Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1. Регуляция роста и ремоделирования кровеносных сосудов 15
1.1.1 Клеточные компоненты сосудистой стенки 15
1.1.2 Механизмы формирования сосудов 17
1.1.3 Ветвление сосудов при ангиогенезе 20
1.1.4 Специализация клеток при ангиогенезе: tip и stalk фенотип 21
1.1.5 Филоподии и ламеллоподии определяют направление роста сосудов 25
1.1.6 Ангиогенные факторы роста 29
1.1.7 Хемокины и цитокины, их роль в процессах ангиогенеза 35
1.1.8 Роль интегринов в процессах ангиогенеза 47
1.1.9 Роль протеаз в процессах ангиогенеза 49
1.1.10 Эндогенные ингибиторы ангиогенеза 49
1.2 Навигационные рецепторы в нервной и сердечно-сосудистой системе 51
1.2.1 Эфрины и их рецепторы 54
1.2.2 Эфрины и их рецепторы в сосудистой системе 60
1.2.3 Семафорины и их рецепторы 63
1.2.4 Роль Семафоринов и их рецепторы в сосудистой системе 65
1.2.5 Нетрины и их рецепторы 69
1.2.6 Нетрины и их рецепторы в сосудистой системе 70
1.2.7 Cлит лиганды и Robo рецепторы 74
1.2.8 Слит лиганды и Robo рецепторы в сосудистой системе 75
1.2.9 Урокиназная система 78
1.3 Кадгерины в процессах морфогенеза 87
1.3.1 «Классические» кадгерины 87
1.3.2 Экспрессия кадгеринов в нервной системе в эмбриогенезе 93
1.3.3 Роль кадгеринов в развитии сердца и сосудов 95
1.3.4 Т-кадгерин 97
1.3.5 Навигационная роль Т-кадгерина в нервной системе 100
1.3.6 «Гормоноподобные» эффекты липопротеидов низкой плотности (ЛНП). Т-кадгерин и ЛНП 104
ГЛАВА 2. Материалы и методы 110
2.1 Антитела и реагенты 110
2.2 Культивирование эукариотических клеток 112
2.3 Трансфекция эукариотических клеток 112
2.4 Создание лентивирусных конструкций для трансдукции эндотелиальных клеток HUVEC 115
2.5 Создание аденовирусных конструкций для трансдукции эндотелиальных клеток HUVEC 116
2.6 Вестерн блоттинг (метод иммуноблоттинга) 117
2.6.1 Приготовление лизатов клеток 117
2.6.2 Определение концентрации белка в лизатах клеток 117
2.6.3 Вестерн блоттинг 117
2.7 Иммунофлуоресцентное окрашивание эндотелиальных клеток и конфокальная микроскопия 118
2.8 Измерение SRE активности в NIH3T3 клетках 119
2.9 Выделение активных Rho ГТФаз (GST pull-down assay) 120
2.10 Измерение проницаемости эндотелиального монослоя in vitro 120
2.11 Трипсинизация эндотелиальных клеток 121
2.12 Разделение лизатов клеток на субклеточные фракции 121
2.13 Оценка пролиферация эндотелиальных клеток 122
2.14 Метод измерения адгезии эндотелиальных клеток 122
2.15 Метод измерения апоптоза в эндотелиальных клетках 123
2.16 Измерение миграции эндотелиальных клеток в камере Бойдена 123
2.17 Метод изучения формирования капилляро-подобных структур эндотелиальными клетками 124
2.18 Экспериментальные животные 124
2.19 Анализ экспрессии Т-кадгерина в раннем эмбриональном развитии у мыши 125
2.19.1 Получение датированной беременности мыши 125
2.19.2 Получение эмбрионов мыши на постимплантационной стадии развития 125
2.19.3 Иммунофлуоресцентное окрашивание мышиных эмбрионов антителами против Т-кадгерина 125
2.19.4 Трансформация E.coli, амплификация и очистка плазмид для in situ гибридизации 126
2.19.5 Линеаризация плазмид для in situ гибридизации 126
2.19.6 Синтез РНК-содержащей пробы для in situ гибридизации 127
2.19.7. Гибридизация мышиных эмбрионов in situ 128
2.20 Эксплантная модель ex vivo аорты крысы 129
2.21 Подкожная имплантация Матригеля мышам 129
2.21.1 Оценка содержания гемоглобина 130
2.21.2 Выявление сосудов в Матригеле с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания 130
2.21.3 Подсчт сосудов и статистический анализ 131
2.22 Приготовление криосрезов тканей человека и животных 131
2.23 Иммунофлуоресцентное окрашивание образцов биопсийного материала кожи человека 131
2.24 Модель гематогенно метастазирующей в лгкие меланомы у мышей in vivo 132
2.25 Анализ кинетики роста и метастазирования клеток меланомы B16F10 133
2.26 Иммунофлуоресцентное окрашивание криосрезов первичных узлов меланомы 134
2.27 Модель хориоаллантоиcной мембраны куриного эмбриона in vivo 135
2.28 Оценка пролиферации клеток B16F10 in vitro 136
2.28.1 Метод подсчта абсолютного числа клеток 136
2.28.2 Метод измерения клеточного индекса 136
2.28.3 Оценка распределения клеток B16F10 по фазам клеточного цикла in vitro 137
2.29 Оценка уровня некроза и апоптоза клеток B16F10 in vitro 138
2.30 Анализ экспрессии генов в клетках клонов B16F10 in vitro 138
2.30.1 Выделение РНК 138
2.30.2 Синтез кДНК и полимеразная цепная реакция с детекцией в режиме реального времени (RT-PCR) 138
2.30.3 Синтез кДНК и анализ профиля экспрессии генов с помощью наборов RT2 Profiler PCR Array 141
2.31 Концентрирование кондиционированной среды клеток B16F10 141
2.32 Оценка инвазивного потенциала клеток B16F10 in vitro 141
2.33 Получение мезенхимных стромальных клеток жировой ткани (МСК-ЖТ) мыши 143
2.34 Влияние кондиционированной среды клеток B16F10 на пролиферацию и миграцию МСК-ЖТ in vitro 143
2.34.1 Влияние кондиционированной среды клеток B16F10 на пролиферацию МСК-ЖТ 143
