Ультраструктура и техмерная организация ядрышек на разных этапах клеточной дифференцировки и опухолевого роста Челидзе, Павел Вениаминович

Введение к работе

Актуальность проблемы. Одним из свойств генома эукариотов является группировка многократно повторяющихся рибосомных генов /р-генов/, кодирующих последовательности IBS-, 28S- и 5,83-рРНК, в кластеры, лежащие в специализированных сегментах некоторых хромосом, носящих название ЯОР*. Процессы, связанные с формированием рибосом, характеризуются строгой пространственной упорядоченностью и доступны визуальному наблюдению. Все эти процессы развиваются в специализированной области ядра - в ядраже, где концентрируются интенсивно транскрибирующие р-гены и продукты их активности, а также осуществляются различные стадии процессинга ново-синтезированной пре-рРЕК вплоть до сборки зрелых прерибосомных субъединиц. Молекулярные события, связанные с биогенезом рибосом, отражаются в структурной организации ядрышка. В составе ядрышек интерфазных клеток принято различать следующие структурные элементы:

фибриллярные центры /Щ/ - структуры, содержащие рДДК и белки /например, Ag -белки, ИЖ-полимеразу I и топоизомеразу I/, соответствующие ЯОР митотических хромосом; входящая в состав Щ рДЖ выявляется преимущественно в виде фибрилл толщиной 2-5ям;

плотный фибриллярный компонент /ПФК/ представленный РНП-фибриллами толщиной 4-8нм, в состав которых входят ювосинтезированная пре-рРЕК и Ag -белки;

гранулярный компонент в виде РНП-частиц, диаметром Ю-25нм представляет собой прерибосомы на разных этапах созревания;

около- и внутриядрышковый' хроматин /ассоциированный, с ядрышком хроматин/ образован" ДНП-фибриллами диаметром 20-30нм; внутриядрышковый хроматин структурно связан с ФЦ и по данным не-радиоавтографической гибридизации la situ содержит рДНК /Th^ry, Thiry-Blalse, 1989/і

- ядрышковые вакуоли /лакуны/ - светлые зоны внутри ядрышка, материал которых по структуре не отличим от

Принятые сокращения: ЯОР - ядрышкообразующие районы; ФЦ - фибриллярный центр; ШК - плотный фибриллярный компонент; Ag-бзлки, зоны - аргентофильнне белки, зоны.

нуклеоплазмы; предполагают, что вакуолярный компонент может принимать участие в депонировании, процессинге и транспорте рРНП.

Структурная организация ядрышка, зависящая от количественного соотношения и определенной топографии вышеуказанных структур, сильно варьирует и тесно связана с его функциональной активяостьнз, т.е. с уровнем синтеза предшественника рРЖ со скоростью процес-синга и выхода зрелых субъединиц прерибосом из ядрышка з нуклео-плазму. В целом тонкие изменения ультраструктури ядрышка отражают вариабельность уровня метаболизма клетки. Этим можно объяснить неослабевающий интерес к изучению структуры ядрышка.

Среди всего разнообразия морфологических вариантов организации ядрышка описанных к настоящему времени, можно выделит? несколько главных типов, что послужило основой для классификации ядрышек. Впервые данные о структуре и функциональной активности ядрышек были обобщены в классификации Буша и Сметаны /Busch_t Smeta-na, 1970, Smetana, 1974 /. Согласно этой классификации, на све-тооптическом и ультраструктурном уровнях удается различить пять основных морфологических типов ядрышек: компактные, нуклеолонем-ные, кольцевидные, сегрегированные и микроядрышки.

Компактные ядрышки в световом микроскопе выглядят практически однородными и отличаются крупными /3-4мкм/ размерами. На ультратонких срезах этот тип характеризуется хорошо выраженными ФЦ /0,1-0,5мкм/, а также высокой степенью развития и равномерным распределением гранулярного компонента. Компактные ядрышки обнаруживаются главным образом в интенсивно пролифернрую-щих или растущих клетках животных и растений.

