согласно методам Gella F.J. et al. (1985) с использованием подходящих для каждого метода комплексов (BioSystems, Испания). Полученные данные выражены в международных единицах (IU/L).
Гликоген печени анализировали согласно рекомендациям Bergamini E. и Segal H.L. (1987). Образцы печени были гомогенизированы в фосфатном буфере (0.1 моль/л, pH 7.4) с использованием гомогенизатора POLYTRON (KINEMATICA, Швейцария) до получения однородной массы. Гомогенат центрифугировали и отделяли чистый продукт. Гликоген определяли колориметрическим методом с помощью Glycogen Assay Kit II (Colorimetric) (ab169558).
Гистологические исследования. Для морфологических исследований образцы печени и поджелудочной железы были немедленно взяты у декапи-тированных контрольных и опытных животных через 2 ч после инъекции спустя 2, 4 и 6 нед после ежедневного введения. Образцы фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в течение 24 ч. Далее материал обрабатывали по общепринятой методике для изготовления гистологических препаратов. После обезвоживания ткань заливали в парафин-парапласт (при 50-58oC). Заливку производили ручным способом. Срезы толщиной 5 мкм были изготовлены с использованием ротационного микротома (Leica, Модель Rm 2125, Германия). Срезы окрашивали гематоксилином Эрлиха и эозином (Lil-lie R.D., Fulmer H.M., 1976).
Морфометрические исследования проводили при увеличении в 100, 200, 400 и 1000 раз. Использовали микроскопы Микмед-6 (ЛОМО, Россия), с программой ScopePphoto 3.0 и видеокамерой Scopetek DCM310 (ScopeTek (КНР) и универсальный исследовательский микроскоп «Leica DM 4000B» с фотокамерой «Leica DFC 320» и компьютерной программой «Leica QWin3» (Германия).
Подсчет количества клеток в контрольной и опытных группах производили при увеличении в 1000 раз в 20 полях зрения для каждого животного, при этом в каждой группе отбиралось по 5 животных. Результаты для сравнения выражали дополнительно в процентах.
Гистохимические исследования. Для выявления содержания общего белка в печени и поджелудочной железы был использован бромфеноловый синий по методу Бонхега (Drury R.A., 1980; Moussa T.A. et al., 1985; 243). Препараты контрольных и опытных групп оценивали визуально, используя полуколичественный метод (интенсивная окраска ++++, умеренная +++, слабая ++ и следы окрашивания +).
Приготовление бромфенолового-синего раствора: Растворить 0.4 г хлористой ртути в 40 мл 2%-й уксусной кислоты и добавить 20 мг бромфеноло-вого синего. Технология окраски: 1. Срезы были очищены от парафина и гидратированы. 2. Срезы были окрашены бромфеноловым синим раствора в течение 2 ч. 3. Срезы были вымыты в 3 порциях 0,5% уксусной кислоты в течение 5 мин каждое. 4. Срезы были перенесены непосредственно в третичный бутиловый спирт. 5. Срезы были депарафинированы в ксилоле и помещены в DPX. Результат: Белки – темно-синяя окраска (Pearse A.G.E., 1972; Drury R.A.B., Wallington E.A., 1980; Moussa T.A. et al., 1985). Иммуногистохимическое исследование. Белок Bcl-2 выявляли в печени и поджелудочной железе иммунноферментным методом щелочной фосфатазы и антищелочной фосфатазы с использованием моноклональных антител к Bcl-2 (DAKO A/S, Глоструп, Дания) (Cordell J.L. et al., 1984). Образцы печени и поджелудочной железы контрольных и опытных животных фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и дополнительно в жидкости Боуэна, заливали парафином. Срезы депарафинировали, гидрати-ровали. Антигены восстанавливали путем нагревания срезов в микроволновой печи при 700 Вт в цитратном буфере (10 ммоль/л при pH 6.0) в течение 10 мин. После блокировки 3 мл/м H2O2 в сыворотке свиньи обрабатывали основными антителами против Bcl-2. Желто-коричневые гранулы в цитоплазме расценивались как положительное окрашивание на белок Bcl-2 (Cordell J.L. et al., 1984; Guo L. et al., 2004). Количественная оценка Bcl-2-позитивных клеток включала определение их объемной плотности в ткани. Для этого при увеличении в 400 раз проводили оценку площади, занимаемой Bcl-2-позитивными гепатоцитами (в печени) и панкреацитами (в поджелудочной железе) с помощью компьютерной программы «Leica QWin3». Затем, используя принципы стереологии (Непомнящих Л.М. и др., 1984; Weibel E.R., 1973), вычисляли объемную плотность Bcl-2-позитивных клеток по формуле: Vvbcl-2кл. = S bcl-2кл./Sтест., где S bcl-2кл. – площадь, занимаемая Bcl-2-позитивными клетками, Sтест. – тестовая площадь.