2.34.2 Влияние среды от клеток клонов B16F10 на миграцию МСК-ЖТ 144
2.35 Статистическая обработка результатов 145
2.36 Иммуногистохимическое окрашивание криосрезов аорты человека 145 2.37 Выделение и йодирование липопротеидов низкой плотности 146
2.38 Определение поверхностного связывания 125I-ЛНП с клетками 147
2.39 Определение концентрации внутриклеточного Ca2+ 147
2.40 Оценка влияния липопротеидов низкой плотности на миграцию L929 клеток 150
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 151
3.1 Выявление экспрессии Т-кадгерина в эмбриогенезе у мыши 152
3.1.1 Синтез РНК пробы 152
3.1.2 Экспрессия Т-кадгерина в эмбриональном головном мозге у мыши 156
3.1.3 Экспрессия Т-кадгерина в эмбриональном сердце 161
3.2 Т-кадгерин и опухолевая прогрессия 163
3.2.1 Т-кадгерин и опухолевый рост 164
3.2.2 Строма играет важную роль в регуляции роста и прогрессии опухолей 165
3.2.3 Т-кадгерин и васкуляризация опухолей 166
3.2.4 Потеря экспрессии Т-кадгерина в кератиноцитах и нарушение его экспрессии в сосудах коррелирует с процессами озлокачествления немеланомных новообразований кожи человека 168
3.2.4.1 Нормальная кожа 169
3.2.4.2 Псориаз 171
3.2.4.3 Актинический (солнечный) кератоз (АК) 173
3.2.4.4 Кератоакантома (КА) 175
3.2.4.5 Базальноклеточный рак (базалиома) 178
3.2.4.6 Плоскоклеточный рак или плоскоклеточная карцинома (ПР) 183
3.2.4.7 Метатипический рак (МР) 186
3.2.4.8 Потеря экспрессии Т-кадгерина в опухолевых клетках и нарушение его экспрессии в сосудах коррелирует с опухолевой прогрессией меланомы 190
3.2.4.9 Экспрессия Т-кадгерина в меланоме человека 192
3.3 Т-кадгерин и меланома 198
3.3.1 Анализ экспрессии Т-кадгерина в клетках мышиной меланомы В16F10 198
3.3.2 Влияние экспрессии Т-кадгерина на пролиферацию клеток мышиной меланомы B16F10 in vitro 202
3.3.3 Влияние экспрессии Т-кадгерина на распределение клеток клонов B16F10 по фазам клеточного цикла in vitro 204
3.3.4 Влияние экспрессии Т-кадгерина на апоптоз и некроз клеток мышиной меланомы B16F10 in vitro 204
3.3.5 Влияние экспрессии Т-кадгерина на рост, метастазирование и васкуляризацию первичного узла меланомы B16F10 на модели гематогенно метастазирующей в лгкие меланомы у мышей 206
3.3.5.1 Влияние экспрессии Т-кадгерина на рост первичного узла мышиной меланомы B16F10 in vivo 206
3.3.5.2 Влияние экспрессии Т-кадгерина на частоту очагов некроза на срезах первичных узлов меланомы В16F10 208
3.3.5.3 Влияние экспрессии Т-кадгерина на васкуляризацию первичных узлов мышиной меланомы 208
3.3.5.4 Экспрессия Т-кадгерина в клетках меланомы вызывает активацию стромы и увеличивает вклад стромального компонента в формирование первичных узлов мышиной меланомы B16F10 210
3.3.5.5 Изучение влияния экспрессии Т-кадгерина на метастазирование клеток меланомы in vivo 211
3.3.6 Влияние среды роста от клеток клонов B16F10 на пролиферацию и миграцию
МСК-ЖТ in vitro 213
3.3.6.1 Влияние среды роста от клеток клонов B16F10 на миграцию МСК-ЖТ 213 3.3.6.2 Исследование влияния среды роста от клеток клонов B16F10 на
пролиферацию МСК-ЖТ 215
3.3.7 Исследование влияния экспрессии Т-кадгерина на инвазивный потенциал клеток клонов B16F10 in vitro 216
3.3.8 Исследование влияния Т-кадгерина на экспрессию цитокинов, факторов роста и матриксных металлопротеиназ в клетках B16F10 in vitro 218
3.3.9 Влияние экспрессии Т-кадгерина на неоангиогенез в меланоме В16F10 на модели хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона 228
3.3.10 Обсуждение результатов 230
3.4 Выявление роли Т-кадгерина в процессах ангиогенеза 238
3.4.1 Введение клеток, экспрессирующих Т-кадгерин, локально подавляет ангиогенез в бляшках Матригеля 238
3.4.2 Экспрессия Т-кадгерина подавляет образование капилляров, но не влияет на формирование зрелых сосудов 240
3.4.3 Рекомбинантный аминотерминальный ЕС1 домен Т-кадгерина подавляет ангиогенез in vitro 244
3.4.4 Т-кадгерин подавляет миграцию эндотелиальных клеток, но не влияет на их адгезию, пролиферацию и апоптоз 247
3.4.5 Обсуждение результатов 252
3.5 Т-кадгерин и проницаемость сосудов. Сигнальные эффекты Т-кадгерина 256
3.5.1 Распределение экспрессии Т-кадгерина во фракциях эндотелиальных клеток после лентивирусной трансдукции 257
3.5.2 Экспрессия Т-кадгерина регулирует проницаемость монослоя эндотелия 261
3.5.3 Гиперэкспрессия Т-кадгерина вызывает образование межклеточных щелей и исчезновение VE-кадгерина из межклеточных контактов в эндотелиальных клетках 263
3.5.4 Гиперэкспрессия Т-кадгерина в эндотелиальных клетках вызывает клатрин-зависимую интернализацию VE-кадгерина и деградацию в лизосомах 268
3.5.5 Гиперэкспрессия Т-кадгерина увеличивает уровень фосфорилирования VE-кадгерина по тирозину Y731 в эндотелиальных клетках 275
3.5.6 Т-кадгерин активирует SRE в фибробластах NIH3T3 279
3.5.7 Т-кадгерин активирует Rac1 и Cdc42, но не влияет на активность RhoA в фибробластах NIH3T3 282