Нуклеолонемные ядрышки имеют в основном крупные размеры /2-4мкм/ и характерное нитчатое строение. На ультраструктурном уровне нуклеолонема представляет собой сильно извитые электроноплотные тяжи, диаметром I50-200HM, состоящие из ПФК и гранулярного компонента. Ядрышки значительного числа объектов характеризуются малыми размерами /"50-80нм/ и высоким числом ФЦ. Цуклеолонемяые ядрышки встречаются в активно синтезирующих белки и пролиферирующих клетках.

Кольцевидные ядрышки в световом микроскопе имеют форму кольца с оптически светлой центральной зоной; их диаметр составляет~Імкм. На ультратонких срезах видно, что центральную часть кольцевидных ядрышек занимает один крупный ФЦ, окруженный РШ-фибриллами и гранулами. Кольцевидные ядрышки ветре-

чаются в клетках с низким уровнем синтеза рРНК /дифференцированные и обработанные ингибиторами клетки/.

Сегрегированные ядрышки. Основным морфологическим признаком сегрегированных ядрышек считают пространственное разделение /сегрегацию/ их структурных компонентов и сравнительно небольшие размеры /до І-2мкм в диаметре/. Возникновение сегрегированных ядрышек наблюдается после действия различных ингибиторов синтеза рРНК.

Микроядрышки. Это наиболее неоднородная группа, к которой относят ядрышки крайне малых /до I мкм/ размеров. Они встречаются при очень низком уровне или полном отсутствии транскрипции.

Основ классификации Буша и Сметаны придерживается значительное число исследователей /fiemandez-Verdun, 1986 /. В то же время, эта классификация не учитывает всего многообразия морфологических типов ядрышек, выделяемых в большом числе объектов растительного и животного происхождения. Так, в нее не вошла достаточно обширная группа вакуолизированных ядрышек и многие другие формы. Кроме того приведенная классификация основана,главным образом,на результатах свето-оптических исследований и ультраструктурного анализа случайных срезов и не учитывает современных представлений о трехмерной и функциональной связи основных структурных компонентов. В связи с этим возникает необходимость в обновлении существующей классификации ядрышек на основании того фактического материала, который накоплен по данному вопросу за последнее время. Важно подчеркнуть, что новая классификационная система должна основываться, главным образом, на результатах анализа объемной структуры ядрышка.

Вследствие лабильности структурной организации ядрышка, исследование случайных сечений малоэффективно, что делает необходимым использование методов стереологического анализа. Наиболее успешно применяется трехмерная реконструкция изучаемых структур с помощью серийных ультратонких срезов /Goessens, 1984; Dupui-Ooin, 1986; Hernandez—^rsrdua, "Э86? Зацепина и др,, 1988; Zatsepina et al., 1988 "9S9; Geraud et al,, 1988; Motte et al , 1988; Bourgeois, Hub*-x*,- 1988 и др/, Несмотря на трудоемкость, это единственный метод, позволяющий воссоздать картину строения ядрышка в объеме.

За последнее время в изучении объемной структуры и функционирования ядрышка достигнуты значительные успехи. Диапазон проводимых работ чрезвычайно широк и включает направление., имеющие отнюдь не только теоретическую ценность. Сильно прогрессируют исследования

_ 4 -ядрышек и ЯОР при опухолевом росте и других заболеваниях человека /Мамаев и др., 1981, I984;ELoton et al., 1982, 1983, 1984, 1987; Jackson-Cook et al., 1985? Hernandez-Verdun, 1986; Crocker, Nar, 1987;Dercnzini et al., 1989/. Углубление знаний в этом.направлении является важным этапом изучения механизмов функционирования одного из главных звеньев генома эукариотов, что может способствовать решению многих медикобиологических проблем.

Несмотря на обилие работ, существует ряд принципиальных вопросов, без решения которых невозможно получить полное представление об организации и функционировании ядрышка. Так, в настоящее время трехмерные исследования ограничены лишь несколькими типами'ядрышек, что не позволяет выработать общие принципы морфофункциональпй характеристики известных разнообразных форм ядрышка. Не исследована в деталях динамика структурных преобразований ядрышка пси переходах из неактивной формы в активную и наоборот. Мало изучен вопрос о корреляции количества и размеров ЯОР в митотических клетках с числом и размерами <5Ц в интерфазе на соответствующих стадиях диф-ференцировки. Большой интерес представляет объемная реконструкция Ag-зоя, что дает возможность топографической и количественной оценки Ag-белков в различных типах ядрышек. Следует подчеркнуть, что реакция на Ag-белки является надежным цитохимическим тестом, широко используемым для выявления зон активной транскрипции и районов, содержащих р-гены с потенциальной активностью. И, наконец, практически не исследованы пространственные изменения ядрышковых компонентов при различных патологических состояниях, в том числе при опухолевом росте.