Все полученные количественные данные анализировались методами вариационной статистики. Для показателей с нормальным распределением оценивали среднее значение со средней ошибкой (М±m). Достоверность различий средних величин определяли на основании t-критерия Стьюдента (test) (Плохинский Н.А., 1970). Обработку данных проводили с применением прикладной статистической программы MS Excel 7.0 (Microsoft, USA).
Достоверными считали различия между сравниваемыми рядами с уровнем доверительной вероятности 95% и выше. Если P 0,05, то это означало, что ряды совпадают на 95% на уровне доверительной вероятности.
Результаты массометрического исследования
Контрольная группа. Строение печени контрольных крыс соответствовало таковому у всех млекопитающих. На срезах хорошо идентифицировались печеночные дольки, каждая из которых была образована плотнопри-легающими друг к другу гепатоцитами, расположенными в виде «печеночных балок». Последние располагались радиально вокруг центральной вены (рис. 17). Гепатоциты представляли собой, как правило, многогранные округлые клетки с одним или двумя сферическими ядрами и эозинофильной цитоплазмой.
Между печеночными балками располагались синусоиды, которые простирались до портальных трактов (рис. 18). Синусоиды – это нерегулярно расширенные кровеносные сосуды капиллярного типа, которые состоят из фенестрированных эндотелиальных клеток. В синусоидальной выстилке и перисинусоидально встречались клетки Купфера (тканеспецифические макрофаги), которые дифференцировались в специализированные клетки из мигрирующих в пространство Диссе моноцитов крови.
В портальных трактах различались профили вен (как, правило, полнокровные), артерий, желчных протоков, образованных эпителиальными клетками кубической формы. В адвентиции встречались единичные клетки фиб-робластоидного ряда.
Печень крыс контрольной группы. Фрагмент портального тракта. Окраска гематоксилином и эозином, 400. Через 2 нед после начала эксперимента общее строение печени сохранялось, но отмечались очаговые неравномерные расширения синусоидов (рис. 19, а). Центральные вены, вены портальных трактов и синусоиды были неравномерно полнокровны. Отмечался умеренный отек стромы портальных трактов и присутствие в них единичных клеток лимфоидного ряда (рис. 19, б). Встречались дистрофически измененные гепатоциты (клетки с разреженной цитоплазмой) и единичные клетки с признаками пикноза. Вблизи портальных трактах наблюдалась повышенная эозинофилия гепатоцитов (рис. 20). Двухъядерные клетки были единичными. Отмечалось увеличение количества и размеров клеток Купфера.
Через 4 нед развивались более выраженные структурные изменения печени – в некоторых участках отмечалось нарушение балочного строения (рис. 21). Сохранялся умеренный отек стромы портальных трактов (рис. 22), в них отмечалось формирование небольших лимфоидных фолликулов (рис. 23). Отмечались застойные явления крови в центральных и портальных венах. Усиливались дистрофические изменения гепатоцитов, которые проявлялись в «опустошении» цитоплазмы, возрастало также количество гепатоци-тов с признаками пикноза. При этом следует отметить, что такие клетки располагались группами. Снижалось количество двухъядерных клеток. В выстилке расширенных синусоидов и в пространствах Диссе регистровалось большое количество крупных клеток Купфера (рис. 24).