3.5.8 Т-кадгерин активирует малые Rho ГТФазы RhoA, Rac1 и, Cdc42 и усиливает сборку стресс-фибрилл актина в эндотелиальных клетках 284
3.5.9 Т-кадгерин фосфорилирует LIMK1 и влияет на полимеризацию микротрубочек в эндотелиальных клетках 285
3.5.10 Т-кадгерин влияет на полимеризацию стресс-фибрилл актина в эндотелиальных клетках 289
3.5.11 Обсуждение результатов 295
3.6 Т-кадгерин при атеросклерозе 302
3.6.1 Экспрессия Т-кадгерина в здоровых сосудах 304
3.6.2 Экспрессия Т-кадгерина в сосудах при атеросклерозе 308
3.6.2.1 Липидная полоска 308
3.6.2.2 Нестабильная фиброатерома 311
3.6.2.3 Мягкий кальциноз 312
3.6.3 Обсуждение результатов 314
3.7 Т-кадгерин-рецептор липопротеидов низкой плотности 318
3.7.1 Получение клонов клеток, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин. Анализ экспрессии Т-кадгерина в клонах 318
3.7.2 Связывание [125I]-ЛНП с мембранами клеток L929 и HEK293 319 3.7.3 Введение ЛНП в среду культивирования клеток, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин, повышает концентрацию внутриклеточного кальция 323
3.7.4 ЛНП стимулируют миграцию клеток, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин 334
3.7.5 Обсуждение результатов 336
ГЛАВА 4. Заключение 339
Выводы 347
Список литературы
- Филоподии и ламеллоподии определяют направление роста сосудов
- Создание аденовирусных конструкций для трансдукции эндотелиальных клеток HUVEC
- Выявление сосудов в Матригеле с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания
- Влияние экспрессии Т-кадгерина на распределение клеток клонов B16F10 по фазам клеточного цикла in vitro
Филоподии и ламеллоподии определяют направление роста сосудов
При гипоксии, воспалении, растяжении или опухолевом росте клетки различного происхождения продуцируют ангиогенные факторы (VEGF, Ang-2, FGF) и хемокины (SDF-1 и др.). Факторы роста и хемокины стимулируют миграцию, инвазию эндотелиальных клеток в окружающие ткани и их пролиферацию. На такой стимул покоящийся сосуд в первую очередь отвечает откреплением перицитов от базальной мембраны (в ответ на Ang-2) и локальной протеолитической деградацией внеклеточного матрикса. Параллельно происходит повышение локальной концентрации NO за счет активации синтазы оксида азота (NO), что приводит к вазодилатации [Distler et al., 2003].
Под действием ангиогенных факторов на первом этапе происходит активация и формирование tip эндотелиальных клеток. При этом межклеточные адгезивные контакты, содержащие VE-кадгерин, частично разбираются, что позволяет эндотелиальным клеткам мигрировать по градиенту хемоаттрактанта. VEGF увеличивает проницаемость эндотелиального монослоя, в результате чего белки плазмы (фибронектин и фибриноген) крови вытекают из сосудов в ткань и служат подложкой-матриксом для мигрирующих эндотелиальных клеток [Carmeliet and Jain, 2011].
Важную роль при миграции играют интегрины. Компоненты внеклеточного матрикса, такие как фибронектин, ламинин, гиалуроновая кислота и тромбоспондин содержат участки связывания для интегринов, экспрессирующихся на эндотелиальных и муральных клетках [Distler et al., 2003]. Активированные эндотелиальные клетки и перициты продуцируют протеазы, способствующие разрушению базальной мембраны и повышению подвижности этих клеток. Протеазы, такие как активаторы плазминогена, химазы, гепариназы, триптазы, катепсины и матриксные металлопротеиназы, вызывают протеолитическую деградацию и разрыхление компонентов внеклеточного матрикса, высвобождение и протеолитическую активацию ангиогенных факторов роста, депонированных в матриксе, таких как bFGF, VEGF, HGF (фактор роста гепатоцитов), TGF (трансформирующий фактор роста бета) и других, что, в целом, создает ангиогенную среду и способствует эффективному формированию новых функциональных сосудов [Carmeliet and Jain, 2011].
Для формирования в строго определенном месте функционально зрелых сосудов и предотвращения массовой хаотичной миграции эндотелиальных клеток при ангиогенезе лишь одна из многих эндотелиальных клеток становится tip клеткой («концевой» клеткой), в соседних клетках формируется stalk фенотип. Характерной чертой tip клетки является ее локализация на конце растущего сосуда, большое количество филоподий, с помощью которых tip клеткой «тестирует» микроокружение. Именно tip клетка преобразует комбинации различных навигационных сигналов микроокружения в направленную миграцию следующих за ней эндотелиальных клеток и рост всего сосуда. В ответ на навигационные сигналы, поступающие от Эфринов и Семафоринов, а также и других навигационных молекул, tip клетка мигрирует по градиенту хемоаттрактанта и направляет рост всего сосуда (Рисунок 1.3). Tip клетка не участвует в формировании просвета сосуда и практически не пролиферирует. У tip клетки есть характерный молекулярный профиль, она экспрессирует VEGFR2, VEGFR3, тромбоцитарный фактор роста PDGF-BB, Unc5B, NOTCH лиганды (Dll4и JAGGED1), Нейропилины (NRP) и ряд других белков [DeSmet et al., 2009].
