Структурно-функциональная характеристика нейронов спинномозговых узлов при раневом процессе Фетисов Сергей Олегович

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Структурно-функциональное состояние спинномозговых узлов в норме и при повреждении тканей в зоне их иннервации 15

1.1. Современное представление о морфологии спинномозговых узлов на светооптическом уровне 15

1.2. Представления о реакции нейронов спинномозговых узлов на наличие травмы периферических отростков различного генеза 20

1.3. Участие чувствительных нейронов спинномозговых узлов в процессах тканевой регенерации 27

1.4. Реакция глиального компонента на повреждения в зоне иннервации спинномозговых узлов 30

Глава 2. Материал и методы исследования 32

2.1. Общая характеристика материала 32

2.2. Моделирование раневого процесса и экспериментальные воздействия 33

2.3. Методы гистологической и морфометрической обработки 34

2.4. Методы статистического анализа 38

Глава 3. Морфологическая характеристика нейронов спинномозговых узлов 39

3.1. Характеристика популяции нейронов при интактной коже и динамика их размеров при различных видах течения раневого процесса и видах воздействия 39

3.2. Динамика тинкториальных свойств нейронов и соотношения субпопуляций клеток с обратимыми и необратимыми изменениями в зависимости от вида воздействия и типа течения раневого процесса 56

3.3. Динамика размеров ядер и изменение количества ядрышек в субпопуляциях нейронов в зависимости от вида воздействия и типа течения раневого процесса

3.4. Динамика ядерно-цитоплазматического индекса в субпопуляциях нейронов в зависимости от вида воздействия и типа течения раневого процесса 85

Глава 4. Гистохимические изменения в субпопуляциях нейронов в зависимости от вида воздействия и типа течения раневого процесса 90

4.1. Выявление РНК в субпопуляциях нейронов 90

4.2. Выявление суммарного белка в субпопуляциях нейронов 103

Глава 5. Реакция глиального компонента в спинномозговых узлах в зависимости от вида воздействия и типа течения раневого процесса 114

Глава 6. Обсуждение результатов исследования 122

Заключение 142

Выводы 144

Список литературы

• Представления о реакции нейронов спинномозговых узлов на наличие травмы периферических отростков различного генеза
• Методы гистологической и морфометрической обработки
• Динамика размеров ядер и изменение количества ядрышек в субпопуляциях нейронов в зависимости от вида воздействия и типа течения раневого процесса
• Выявление суммарного белка в субпопуляциях нейронов

Введение к работе

Актуальность темы. Одной из актуальных задач современной медико-биологической науки является изучение ответных морфологических реакций различных элементов нервной системы на процессы, сопровождающие нарушение целостности покровных тканей организма. Актуальность подобных работ связана с высокой распространенностью воздействия различных травматизирующих факторов внешней среды на жизнедеятельность различных биологических объектов. Комплекс реакций со стороны нервной системы особо интересен для специалистов в области клинической медицины, учитывая необходимость выбора оптимальной тактики применения местных санационных воздействий, что особо актуально в связи с существенным расширением арсенала методов региональной терапии.

Известен широкий ряд работ, посвященных изучению реакций нейронов спинномозговых узлов (СМУ) на травматическое повреждение их периферических окончаний (Ермолин И.Л., 2006; Порсева В.В., 2012; Fukai T .et al., 2005; Shaible H.G. et al., 2005; Ogawa R., 2011; Cheret J. et al., 2014). При этом установлено, что помимо передачи афферентной информации в вышележащие отделы нервной системы, имеется определенное эфферентное влияние со стороны нейронов на иннервируемые ткани.

Комплекс указанных периферически направленных по отношению к нейронам СМУ реакций обеспечивается за счет совокупности эффектов, обусловленных выделением ряда биологически активных веществ, поступающих в ткани с аксоплазматическим током и действующих на периферические мишени: различные популяции клеток иммунной системы, тучные клетки, клетки сосудистой стенки. Такие воздействия могут в определенной степени обусловливать локальную воспалительную реакцию, описываемую как «нейрогенное воспаление». Большая роль уровня активности нервной системы для развития данного комплекса реакций была подтверждена в ряде экспериментальных работ, в том числе посвященных изменению процессов репарации кожных ран при денервации или повреждении спинного мозга (Ansel J. et al., 1996; Rook J., 2007; Chen Y. et al., 2014; Huang et al., 2014).

С другой стороны, в ряде исследований был выявлен определенный спектр реакций, проявлявшихся в изменении морфологии нейронов и касавшихся как изменения их стереометрических характеристик и тинкто-риальных свойств, так и изменения метаболических процессов в нервных клетках, оценивавшихся с помощью гистохимической и иммуногистохи-мической техник (Душкова З.Г., 2004; Navarro X. et al., 2007; Hart A.M. et al., 2008; He S.-Q. et al., 2010).

Отдельный ряд исследований показал наличие тесной взаимосвязи между структурно-функциональными изменениями нейронов СМУ и реакцией их глиального окружения, что достаточно однозначно связы-

валось со значительным влиянием сателлитных глиоцитов на трофику нейронов (Архипова С.С. и др., 2009; Pannese E. et al., 2003; Elson K. et al., 2004; Hanani M., 2004; Butt A., Verkhratsky A., 2007; Dublin P., 2007). Тем не менее, в доступных литературных источниках недостаточно полно освещены реакции нейронов СМУ, сопровождающие заживление кожных ран в сравнительном аспекте при различных видах течения раневого процесса: асептическом и инфицированном.

