Введение к работе
Актуальность проблемы. Открытие Г.А.-їілкзаровьм "Сбщебиологическсго свойства тканей отвечать на воз-никашдое с них напряжения, преимущественно напряжения растяже--ния, регенера^еп и ростом (эффект Илизарова)" (Ияизарсв Г.А., 1939) поззолило поставить и регать задачі? управления процессами роста и формообразования в кивых организмах. Широкие, возглоянос-ти метода 'Елизарова позволяют создавать напряжение растяжения з тканях в любом заданном направлении, не только удлинять, но и утолщать костные сегменты, увеличивать линейные размеры не только трубчатых, но и губчатых (позвонки), плоских накладных костей черепа, регулировать рост (И>изароя Г.А., 1991; Члизароэ Г.А. и др., 1934; Дьячков А.К. и др., J.V83; Еарабал: А.П., 1932). Комплексные исследования показали, что напряжения растяжения, создаваемые по методу Илизарова, стимулируют гензз и рост не только костной, но и параоссальных тканей удлиняемого сегмента ( ilizarov , 1933), что наряду с огромным прикладным значеьчек этого открытия создает уникальную модель для фукдементалыгых .исследований обцебкологичесхих процессов, лежащих в основе открытого Г.А.ИлиэароБым яяления.
Биомеханическими исследованиями установлено, что ."з всех мягких тканей конечности, удлиняемой по Илг.зарову, фасции передней группы мьыщ испытывают наибольпээ влияние растяжения. В период удлинения это воздействие возрастает, при зтом наблюдается равномернее растякение фасциЛ по их длине (Дьячкоза Г.В., 19с12>. Это определило выбор объекта исследования - фасций скелетных мышц удлиняемой по Ллнзарову конечности. Фасции, как пленочные соединительнотканные структуры б условиях дозированного и ориентированного растяжения представляют идеальную модель для изучения тонких механизмов к структур, определявших стимулиру-йций аффект растяжения на рост и формообразование.
Анализ литературы показал, что исследования фасций скелетных мышц при удлинении по Ялизарову ограничены светосптическиг.:н описаниями реакцій тканевого уровня (Шеховцовз И.С. и др., 1983, 1936, 1937, I9S3), отсутствуют комплексные морфологические исследования разных уровней структурной організацій, работы ло количественному анализу дистрахцнекного морфогенеза фасций.
В плане развития концепции о биологических днетракторах -
оок&х роста костей, создавщіх напряжение растяжения в процессе их естественного роста (Илизаров Г.А., 1975, 1932, 1934), представляет особый интерес ср&внителънцй анализ постнатального естественного и дастракционного морфогенеза тканей конечности у взрослых с целью выявления общнемти проявлений эффектов напряжения растягекия з этих процессах. Б доступной литературе нами " не обнаружено комплексных исследований с использованием методов трансмиссионной, скакируэдей электронной микроскопии, стереоло-гичеспого к информациенного анализа фасций скелетных мышц собак в періоде постнатального естестлинного pocva. Отсутствуют сравнительные исследования постнатального естественного к дистрак-даонного у взрослых морфогенеза фасций.
Цель и задачи исследования. Цель ра-6owi - кэученле проявлений эффекта Илизарова на разьых уровнях структурной организации фасций при дистрахционном удлинении ко-не^носри у взрослых собак и в периоде постнатального естественного роста у щенков, выявление о&цнести проявления эффектов напрямная растякешя в этих процессах.
В связи с чем в данной работе были поставлены следуюгцче задачи:
1, Исоледовать собственные фасции передних больаеберцовкх
юпц собак кзтодаги трансмиссионной* минирующей электронной
микроскопии, стереологичеокого и информационного анализа ка сле
дующих этапа* удлинения гслени по Илиаарову: а) в периоде дис-
тракции, б) в периоде фиксации удлиненной голени э аппарате,
в) после снятия аппарата с удлиненной конечности.
2. Исследовать этими же катодами собственные фасции перед
них большеберцовых музд в періоде посткаталького естественного
pocta у цекков.
'3. Провести сравнительный анализ постнатального естественного л дистракциоиного у взрослых собак морфогенеза фасций передних больщеберцовнх кшщ.