Главную роль в специализации tip и stalk клеток играет градиент VEGF. В условиях высокого уровня VEGF происходит активация и формирование клеток tip клеточного фенотипа с высокой миграционной способностью, в то время как средний уровень VEGF способствует пролиферации и поддержанию в соседних с концевыми клетками stalk фенотипа. VEGF, связываясь с VEGFR2, инициирует сигнальный каскад, приводящий к тому, что одна клетка становится tip клеткой, а другие – stalk клетками. В условиях гипоксии происходит конкуренция за положение tip клетки: клетка, которая связывает максимальное количество VEGF, становится tip клеткой, при этом в соседних с «концевой» клетки подавляется tip фенотип, и они становятся ведомыми (stalk клетки) [Quaegebeur et al., 2011]. Активация внутриклеточной сигнализации при связывании VEGF с VEGFR2 в tip клетке приводит к экспрессии лиганда Dll4 и экспонированию его на поверхности (Рисунок 1.3 и Рисунок 1.4). Начальная специализация и дальнейшее поддержание эндотелиальных клеток в состоянии tip или stalk фенотипа регулируется на уровне Dll4/NOTCH сигнализации. Dll4, являясь лигандом NOTCH, связывается с NOTCH рецептором на stalk клетках, что приводит к подавлению в них tip клеточного фенотипа. NOTCH внутри stalk клеток расщепляется с образованием NOTCH внутриклеточного домена (NICD), который является фактором, регулирующим экспрессию генов. По принципу обратной связи активация сигнализации от NOTCH блокирует экспрессию генов VEGFR2 и NRPs в stalk клетках. Помимо VEGFR2 tip клетки экспрессируют рецептор VEGFR3, который участвует в формировании филоподий и ламеллоподий в tip клетке.
Соседние stalk клетки делятся и формируют стенки растущего сосуда, в этом процессе важную роль играют такие факторы как, Notch-регулируемый белок, содержащий анкириновые повторы (NRARP), белки Wnt сигнального пути, плацентарный фактор роста (PlGF) и FGF [Carmeliet and Jain, 2011]. В отличие от D114 другой лиганд NOTCH- JAGGED 1 экспрессируется только в stalk клетках и поддерживает фенотип этих клеток. Некоторые другие сигнальные пути, в том числе и Wnt/p-катенин путь также участвуют в регуляции экспрессии D114 в tip клетке на уровне транскрипции генов (Рисунок 1.3 и Рисунок 1.4) [Quaegebeur et al., 2011].
В процессах более тонкой регуляции и поддержания специализированного состояния также участвует VEGFR1: VEGFR1 присутствует в tip клетках в небольшом количестве в трансмембранной форме, а в stalk клетках в основном представлен растворимой формой и служит ловушкой для VEGF, что блокирует специализацию последних в tip клетках [DeSmet et al., 2009]. Нейропилины (NRP1 и NRP2) также играют важную роль при ангиогенезе. NRPs в эндотелиальных клетках выступают либо как ко-рецепторы VEGFR (VEGFR1, 2, 3) и участвуют в морфогенезе и ветвлении сосудов, либо как рецепторы Семафоринов (Sema3), регулируя траекторию роста сосудов за счет отталкивания и подавления миграции эндотелиальных клеток в область с высокой концентрацией Sema3 [DeSmet et al., 2009]. Добавление антител против NRP1, которые связываются только с VEGF, но не связываются с Sema3, не влияет существенно на морфогенез сосудов в эмбриогенезе [Geretti et al., 2008]. Однако Sema3 играет важную роль при опухолевом росте и является перспективной мишенью для подавления опухолевого неоангиогенеза и метастазирования. Генетические исследования показали, что в отсутствие NRP1 формирующиеся в заднем мозге сосуды не ветвятся, а сливаются с формированием дефектного сосудистого сплетения; блокирование процесса связывания VEGF с NRP1 препятствует дальнейшему ремоделированию этого сплетения и формированию функционально зрелой сосудистой сети [Geretti et al., 2008]. Дефекты ветвления сосудов и образование аберрантной сосудистой сети в отсутствии NRP1 вызваны нарушением формирования латеральных филоподий, которые важны для изменения направления миграции tip клетки в момент поворота и слияния растущих по направлению друг к другу сосудов (Рисунок 1.3 и Рисунок 1.4) [Geretti et al., 2008].
Создание аденовирусных конструкций для трансдукции эндотелиальных клеток HUVEC
Липопротеиды низкой плотности (ЛНП) представляют собой макромолекулярные комплексы и служат для транспорта холестерина и триглицеридов к периферическим тканям в организме. Известно, что повышенный уровень ЛНП в плазме крови служит фактором риска развития атеросклероза, так как приводит к накоплению холестерина в сосудистой стенке [Goldstein et al., 1985]. Перенос ЛНП происходит путем рецептор-опосредованного эндоцитоза, в котором участвует «классический» апо В, Е рецептор [Brown and Goldstein, 1986]. Существуют данные, полученные в нашей и других лабораториях, о том, что ЛНП способны влиять на функциональную активность целого ряда клеток, причем эти эффекты не связаны с эндоцитозом ЛНП [Block et al., 1988; Buhler et al., 1991; Bochkov et al., 1991]. Характерными чертами таких эффектов являются их быстрота и обратимость. Для их развития не требуется длительная преинкубация клеток с липопротеидами, необходимая для изменения внутриклеточного содержания липидов. В частности, было показано, что липопротеиды активируют макрофаги [Kelley et al., 1988], вызывают изменение формы и агрегацию тромбоцитов, секрецию сурфактанта альвеолоцитами [Voyno-Yasenetskaya et al., 1993], миграцию и пролиферацию ГМК в сосудистой стенке [Resink et al., 1995], регулируют тонус сосудов и оказывают ряд других эффектов на клетки крови и сосудистой стенки [Block et al., 1988; Sachinidis et al., 1990]. Такие эффекты сходны с действием гормонов и медиаторов, и поэтому было предложено называть их «гормоноподобными» [Block et al., 1988].
Ряд данных позволяет предположить, что в основе «быстрых» клеточных эффектов липопротеидов лежит активация систем внутриклеточной сигнализации. В пользу этой гипотезы свидетельствуют данные о способности липопротеидов активировать фосфолипазу С и фосфоинозитидный обмен, повышать уровень цитоплазматического Ca2+, а также влиять на активность аденилатциклазы, изменять рН цитоплазмы и стимулировать фосфорилирование специфических клеточных белков [Block et al., 1988; Bochkov et al., 1991; Matsumura et al., 1997; Honda et al., 1999].