Через 6 нед после начала эксперимента общее строение печени, ее архитектоника сохранялись, но наблюдались более выраженные дистрофические изменения гепатоцитов, для которых было характерно «опустошение» цитоплазмы (рис. 25). Гепатоциты с такими изменения регистрировались как вблизи центральных вен, так и вблизи портальных трактов; встречались единичные гепатоциты с эозинофильной цитоплазмой. Во многих ядрах гепато-цитов наблюдались явления кариопикноза, кариорексиса и кариолизиса. Часто встречались увеличенные в размерах и многоядрышковые ядра. Снижалось количество двухъядерных клеток.
Сохранялось неравномерное полнокровие центральных и портальных вен (рис. 26). В портальных трактах наблюдалась умеренная гиперплазия хо-лангиоцитов и желчных протоков (рис. 27). В строме портальных трактов регистрировались единичные лимфоидные клетки. (а) а – неравномерные расширения синусоидов вблизи центральной вены; б – умеренный отек стромы портального тракта, присутствие единичных лимфоидных клеток. Рис. 20. Печень крыс через 2 нед от начала эксперимента. Повышенная эозинофилия гепа-тоцитов вблизи портального тракта. Окраска гематоксилином и эозином, 400.
Количественная оценка двуядерных гепатоцитов. Количество двуядер-ных клеток в популяции гепатоцитов зависит от физиологического состояния организма, а также изменяется с возрастом и под воздействием патологических факторов. Нами установлено, что многократное внутрибрюшинное введение крысам 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди вызывало через 2, 4 и 6 нед постепенное снижение количества двуядерных клеток в печени в течение исследуемого периода по сравнению с контрольной группой (на 20,4; 35,4 и 28,6%, соответственно) (табл. 16 и рис. 28), что свидетельствовало о снижении регенераторного потенциала гепатоцитов у опытных животных.
Количественная оценка клеток Купфера. Клетки Купфера являются полифункциональными клетками и относятся к системе мононуклеарных фагоцитов. Установлено, что многократное внутрибрюшинное введение крысам 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди вызывало через 2 и 4 нед повышение количества клеток Купфера в печени крыс опытных групп (соответственно на 26,8 и 14,3%), а через 6 нед этот показатель возвращался к контрольным значениям (см. табл. 16, рис. 28).
Гистологические изменения поджелудочной железы после внутрибрюшинного введения 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди
Контрольная группа. Исследование экзокринной и эндокринной частей поджелудочной железы контрольных крыс показало интенсивную положительную реакцию цитоплазмы и ядер ацинарных клеток, а также клеток островков Лангерганса, стенок протоков и кровеносных сосудов при окрашивании бромфеноловым синим (рис. 44). Следует отметить, что окрашивание было, как правило, равномерным.
Опытные группы. После многократного ежедневного введения крысам 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди наблюдалось последовательное сокращение содержания общего белка в тканях поджелудочной железы через 2, 4, 6 нед после начала эксперимента. Это связано с постепенно нарастающей степенью дистрофических и некробиотических изменений как ацинарных клеток, так и клеток островков Лангерганса (рис. 45 – 47).
Через 6 нед эксперимента отмечалось значительное уменьшение интенсивности окрашивания срезов бромфеноловым синим (см. рис. 47), что было обусловлено более выраженными деструктивными изменениями клеток. По данным визуального исследования препаратов можно отметить, что окрашивание островковых клеток начиная с 4-й недели эксперимента становилось менее интенсивным, чем ацинарных клеток.
Нами предпринята полуколичественная (балльная) оценка препаратов, окрашенных бромфеноловым синим. Сравнительная оценка интенсивности окраски препаратов контрольных и опытных групп дала следующие результаты: контрольная группа – ++++, опытная группа через 2 нед – +++, опытная группа через 4 нед – ++ и опытная группа через 6 нед –+ (по интенсивности окрашивания).
