Введение к работе
Ядрышко - это структура, возникающая в интерфазных ядрах клеток эукариотов в результате транскрипционной активности ри-босомных генов, кодирующих 18S, 28S и 5.8S рРНК. В составе ядрышка, в соответствии с современной терминологией, выделяют несколько* структурных компонентов: фибриллярные центры (ФЦ). плотный фибриллярный компонент (ПФК). гранулярный компонент, ядрышковые вакуоли и ассоциированный с ядрышком хроматин (Jordan,1984). Ультраструктурная организация компонентов ядрышка, их судьба на разных стадиях клеточного цикла изучены достаточно подробно (Goessens. 1984: Hadjiolov,1985; Hozak et al.. 1986; Челидзе, Зацепина, 1988; Scheer et al.. 1993). В последнее время достигнут значительный прогресс в изучении специфических ядрышковых белков (Olson. 1990; Hernandez-Verdun. 1991).
Однако до сих пор остается открытым вопрос о локализации внутри ядрышка транскрибирующихся рибосомных генов (Jordan. 1991). Не установлены локализация и функции большинства ядрышковых белков. Остаются не выясненными закономерности нуклеоло-генеза, происходящего после деления клетки (Sheer. Welsenberger, 1994). Трудности, возникающие при изучении этих вопросов, отчасти обусловлены плотной упаковкой материала ядрышка и тесной пространственной взаимосвязью его структурных компонентов.
Удобным методическим подходом для изучения компактных клеточных структур (например, митотических хромосом) является обработка живых клеток растворами низкой ионной силы (Бураков и др., 1980; Зацепина и др., 1988; Киреев и др.. 1988). Предварительные данные показывают, что гипотоническая обработка приводит также к значительному разрыхлению материала ядрышек в лимфоцитах человека (Hozak et al.. 1990).
Однако, не исключено, что экспериментальные воздействия, вызывающие искусственную^ декомпактизацию клеточных структур, могут приводить к возникновению артефактных изменений. Одним из критериев, позволяющих оценить физиологичность применяемого воздействия, является обратимость вызываемых им изменений. В данной работе использовался именно такой подход.
Целью настоящей работы было исследование поведения ядрышка и его структурных компонентов (фибриллярных центров, плотного фибриллярного компонента, гранулярного компонента) в культиви-
- 2 -руемых in vitro клетках под действием гипотонии, а также после прекращения гипотонической обработки.
В работе были поставлены следующие задачи:
-
Изучить изменения структуры, белкового состава и функциональной активности ядрышек живых клеток, происходящие под действием гипотонической обработки.
-
Исследовать обратимость этих изменений и динамику восстановления (реконструкции) ядрышек после прекращения гипотонического воздействия .
3. Сравнить процесс восстановления ядрышек после их
искусственной декомпактизации с динамикой
естественного нуклеологенеза. происходящего во время митоза.
Научная новизна и практическое значение работы. Полученные в работе данные представляются важными для понимания взаимодействия индивидуальных компонентов в составе ядрышка. Показано, что действие раствора низкой ионной силы приводит к выходу большей части гранул из ядрышка и пространственному разобщению фибриллярных центров и плотного фибриллярного компонента. Использованная методика гипотонической обработки может быть рекомендована для выделения ФЦ и ПФК в виде отдельных фракций. Получены данные, говорящие об отсутствии синтеза рРНК в условиях гипотонического шока.
Показано, что изменения структуры и функциональной активности ядрышка, происходящие под действием гипотонического раствора . являются полностью обратимыми. Реконструкция ядрышек после снятия гипотонического воздействия происходит как за счет синтеза de novo, так и за счет материала "исходного" ядрышка. Процесс реконструкции ядрышек сопровождается образованием в кариоплазме многочисленных РНП-содержащих включений (проядрышко-подобных телец), которые по своей ультраструктуре, белковому составу, реакции на действие актиномицина Д соответствуют предъядрышкам нормального митоза. Реконструкция ядрышек после прекращения гипотонической обработки в основном повторяет процесс формирования ядрышек, происходящий в телофазе митоза, и может использоваться в качестве экспериментальной модели нуклеологенеза. Предложенная модель предоставляет возможность провести выделение в виде отдельной фракции проядрышкоподобных те-
- з -лец. формирующихся в интерфазных клетках после прекращения действия гипотонии, что позволит получить более полную информацию об их биохимическом составе и функциях.
На основании собственных и литературных данных предложены схемы, иллюстрирующие реорганизацию структуры ядрышка и поведение белка В23 при обратимом действии раствора низкой ионной силы.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 13 Европейской конференции по организации клеточного ядра (Венгрия,1993); на 4 Европейском конгрессе по клеточной биологии (Прага,Чехия,1994); на 5 Европейском конгрессе по клеточной биологии (Хайдельберг,Германия,1995), а также на ряде семинаров в НИИ физ-хим. биологии им.А.Н.Белозерского МГУ.