Научная новизна. Впервые с помощью кошлекс-ксго иирфодогического анализа (спетовая микроскопия полутенких дергзов, трансмиссионная и сканируог^я электронная микроскопия, *:-. стереологичеекий и информационный анализ) проведено изучение , ул!>У|Х\струкїурнкх проявлений эффекта Илизароза в фасщях скелет-: ных ькзц .тазовой конечности собак при ее дезирозаішом удлинении ;у вярослых и в периоде постнатального естественного роста, срав-
нительный анализ постнатального и днстракционного морфогенеза фасций у взрослых собак.
Полученные данные дополняют представления о структурах и механизмах, определявших реализации рост-стимулируюцего к фор-могенного эффектов напряжения растяжения естественного и искуст-венного генеза.
Установлено, что в условиях напряжения растяжения, создаваемого в ткани фасций при дозированном удлинении тазовой конечности у взрослых собак наблюдается выраженная реакция сосудов гемомикрэциркулятсрного русла, активизация трансэндотелиального транспорта в них и процессов ангиогенеза. Пернваскулнркые зоны врастающих сосудов являются источниками камбиальных элементов фибробластичесхого и моконуклеарного рядоз и зонами прогрессивной дифференцировки клеток фибробластического ряда. Показаны изменения ультраструктурных, стереологических и информационных характеристик фаспии, ее фибробластической популяции и структур межклеточного матрикса на разных этапах удлинения конечности по Илизарову и з периоде постнатального естественного роста. Установлено, что.в первый месяц постнатального и днстракционного морфогенеза фасі-нй преобладают явления генеза и роста клеточных и межклеточных структур, а в течение второго месяца постнаталь-ного и дистракционного морфогенеза и в периоде фиксации голени в аппарате - явления их прогрессивной дифферекплрозкп.
Формогенкый эффект напряжения растяжения искусственного и естественного генеза реализуется через систему цитостромальнг-;, межклеточных взаимодействий фибробластов и структуры ИХ ЦИТОСК-т-лета, компартментализацию процессов фибрпллегенеза и ориентанхю фибробластов и формируемых ими коллагеновых волокон по вектору дозированного растяжения.
Практическая значимость. Полученные в работе данные о структурах и механизмах, определякгцих реализацию рост-стимулирующего и формогеннсго эффектов напряжения растяжения искусственного и естественного генеза имеют теоретическое и практическое значение. Они развивают представления о напряжении растяжения, как одном из основных факторов морфогенеза тканей, подтверждают эволлциокно выработанный характер действия этого фактора, лежац&го в основе открытого Г.А.Ллизаровкм и широко используемого в практике травматологии и ортопедии явления.
Результаты данного исследования включены з лекции, прочитанные на кафедре травматологии и ортопедии при ЕКНЦ "ВТО" и на международных симпозиумах и курсах АСАМИ (Ассоциации по изучению и применению методов Илизарова) профессором Г.А.Илизаро-вым.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на У1 Всесоюзной совещании эмбриологов е МГУ (Мосхва, 1931), 3-ей зональной научно-практической конференции анатомов, гистологов и эмбриологов Сибири и Дальнего Востока "Проблемы реактивности и адаптации" (Иркутск, 1932), I Всероссийском съезде ВгНОАГЭ (Оренбург, 1932), конференции "Вклад молодых ученых Красноярья в программу "Здоровье" (Красноярск, 1932), Всесоюзном симпозиуме "Регуляторная рель мембран в процессах дифференцировки и пролиферации клеток" (Пуцино-на-Оке, Москва, 1933), Всесоюзном симпозиуме с участием иностранных специалистов "Экспериментально-теоретические и клинические аспекты, разрабатываемого в КНИИЭКОТ метода чрескостного остеосинтеза" (Курган, 1933), конференции "Молодые ученые Красноярья - советскому здравоохранению" (Красноярск, I93G), X Всесоюзном съезде АГО (Винница, 1936), Всесоюзной школе-семинаре по количественным методам в морфологии (Куйбышев, 1936), республиканской .конференции "Проблемы гистофлзиологни соединительной ткани" (Новосибирск, 1939), Международной конференции "Метод Илизарова -достижения и перспективы" (Курган, 1993).