Полученные данные свидетельствуют о том, что введение крысам 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди оказывает цито-токсическое действие на все клеточных популяции поджелудочной железы, вызывает их некробиоз и некроз. Рис. 44. Поджелудочная железа контрольных крыс. Бромфеноловый синий, X400.
Контрольная группа. В печени контрольных крыс не наблюдалось экспрессии белка Bcl-2 во всех печеночных клетках. Об этом свидетельствует отсутствие окрашивания при постановке иммуногистохимической реакции (рис. 48).
Опытные группы. В печени крыс опытных групп после введения 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди наблюдались последовательные изменения количества окрашиваемого белка Bcl-2.
Через 2 нед после начала эксперимента экспрессия Bcl-2 регистрировалась в единичных гепатоцитах, рассеянных по печеночной дольке (рис. 49). При этом интенсивность окрашивания гепатоцитов была, как правило, очень высокой. Объемная плотность Bcl-2-позитивных гепатоцитов составляла 2,04±0,24% (табл. 18).
Через 4 нед после начала эксперимента в печени возрастало количество гепатоцитов, в которых регистрировалась экспрессия Bcl-2 (рис. 50). Такие гепатоциты располагались небольшими группами как вблизи центральных вен, так и вблизи портальных трактов. Объемная плотность Bcl-2-позитивных гепатоцитов возрастала в 2,7 раза (p 0,01) по сравнению со сроком 2 нед (см. табл. 18).
Через 6 нед после начала эксперимента экспрессия Bcl-2 регистрировалась уже в большинстве гепатоцитов. Объемная плотность Bcl-2-позитивных гепатоцитов возрастала в 5,9 раз (p 0,001) по сравнению со сроком 2 нед. Это указывает на нарастание экспрессии белка Bcl-2, что можно расценивать как цитопротекторную реакцию, направленную на ингибирование апоптоза в ответ на более выраженное повреждение печени (рис. 51).
Контрольная группа. В ацинарных и островковых клетках поджелудочной железы контрольных крыс не наблюдалось экспрессии белка Bcl-2, так же как и в клетках печени.
Опытные группы. Через 2 нед после начала эксперимента экспрессия Bcl-2 регистрировалась во всех ацинарных клетках поджелудочной железы (рис. 52). При этом следует отметить очень высокую интенсивность и равномерность окрашивания ацинарных клеток. Интенсивность окрашивания ост-ровковых клеток была несколько меньше.
Через 4 нед после начала эксперимента интенсивность окрашивания ацинарных клеток существенно снижалась; Bcl-2-позитивное окрашивание выявлялось преимущественно в апикальных зонах ацинарных клеток (рис. 53). Клетки в островках Лангерганса окрашивались также умеренно, но более равномерно, чем ацинарные клетки (рис. 54). При этом реакция регистрировалась также во всех клетках.
Через 6 нед после начала эксперимента экспрессия Bcl-2 регистрировалась во всех ацинарных клетках (рис. 55), при этом отмечалось очень интенсивное окрашивание преимущественно в базальных зонах клеток. Интенсивность окрашивания островковых клеток было меньше, но окрашивание было более равномерным.
Следует отметить, что во все сроки эксперимента белок Bcl-2 не выявлялся в эпителиоцитах междольковых и внутридольковых протоков поджелудочной железы. В то же время наблюдалась умеренная экспрессия Bcl-2 эндотелиоцитах капилляров и мелких сосудов.
Полученные данные позволяют считать, что в ответ на цитотоксиче-ское действие 1,5-бис(3,5-диметилпиразол-1-ил)-3-оксапентандиацетатомеди в ацинарных и островковых клетках поджелудочной железы развиваются ци-топротекторные реакции, направленные на ингибирование процесса апопто-за. Эти цитопротекторные реакции сохраняются на протяжении всего эксперимента, но имеют разную выраженность и, вероятно, носят циклический характер