В нашей лаборатории было показано, что ЛНП стимулируют фосфоинозититидный обмен, активируют фосфолипазу С и вызывают мобилизацию внутриклеточного Ca2+ в ГМК клетках [Bochkov et al., 1993].
В отличие от хорошо изученного «метаболического» действия ЛНП, опосредуемого апо В,Е-рецептором, механизмы «гормоноподобных» эффектов неизвестны. Характерной особенностью «гормоноподобных» эффектов, вызываемых ЛНП, является их быстрота, насыщаемость и обратимость, что свидетельствует об участие специфического рецептора в передаче сигнала от ЛНП внутрь клетки, однако ни природа предполагаемого рецептора, ни механизмы его сопряжения с системами вторичных посредников до конца не выяснены.
Ранее в нашей лаборатории был обнаружен атипичный участок специфического связывания ЛНП на культивируемых ГМК сосудов [Bochkov et al., 1994]. Классический анализ связывания меченных ЛНП с мембранами ГМК сосудов показал, что ГМК в основном экспрессируют низкоаффинный участок специфического связывания ЛНП с Кd 40-50 мкг/мл, в то время как «классический» имеет Кd 1-2 мкг/мл [Tkachuk et al, 1994].
Связывание ЛНП с мембранами ГМК оказалось специфичным для ЛНП (как для нативных, так и модифицированных), Ca2+-зависимым, нечувствительно к присутствию полианионов, поликатионов и антител к апо В, Е рецептору [Bochkov et al., 1994; Bochkov et al., 1996; Tkachuk et al, 1994; Kuzmenko et al, 1994; Tkachuk et al, 1998]. Коклюшный токсин ингибировал ЛНП-зависимую мобилизацию Ca2+ и активацию фосфоинозитидного обмена в культивируемых ГМК сосудов, что свидетельствовало об участие G-белков (Go или Gi) в передачи сигнала от ЛНП-рецептора к системе вторичных посредников и об отличие этого связывания от связывания с «классическим» рецептором ЛНП.
Для изучения природы этого атипичного участка связывания в нашей лаборатории был использован метод лигандного блоттинга, который ранее был успешно применен для характеристики других рецепторов ЛНП. Используя мембраны ГМК, выделенных из медии аорты человека, были выделены, очищены и охарактеризованы два белка р105 и р130 кДа. Анализ лигандной селективности и чувствительности к различным ингибиторам показал, что р105/р130 является новым ЛНП-связывающим белком, отличным от всех известных липопротеид-связывающих белков и рецепторов [Bochkov et al., 1996]. Параметры связывания меченных ЛНП с белками р105/р130 совпадают с параметрами ЛНП-опосредованной активации систем вторичных посредников [Tkachuk et al, 1994; Tkachuk et al, 1998, Kuzmenko et al, 1994; Stambolsky et al., 1999]. Сиквенирование очищенных форм р105/р130 показало, что последовательность этих белков соответствует последовательности Т-кадгерина, причем р105 представляет собой зрелую форму, а р130 – предшественник, содержащий пропептид [Tkachuk et al, 1998]. Связывание Т-кадгерина с ЛНП ингибируется антителами против ЛНП (антитела против апо В белка) [Bochkov et al., 1996].
Таким образом, был получен ряд данных, позволяющих предположить, что Т-кадгерин, являясь атипичным представителем семейства кадгеринов, возможно, представляет собой предполагаемый сигнальный» ЛНП-рецептор [Tkachuk et al, 1994; Tkachuk et al, 1998; Kuzmenko et al, 1994]. ЛНП не является единственным лигандом для Т-кадгерина. Оказалось, что высокомолекулярные комплексы адипонектина также являются специфичными лигандами Т-кадгерина [Hug et al., 2004]. Адипонектин (30-кДа белок адипоцитов, родственный комплементу) является цитокином, продуцируемым жировой тканью. Этот белок представляет собой уникальный адипоцитарный гормон, который регулирует обмен липидов и глюкозы [Brakenhielm et al., 2004]. Его уровень заметно снижается в плазме крови пациентов с метаболическим синдромом, ожирением, диабетом II и атеросклерозом. Кроме того, адипонектин способен подавлять рост сосудистых клеток и тем самым препятствовать ремоделированию артериальной стенки. Так, инактивация гена адипонектина стимулирует формирование неоинтимы у мышей при экспериментальном повреждении артерий [Parker-Duffen et al., 2013; Parker-Duffen and Walsh, 2014]. По-видимому, в сосудистой стенке адипонектин обладает защитным антиатерогенным действием. В пользу этого предположения свидетельствует способность этого фактора препятствовать связыванию ЛНП с протеогликанами и их накоплению в артериальной стенке [Kobayashi et al., 2005]. Кроме того, адипонектин предотвращает формирование атеросклеротических поражений у мышей с инактивированным геном аро Е [Okamoto et al., 2002]. Помимо Т-кадгерина, существуют еще два мембранных рецептора адипонектина, AdipoRl и AdipoR2, с отдаленной гомологией к 7-доменным рецепторам, сопряженным с G-белками [Hug et al., 2004]. В отличие от AdipoRl и AdipoR2, Т-кадгерин, играет роль рецептора высокомолекулярных изоформ адипонектина, специфичного для сосудистой стенки и сердца [Hug et al., 2004; Parker-Duffen and Walsh, 2014]. Механизмы взаимодействия адипонектина и Т-кадгерина, а также внутриклеточные сигнальные пути, опосредующие эффекты такого связывания, по-прежнему остаются невыясненными, а данные литературы местами противоречивы.