По матеріалам работы оформлено 9 рационализаторских предложений.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, 2 из них в иностранной печати, 2 работы подано в печать.
С б ъ е к и структура диссертации. Содержание диссертации изложено на 145 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, трех разделов (обзор литературы - І глаЕй, матеріали и методы - I глава, собственные исследования - 3 глаЕы), обсуждения, выводов, списка литературы.
Текст иллостріреван 14 таблицами и 102 рісунками (микрофотографик, электронограммы, графики). Указатель л*,1тературы включает 181 отечественную к 119 иностранных работ.
Основные пел о 25 е н и я, выносимые на защиту: I. Напряжения растяжения, создаваемые прі удлине-
ний голеки по Илизарову у взрослых собах, вызывают изменения па всох уровнях структурной организации фасции, свидетелъствуп-грле об активных ростовых и формообразовательных процессах.
-
В периоде постнаталмюго естественного роста щенков напряжения растяжения, создаваемое в фо.ецнях єстеетьеннкки биологическими дпетракторами - эпнфпзарпкгл сопами роста костей, характеризуются сходніги с периодом дистравний у взрослых собак п.рсявленипж рост-ст'лмулнрувщего u формогенного аффектов напря-;;ення растялеекия.
-
Сравни тел ыги'л анализ постнатального и дистракционпого морфогенеза фасций докаенвас-т эзолюционно сиработапиин" характер реакции структур тканевого, клеточного и субклеточного уровня организации на внешнее растяжение, независимо от способа его создания - естественного или искусственного генеэа.
Об:цая характеристика исследованного материала. Объектом исследования слуянлн собственнее фасции передних болыдеберцокьг.: г.:;,ы; голеней 75 беспородных собак, з том числе 42 взроелкх собак на разных ятапах удлинения голени по Илизарозу, 20 собак з периоде постнатального естественного роста и 5 взрослых интант-пых собак.
При дозированном удлинении голени по Илизарову у взрослых собак производили закрытую флекеиоину» остеоклазкю (излом путем изгиба) берцовых костей и спустя 5 дней начинали их дозированную дистракцию з аппарате Илизарова с суточным темпом 0,75 -I мм за 3 - 4 раза в сутки. Изменения фасций при дозированном удлинении голени исследовали на елсдумщлх этапах эксперимента: І) з периоде дозированной дистракции - на 7, 14, 21, 23, 40, 42, 52, 50 и 65 сутки удлинения; 2) на отале последуюцей фиксации удлиненной голені; з аппарате Илизарова в течение 60 дней; 3) в периоде после снятия аппарата - из. 9D ~ 180 сутки после снятия аппарата с удлиненной голени после этапа се фиксаппи в аппарате.
Морфогенез фасций передних бэльшеберцовых мыиц в периоде постнатального естественного роста изучали у следующих возрастных групп собак: на I, 7, 14 сутки и спустя I, 2, 3, б месяцез после рождения.
Методы светооптическогс и ялектронно-микроскопического ЦП"
следования. Забор материала с регистрацией его ориентации относительно длинной сси голени осуществляли после эвтаназии собак введением летальной дозы барбитуратов. Основную часть экспериментального материала забирали после перфузиониой фиксации тканей тазовой конечности, для сканирующей электронной микроскопии материал фиксировали иммерсионно. Фиксацию производили з смеси 2% глютаральдегида и 2 параформальдегида на фосфатном буфере рН 7,4, постфіксировали в 1% растворе четкрехокиси осмия и после стандартной проводки кусочки фасций заключали в аралдит, регистрируя их ориентацию относительно длинной оси голени.
Для светооптического исследования с помощью алмазного нога на ультратоме 1KB 8800 изготавливали полутонкие срезы, ориентированные продольно и поперечно относительно длинной оси голени. Их окрашивали метиленовим синим по Сегго (1980) и изучали на фотомикроскопе фирмы "0ІГГ0Н".
Для электронно-микроскопического исследования ультратонкие срезы, изготовленные аналогичным способом, контрастировали ура-нилацетатом и цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе JEM-I00B. '.