Цель и задачи работы. Исходя из вышесказанного, основной целью настоящей работы было создание принципиальной схемы структурной организации ядрышка и динамики перестроек его компонентов при разни уровнях функциональной активности р-генов в норме,в условиях искусственного подавления синтеза рРНК противоопухолевым антибиотиком адриабластином и при опухолевой трансформации. Поставленная задача решалась на основе стереологического и морфометрического анализа объемных изображений разнообразных форм ядрышек в процессе диффе-ренцировки, в ее терминальных стадиях и в опухолевых клетках.

Конкретные задачи работы состояли в следующем:

I. Установить глазные закономерности организации и взаимосвязи ядрышковых компонентов в основных морфофункциональных типах ядрышек: высокоактивных /компактных и нуклеолонемных/; умеренно-ак-

- 5 -тивных /ретикулярных и вакуолизированных/; малоактивных /кольцевидных/ и неактивных /сегрегированных ядрышках и в свободных фибриллярных центрах/.

1. Описать динамику структурных переходов при активации и инактивации ядрышка.

2. Определить основные количественные параметры ядрышка и его компонентов в вышеуказанных типах /количественная и объемная характеристика ядрышек, <5Ц, РНП-части и вакуолярной системы/.

3. Установить корреляцию между числом ЯОР и ФЦ в митозе, ин-терфазе и в процессе дифференцпровки клеток.

4. Установить взаимосвязь между количественными характеристиками и общей структурной организацией ядрышек в клетках дифференцированных тканей с различным уровнем функциональной активности.

5. Изучить количественные параметры и пространственную организацию ядрышек в условиях искусственного ингибирования синтеза рРНК на примере процесса сегрегации ядрышковых компонентов.

6. Провести стереологичесхое и морфометрическое изучение распределения аргентофильных белков в активно пролиферирующих, дифференцирующихся, терминально дифференцированных клетках, а такие

в условиях искусственного подавления синтеза рРНК.

8. Изучить особенности организации и количественного соотношения ядрышковых компонентов в процессе нарастающей вакуолизации ядрышка, связанной с его инактивацией.

9. Охарактеризовать особенности ультраструктурной и трехмерной организации ядрышек клеток человека, находящихся в состоянии опухолевого роста.

10. Изучить ультраструктуру и трехмерную организацию ядрышек
разных вариантов доброкачественных и злокачественных опухолей чело-

*Многие авторы /см., например,Hernandez-Verdun, 1986/ используют термины "нуклеолонемные" и ."ретикулярные" ядрышки как синонимы. Впервые ретикулярные ядрышки выделены в самостоятельный тип в классификации Челидзе и Зацепиной /1988/. Основой для такого разделения послужило то, что несмотря на формальное сходство указанных двух типов /сетчатое строение, отчетливо выраженные вакуоли и др./ группа ядоышек, отнесенная нами к ретикулярному / .' р а -бекулярному/ типу, по ряду признаков отличается от нуклео-лоне'мных и характеризуется: II/ выраженным губчатым /трабекулярным/ строением; I'll слабым развитием ШЖ и гранулярного компонента; /3/ хорошо выраженными ФЦ; /41 интенсивно развитым вакуолярным компонентом так, что система вакуолей и РНП-структуры развиты примерно в одинаковой степени.

века, отличающихся по степени злокачественности, гистогенезу и органной принадлежности.

Научная новизна. Получен ряд принципиально новых фактов, раскрывающее основные закономерности морфофункциональной организации ядрышек в процессе митоза, дифференцировки, а также при опухолевой трансформации.