Выявление сосудов в Матригеле с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания
Меланоциты – это специальные пигментированные клетки, которые располагаются в коже, внутреннем ухе, пигментированной части эпителия сетчатки глаза, а также сосудистого слоя глаз. В коже меланоциты располагаются в базальном слое (stratum basale) эпидермиса и в волосяных фолликулах [Gray-Schopfer et al., 2001]. Меланоциты продуцируют меланин, обуславливающий цвет кожи и волос, и выполняющий защитную функцию базальных кератиноцитов от ультрафиолета [Gray-Schopfer et al., 2001]. Во время воздействия ультрафиолетовых лучей кератиноциты продуцируют растворимые факторы, которые, наряду с межклеточными контактами, контролируют пролиферацию, дифференцировку и миграцию меланоцитов [Gray-Schopfer et al., 2007]. В то же время, меланоциты являются предшественниками одной из самых опасных форм рака – меланомы.
Появляющаяся как доброкачественный невус, меланома может быстро прогрессировать в злокачественную стадию [Bar-Eli and Luca, 1998]. При этом меланоциты формируют невус, начинают пролиферировать и мигрировать либо только в эпидермисе, либо глубже, проникая в дерму [Gray-Schopfer et al., 2001]. Невусы могут прогрессировать и формировать меланому, для которой характерно внутриэпидемальное распространение со спорадической микроинвазией в подлежащую дерму (фаза радиального роста). Меланома в фазе радиального роста может трансформироваться в вертикально растущую меланому (фаза вертикального роста) с высоким инвазивным потенциалом. В конечном счете, меланома после фазы вертикального роста может прогрессировать и формировать метастазы [Clark et al., 1984; Milleret al., 2006]. Описаны несколько клинических типов меланомы: поверхностно растущая меланома, нодулярная меланома, акральная лентигинозная меланома, и меланома сосудистой оболочки глаза [Clark et al., 1984; Ishihara et al., 2001; Kuchelmeister et al., 2000].
Исходно меланоциты кожи происходят из клеток нервного гребня, мигрируют в вентральном направлении от нервной трубки через сомиты. Известно, что ключевую роль в миграции предшественников меланоцитов из нервной трубки играет регуляция экспрессии и активности различных кадгеринов (Е-кадгерин, N-кадгерин), а также N-CAM в зоне формирующегося нервного гребня (Nakagawa and Takeichi, 1998).
В нормальной коже базальные кератиноциты образуют с меланоцитами множественные Е-кадгерин-содержащие адгезивные контакты, что позволяет им контролировать пролиферацию и правильное расположение меланоцитов в коже [Haas and Herlyng, 2005; Haass et al., 2005]. Потеря экспрессии Е-кадгерина является одним из ранних событий в опухолевой прогрессии меланомы и коррелирует с увеличением экспрессии N 191 кадгерина, что повышает ее инвазивный потенциал [Johnson, 1999; Hsu et al., 1996; Hsu et al., 2000; Mc Gary et al., 2002; Li et al., 2002; Haass and Herlyn, 2005]. Предполагается, что клетки меланомы формируют N-кадгериновые адгезивные контакты с фибробластами стромы, эндотелиальными клетками сосудов и соседними клетками меланомы. N-кадгерин-содержащие контакты позволяют клеткам меланомы ползти по дермальным фибробластам и трансмигрировать через стенки сосудов в кровь [Li and Herlyn, 2000]. Было показано, что VE-кадгерин также играет важную роль в инвазии клеток меланомы и метастазировании [Voura et al., 1998 Hendrix et al., 2001; Hendrix et al., 2003]. В норме VE-кадгерин экспрессируется исключительно в эндотелиальных клетках и обеспечивает барьерную функцию эндотелия [Dejana, 1996]. Однако клетки агрессивных форм меланомы кожи и сосудистой оболочки глаза также могут экспрессировать VE-кадгерин, что облегчает их взаимодействие с эндотелиальными клетками и инвазию в просвет сосуда [Hendrix et al., 2001]. Экспрессия VE-кадгерина лежит в основе явления сосудистой мимикрии, при которой клетки меланомы сами формируют характерную сеть сосудистых каналов и обеспечивают опухоль питательными веществами и кислородом [Hendrix et al., 2001; Hendrix et al., 2003].
В то время как зрелые меланоциты экспрессируют Т-кадгерин [Kuphal et al., 2009; Bosserhoff et al., 2011], предшественники меланоцитов, клетки нервного гребня его не экспрессируют. Экспрессия Т-кадгерина также снижена в меланоцитах, которые де-дифференцируются в меланобластоподобные клетки в культуре, а также не определяется примерно в 80% клеточных линий меланомы человека [Kuphal et al., 2009; Bosserhoff et al., 2011]. В то время как Т-кадгерин экспрессируется в доброкачественных невусах, его экспрессия не обнаруживается в большинстве образцов ткани первичной меланомы человека, метастазах меланомы в лимфатические узлы и внутренние органы, что указывает на возможную роль Т-кадгерина в прогрессии меланомы [Kuphal et al., 2009]. Кроме того, экспрессия Т-кадгерина путем стабильной трансфекции в клетках меланомы человека приводит к замедлению роста опухоли и уменьшению миграционной и инвазивной способности этих клеток у бестимусных мышей линии NUDE (Kuphal et al., 2009). Однако в 20% клеточных линий меланом человека по-прежнему сохраняется экспрессия Т-кадгерина на значительном уровне [Kuphal et al., 2009; Bosserhoff et al., 2011], и эти клеточные линии обладают высоким инвазивным и метастатическим потенциалом, что показано на моделях in vitro и in vivo. Эти данные свидетельствует о том, что, возможно, роль Т-кадгерина в опухолевом росте и прогрессии меланомы сложнее, чем первоначально предполагалось.
Для изучения роли Т-кадгерина в опухолевом росте и прогрессии меланомы, в настоящей работе мы проведи сравнительный анализ экспрессии Т-кадгерина в меланоцитах кожи человека в норме, в клетках меланомы и в кровеносных сосудах образцов первичных меланом и метастазов, полученных от больных. В дальнейшем было проведено исследование для выявления роли Т-кадгерина в опухолевой прогрессии меланомы на экспериментальных моделях.