Для исследования архитектоники фасций образцы ткани, фиксированные в смеси альдегидов, обезвояоїЕали в .спиртах и ацетоне и лиофилизировалл с помощью приставки JEE-AC к вауумноку на-пылитёлю JEE-4X, напыляли серебром в ионном напклителе ІВ-6 и изучали в сканирующем электронном микросколе JSM-840. Для исследования цитоархитектоники фибробластов, стереоультраструкту-ры коллагеновых волокон и клеточно-матриксных взаимосвязей дополнительно производили ферментативный гидролиз фиксированных образцов ткани раствором пепсина перед их обработкой описанным визе способом для изучения в сканирующем электронном мікроскопе JSM-84Q.
Методы стереологического и информационного анализа. Для повышения объективности и информативности качественных данных ультраструктурного исследования производили определение стерео-логических параметров фасций у следующих групп собак: І) в периоде дистракции - на 7, 14, 28 и 58 сутки удлинения голени; 2) на 60 сутки фиксации удлиненной голени в аппарате Іїлизарова; 3) на 180 сутки после снятая аппарата; 4) в периоде постнагального естественного роста - у 7-, 14-суточных, 1- и 2-месячных щенков и 5) у взрослых интактнкх собак. Случайную выборку для стереологи-
.-'"* б
ческого анализа создавали путем фотосъемки участкоз ультратсн-ких срезов фасций в правых верхних углах опорной сетки при инструментальном увеличении электронного микроскопа х 4900. Оценку стереологических параметров производили при наложении тестовой системы на проекции фотопластинок при их окончательном увеличении х 19600. В качестве тестовой системы использовали многоцелевую тестовую решетку коротких отрезков (Weibel , 1966) с параметрами п = 216, Р = 432, LT = 110,2 мкм.
На основании данных подсчета определяли относительный объем или объемную плотность и относительную площадь поверхности или поверхностную плотность для фибробластов и их биосинтетических ксмпартментоз - дцер, эндоплазнатического ретикулума шероховатого типа (ЭПР), цитоплазмы, поверхностную плотность зон межклеточных соединений фибробластов. Вычисляли объемную плотность всех компонентов межклеточного матрикса - коллагеновых фибрилл, эластических волокон и оснозного вещества. Как отношения первичных стереологических параметров рассчитывали значения 14 вторич-іїілх стереологических параметров, оценивающих количественно характер структурной организации фибробластов и их компартментов: поверхностко-объемш-те отношения фибробластов, их ядер и ЗПР, относительные объем ядер и ЗГІР в единице клеточного объема фибробластов, относительные площади поверхности ЗПР и межклеточных контактов в единице клеточного объема фибробластов, а такяе объемные соотношения разных компонентов ме:г.клеточного матрикса, выявляющие характер структурных сдвигов в межклеточном веществе фасций. Как специфический параметр, оценивающий динамику уровня надклеточной интеграции фибробластов в процессе морфогенеза фасций, вычисляли показатель интенсивности коитактообразования мег-ду фібробластами, как отнопенме площади поверхности зон межклеточных контактов к площади поверхности плазмалеммы фибробластов.
Количествєпі'не данные стерсологического анализа обрабатывали статистически на ЗЗМ СМ-3. Средние значения параметров у разных групп собак сравнивали по критерии Стьюдента и парному критерию Вилкоксона, достоверными считали различия при вероятности ошибки - Р - меньпе 0,05.
Для оценки интегральных показателей, характеризующих уровень организации биологического объекта как целостной системы, и определения их динамики в процессе морфогенеза фасций использовали метод информационного анализа (Автандилов Г.Г., 1990; Ле-
онтюк А.С. и др., 1931). Информационные характеристики (энтропию, относительную энтропию, организацию и коэффициент избыточности) в периоде постнатального и дистракционного морфогенеза вычисляли для фасции как системы и ее основных структурных подсистем - межклеточного ыатрикса, фибробластичеекой популяции, системы межклеточной интеграции фибробластов - используя результаты стереологического анализа у тех же групп собак."Информационные параметры рассчитывали го формулам, приведенным в работе Лоонтюк А.С. и др. (1931).