Среди новых и наиболее существенных результатов, в первую очередь, иояно выделить следующие. /I/. Разработана новая классификация ядрышек, основанная на стереологическом и морфометрическом анализе его кодшонентов. /2/. Существенным представляется установление структурной непрерывности между ФЦ, внутриядрышковым и околоядрышко вым хроматином. Эти наблюдения позволяют говорить о наличии -диной функциональной системы, включающей активный хроматин ФЦ и остальной инактивированный хроматин ядрышка. /3/.Получена детальная картина объемной организации ядрышка на последовательных этапах процессов активации и инактивации метаболизма рРНК. Даны подробные характеристики общей структурной организации ядрышка и количественные параметры отдельных его компонентов, начиная от полностью инактивиро-ванного состояния в виде свободного ФЦ, через промежуточные этапы нарастания функциональной активности вплоть до высокоактивных нук-леолонемных и компактных ядрышек. Подобным образом охарактеризованы последовательные стадии преобразования структуры ядрышек в процессе инактивации. /4/.Установлены неизвестные ранее взаимоотношения между объемными характеристиками ЯОР хромосом и ФЦ ядрышек на разных стадиях эритропоэза. На стадии проэритробласта мевду суммарными объемами метафазных ЯОР и интерфазных ФЦ существует четкое соответствие. По мере дифференцировки происходит прогрессирующее снижение общего объема ФЦ. Параллельная трехмерная реконструкция Ag -зон ядрышек позволила связать уменьшение общего объема ФЦ в дифференцирующихся эритроидных клетках с потерей части Ag-белков. /5/.Использование ультраструктурного анализа ядрышка позволило установить неизвестную'ранее функциональную гетерогенность эпителиаль ных клеток проксимального отдела, нефрояа в пределах одного канальца. Этот факт подтверждается наличием корреляции между различными вариантами ультраструктурной организации ядрышка и интенсивностью синтеза в клетках РНК, определяемого по включению н -уридина. /б/.Стереолбгический анализ позволил выявить ряд специфических приз наков объемной организации ядрышка в опухолевых клетках человека, в частности, появление в ядрышках гигантских фибриллярных центров

_ 7 -з крайне сложным рельефом при инвазивяых формах рака молочной железы.

Практическая ценность работы. Результаты стереологического и шрфометрического анализа ядрышка и аргентофильных зон могут ис-аользоваться в целях оценки уровня синтеза рРНК в норме и при различных патологических процессах. Данные, полученные при изучении структурной организации ядрышек доброкачественных и злокачественных опухолей различных органов человека, могут быть использованы для определения степени злокачественности, гистогенеза и йругих свойств опухолевых клеток, учитываемых при дифференциальной диагностике новообразований.

Результаты стереологического и морфологического анализа ядрышка и аргентофильных районов в условиях подавления синтеза рРНК противоопухолевым антибиотиком адриабластином могут быть использованы для наблюдения за фаркакодинамикой и побочными эффектами этого широко распространенного хш.шотерапевтического препарата.

Основные результаты исследования включены в учебную программу курса лекций по биологии клетки на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии Тбилисского государственного университета.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены и обсуждены на 6 Всесоюзном совещании эмбриологов /Москва, І98Г/; Всесоюзном симпозиуме "Белки и экспрессия генома" /Канев, 1983/; Всесоюзном симпозиуме "Реактивность клеточных органелл" /Тбилиси, 1983/; 9 и 10 Всесоюзных симпозиумах по структуре и функциям клеточного ядра /Путино, 1984; Черноголовка, 1987/; Советско-Финляндском симпозиуме по проблемам биологии развития /Тбилиси, 1984/; Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные и функциональные механизмы онтогенеза" /Харьков, 1987/; II Международном рабочем совещании по ядру /Суздаль, 1989/, семинарах сектора электронной микроскопии Мекфакуль-тетской проблемной НМ молекулярной биологии и биоорганической химии им. А^Н.Белозерского МГУ и ряда институтов АН СССР и АН ГССР, заседании Латвийского общества АГЭ /Рига, 1988/. По материалам диссертации опубликованы 33 печатных труда и монография "Ультрас.рук-тура и функции ядрышка интзрфазной клетки" /"Мецниереба", Тбилиси, 1985/.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 371 страницах машинописного текста /собственного текста 299 страниц/, состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы / глава I/, раздела собственных исследований /глава II/, обсуждения полученных дан-