В образцах нормальной кожи Т-кадгерин экспрессируется в базальных кератиноцитах, дифференцирующихся кератиноцитах, в клетках стромы, в сосудах подлежащей дермы и во всех меланоцитах разной степени зрелости (Рисунок 3.23).
Иммунофлуоресцентное окрашивание антителами gp100 свидетельствует о том, что дифференцирующиеся меланоциты локализованы рядом со слоем базальных кератиноцитов эпидермиса, а отростки меланоцитов располагаются над кератиноцитами (Рисунок 3.24). Экспрессию Т-кадгерина в дифференцирующихся меланоцитах выявляли двойным иммунофлуоресцентным окрашиванием (gp100 и Т-кадгерин) и наложением зеленой и красной флуоресценции (Рисунок 3.24). Сопоставление фазово-контрастного изображения и двойного флуоресцентного окрашивания показало, что зрелые меланоциты, не экспрессирующие gp100, экспрессируют Т-кадгерин.
Поскольку ранее проведенные исследования показали, что при опухолевой прогрессии экспрессия Т-кадгерина может снижаться или отсутствовать, мы проанализировали экспрессию Т-кадгерина в образцах первичной меланомы (Рисунок 3.25) и в метастазах (Рисунок 3.26), причм один из исследованных образцов как первичной опухоли, так и метастазов через несколько месяцев после первичного забора биопсии был получен у одного и того же пациента. Окрашивание тканей с последующим анализом изображений показало, что, в случае первичной меланомы человека 60% срезов содержали клетки меланомы, равномерно экспрессирующие Т-кадгерин (Рисунок 3.27). При этом 30% срезов содержали области с гетерогенным, мозаичным паттерном экспрессии Т-кадгерина, где некоторые клетки меланомы экспрессируют Т-кадгерин, а некоторые нет; на оставшихся 10% срезов клетки меланомы не экспрессировали Т-кадгерин.
Влияние экспрессии Т-кадгерина на распределение клеток клонов B16F10 по фазам клеточного цикла in vitro
Известно, что не только экспрессия VE-кадгерина, но его правильная локализация на мембране и целостность VE-кадгериновых адгезивных контактов необходимы для поддержания барьерной функции эндотелия [Vestweber, 2008; Komarova and Malik, 2010]. Мы предположили, что Т-кадгерин может регулировать проницаемость эндотелия, изменяя экспрессию и/или локализацию VE-кадгерина в клетках. Экспрессию VE-кадгерина в контрольных клетках (control), гиперэкспрессирующих Т-кадгерин (T-cad), а также в клетках после подавления экспрессии Т-кадгерина (si-Т-cad) оценивали вестерн блоттингом и последующим денситометрическим анализом. При этом оценку экспрессии VE-кадгерина проводили как в общем лизате клеток, так и в субклеточных фракциях (Рисунок 3.76 А). Локализацию VE-кадгерина выявляли методом иммунофлуоресцентной окраски клеток антителами к VE-кадгерину с последующим анализом на конфокальном микроскопе (Рисунок 3.77). Было обнаружено, что через 72 ч после трансдукции HUVEC содержание VE-кадгерина в общем лизате в Т-cad клетках достоверно снижено по сравнению с контролем (control) и si-Т-cad (Рисунок 3.76 А, верхняя панель и Рисунок 3.76 Б). Для того чтобы оценить содержание VE-кадгерина в цитоплазме, клетки перед лизированием обрабатывали трипсином согласно протоколу, описанному в разделе Материалы и методы. При трипсинизации клеток происходит разрушение и/или удаление мембранно-связанных поверхностных белков, в частности VE-кадгерина, в то время как внутриклеточный пул VE-кадгерина остатся интактным [Xiao et al., 2003]. Кроме того, содержание VE-кадгерина было проанализировано в клеточных фракциях после разделения с использованием коммерческого набора Qproteome Cell Compartment kit. Было обнаружено, что при гиперэкспрессии Т-кадгерина происходит небольшое снижение содержания VE-кадгерина на мембране (Рисунок 3.76 Г), и увеличение его содержания в цитоплазме (Рисунок 3.76 А, В, Д) по сравнению с содержанием VE-кадгерина в контрольных клетках (control) и в клетках с подавленной экспрессией Т-кадгерина (si-cad) (Рисунок 3.76). Напротив, в клетках с подавленной экспрессией Т-кадгерина (si-Т-cad) содержание VE-кадгерина увеличивается в мембранной фракции (мембр. фракц на Рисунок 3.76 А), и значительно снижается в цитоплазматической фракции. Денситометрический анализ полученных изображений подтвердил данные вестерн блоттинга (Рисунок 3.76 Б-Д). Полученные результаты свидетельствуют о том, что повышенная экспрессия Т-кадгерина вызывает уменьшение содержания VE-кадгерина в мембранах клеток, в то время как подавление экспрессии Т-кадгерина, наоборот, приводит к увеличению локализации VE-кадгерина на мембране клеток.
Гиперэкспрессия Т-кадгерина в эндотелиальных клетках вызывает накопление VE-кадгерина в цитоплазме. (А) Экспрессию VE-кадгерина в эндотелиальных клетках (Т-cad, si-Т-cad или контрольных control) определяли методом вестерн блоттинга с последующим денситометрическим анализом (Б-Д). Чтобы различить поверхностный и внутриклеточный пул VE-кадгерина, мембранный VE-кадгерин протеолитически удаляли обработкой клеток трипсином. Гиперэкспрессия Т-кадгерина (T-cad) вызывает увеличение содержания внутриклеточного VE-кадгерина (цитопл. фракц) по сравнению с контролем (control). В клетках с подавленной экспрессией Т-кадгерина (в si-Т-кад) содержание внутриклеточного VE-кадгерина снижено по сравнению с контролем. Субклеточное фракционирование подтвердило уменьшение содержания VE-кадгерина в мембране (мембр. фракц) и увеличение его в цитоплазме Т-cad клеток. В si-Т-кад клетках количество VE-кадгерина значительно увеличивалось в мембранной фракции и практически не определялось в цитозольной. Данные нормированы по уровню GAPDH. Представлен воспроизводимый результат гистограммы денситометрического анализа трх независимых экспериментов (N=3, р 0,05). Результаты подтверждали денситометрическим анализом (Б, В Г, Д), данные нормировали по содержанию GAPDH.
Для визуализации локализации VE-кадгерина в клетках была проанализирована его экспрессия в зоне межклеточных контактов с помощью двойной иммунофлуоресцентной окраски антителами против Т-кадгерина и VE-кадгерина. Окрашивание эндотелиальных клеток с различной экспрессией Т-кадгерина проводили без пермеабилизации для сохранения целостности цитоплазматических мембран. Анализ полученных изображений осуществляли на конфокальном микроскопе при одинаковых настройках интенсивности лазера и времени экспозиции. При этом было обнаружено, что при гиперэкспрессии Т-кадгерина в HUVEC происходит нарушение VE-кадгериновых адгезивных контактов: в клетках Т-cad окрашивание VE-кадгерина в мембранах неравномерное и носит сетчатый характер. Исчезновение VE-кадгерина из зон межклеточных контактов сочетается с формированием щелей или промежутков между клетками (стрелки на Рисунке 3.77), в то время как в случае si-Т-cad клеток щелей в зоне адгезивных VE-кадгериновых контактов между клетками не обнаружено. Напротив, подавление нативной экспрессии Т-кадгерина приводит к утолщению зоны VE-кадгериновых контактов, что согласуется с предыдущими данными Вестерн блоттинга и денситометрии (Рисунок 3.76 Б).
Помимо анализа состояния VE-кадгериновых адгезивных контактов в качестве контроля была проведена оценка влияния экспрессии Т-кадгерина на экспрессию и локализацию N-кадгерина и белков, участвующих в формировании плотных контактов в эндотелиальных клетках. Согласно данным Вестерн блоттинга экспрессия Т-кадгерина не оказывает влияния на экспрессию и/или локализацию N-кадгерина в различных клеточных компартментах, а также на уровень экспрессии белков, участвующих в формировании плотных контактов, таких как окклюдина, клаудина-5 и ZO-1 (Рисунок 3.78 A, Б).
Гиперэкспрессия Т-кадгерина в эндотелиальных клетках вызывает разборку адгезивных контактов. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание эндотелиальных клеток осуществляли антителами против Т-кадгерина (зеленая флуоресценция) и VE-кадгерина (красная флуоресценция). Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа при одинаковых настройках интенсивности лазера и времени экспозиции. Ядра клеток окрашены DAPI (синяя флуоресценция). Стрелками указаны щели в зоне VE-кадгериновых адгезивных контактов. Окрашивание VE-кадгерина в зоне межклеточных контактах в Т-сad клетках значительно слабее, чем в контрольных и si-cad клетках. Масштаб- 20 мкм.
Т-кадгерин не влияет на экспрессию N-кадгерина, окклюдина, клаудина-5 и ZO-1 в эндотелиальных клетках. (A) Экспрессию и мембранную локализацию N-кадгерина анализировали методом Вестерн блоттинга с использованием антител против N-кадгерина. Для сравнения содержания N-кадгерина на поверхности мембраны и в цитоплазме оценивали количество N-кадгерина в общих лизатах и в лизатах после трипсинизации. (B) Экспрессия окклюдина, клаудина-5 и ZO-1 анализировалась Вестерн блоттингом. Данные нормированы по уровню GAPDH. Control – эндотелиальные клетки, трансдуцированные контрольным лентивирусом, T-cad -эндотелиальные клетки, трансдуцированные лентивирусом для гиперэкспрессии Т-кадгерина, si-cad - эндотелиальные клетки, трансдуцированные лентивирусом для подавления экспрессии Т-кадгерина. Представлен воспроизводимый результат трх независимых экспериментов.
Таким образом, полученные результаты позволяют сделать предположение, что увеличение экспрессии Т-кадгерина в эндотелиальных клетках приводит к селективному снижению общего содержания VE-кадгерина в клетках, при этом большая часть VE кадгерина обнаруживается не на мембране клеток, а в цитоплазме, что сопровождается нарушением межклеточных контактов и формированием промежутков между эндотелиальными клетками и, как следствие, повышением проницаемости эндотелиального монослоя. Подавление экспрессии Т-кадгерина вызывает противоположные эффекты – увеличение содержания VE-кадгерина на мембране и уменьшение его в цитоплазматической фракции, формирование более прочных адгезивных контактов по сравнению с контролем и с Т-кадгерин-экспрессирующими клетками. Мы предположили, что экспрессия Т-кадгерина повышает проницаемость эндотелия, вызывая интернализацию VE-кадгерина путм эндоцитоза с его последующей деградацией в цитоплазме.
По данным ряда исследований, основным путм интернализации VE-кадгерина является клатрин-зависимый путь [Xiao et al., 2003a; Xiao et al., 2003b; Xiao et al., 2005; Gavard and Gutkind, 2006]. Для того чтобы проверить гипотезу о том, что повышенная экспрессия Т-кадгерина приводит к клатрин-зависимому эндоцитозу VE-кадгерина, был использован метод двойного иммунофлуоресцентного окрашивания для выявления возможной ко-локализации VE-кадгерина и клатрина. Изображения высокого разрешения были получены с помощью конфокального микроскопа при одинаковых настройках интенсивности лазера и времени экспозиции.
Как показано на Рисунке 3.79, в Т-кадгерин гиперэкспрессирующих клетках VE-кадгерин ко-локализуется с клатрином на поверхности эндотелиальных клеток (клатрин-позитивные участки окрашивания указаны белыми стрелками на Рисунке 3.79 и вынесены в отдельную панель снизу), а также в цитоплазме; в то время как в контрольных клетках и клетках после подавления экспрессии Т-кадгерина ко-локализация VE-кадгерина и клатрина менее выражена. Данные иммунофлуоресцентного окрашивания подтверждены денситометрическим анализом (Рисунке 3.79 Б).