Степень разработанности темы исследования. Необходимо отметить, что в настоящее время большую распространенность получают разнообразные методы регионального воздействия на область раневого дефекта (Андреев А.А и др., 2012, 2013; Глухов А.А. и др., 2012). К их числу можно отнести гидроимпульсную санацию как метод физического воздействия (особо актуальный при наличии гнойного процесса в раневом дефекте) или использование обогащенной тромбоцитами плазмы крови (ОТПК) как одного из вариантов таргетной клеточной терапии.

В ряде исследований даётся оценка реакций нейронов разных типов и глиального компонента при использовании различных вариантов тканевой и клеточной терапии для улучшения репарации элементов нервной системы (Челышев Ю.А. и др., 2012; Масгутов Р.Ф. и др, 2013; Гайович В.В., 2014; Cho H.H. et al., 2010; Toledo R.N. et al., 2010). Однако, несмотря на всё возрастающую в настоящее время популярность указанных методов регионального воздействия, морфологическая картина реакций нервной системы при их местном применении для терапии повреждений покровных тканей изучена недостаточно, что и обусловливает актуальность цели настоящего исследования.

Цель исследования – выявить морфофункциональные особенности поясничных спинномозговых узлов L_III-L_V при моделировании септического и асептического течения раневого процесса в условиях спонтанного и стимулированного заживления.

Для достижения поставленной цели, в ходе выполнения работы были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Провести исследование морфологических и морфометрических характеристик нейронов и нейроглии спинномозговых узлов после нанесения раны при асептическом и септическом течении раневого процесса при спонтанном заживлении.

2. Изучить изменения морфофункциональных реакций нейронов и глиальных клеток спинномозговых узлов при раздельном и комбинированном использовании методов регионального воздействия: применения обогащенной тромбоцитами плазмы крови (ОТПК) и гидроимпульсной санации раны (ГИС).

3. Оценить по данным динамического моделирования взаимосвязь морфофункциональных характеристик нейронов и нейроглии спинномозговых узлов, видов течения раневого процесса и применяемого метода региональной терапии.

Научная новизна. Впервые проведено морфофункциональное исследование поясничных спинномозговых узлов L_III-L_V при септическом и инфицированном течении раневого процесса при спонтанном заживлении и после применения обогащенной тромбоцитами плазмы крови и гидроимпульсной санации раны.

Впервые в рамках созданной экспериментальной модели представлены качественные и количественные молекулярно-биологические характеристики субпопуляций нейронов спинномозговых узлов (СМУ) при спонтанном и стимулированном течении раневого процесса в асептических условиях и при внесении инфекции в раневой дефект.

Впервые установлено, что изменения морфологических форм нейронов (А и В) СМУ носили неспецифический характер и демонстрировали фазность реакций: в начальный период преобладали хроматолитические реакции, пикнотические изменения, режим повышенной функциональной активности; затем дистрофические (деструктивные) и компенсаторные гиперпластические реакции; на третьей фазе (с 7-х суток) – преобладание регенераторных процессов над дистрофическими. Следует отметить большую выраженность изменений В-нейронов – их реакции нарастали быстрее и имели большую амплитуду значений.

Впервые по данным планиметрических характеристик нейронов СМУ, иннервирующих область кожи, выявлены особенности реакций нервных клеток в условиях различного типа течения раневого процесса и в сопоставлении с фазами воспаления. Установлена корреляция изменения тинкториальных свойств и морфометрической и гистохимической характеристик нейронов СМУ (по уровню оптической плотности РНК и белка, как маркеров белкового обмена). Показана динамика изменений морфометрических показателей, количества сателлитных глиоцитов и доли многоядрышковых нейронов.

Установлено, что в условиях асептического течения раневого процесса наибольшую эффективность имеет применение обогащенной тромбоцитами плазмы крови, а в условиях инфицированного течения – комплексное применение гидропрессивной санации и обогащенной тромбоцитами плазмы крови.

Впервые на основании комплексного анализа разработан ряд математических моделей, описывающих взаимосвязь планиметрических и гистохимических реакций нейронов, с учетом временного фактора, вида регионального воздействия и типа течения раневого процесса, как категориальных независимых предикторов (динамические и стохастические модели), что позволяет осуществлять рациональный выбор корректирующего воздействия в рамах избранной экспериментальной модели.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты дополняют и расширяют представления о структурных реакциях нейронов спинномозговых узлов в зависимости от типа раневого процесса и при стимуляции заживления. Данные о характеристиках долей нейро-

нов различных субпопуляций, числа многоядрышковых клеток, реакции глиального окружения в зависимости от динамики сокращения раневого дефекта важны для понимания механизмов репарации повреждений.

Применение математического моделирования позволяет выявить специфические паттерны результирующих модели квадратичных поверхностей, находящих отражение в классической тинкториальной характеристике нейронов, что может быть использовано при проведении комплексной оценки реакции спинномозговых узлов при регенерации раны. Полученные в работе данные могут быть использованы для дальнейшей коррекции и адекватной разработки методов регионального воздействия на зону раневого дефекта.

Методология и методы исследования. В работе использованы современные методы сбора и обработки исходной информации. Диссертация основана на результатах морфологического исследования нейронов спинномозговых узлов при асептическом и септическом раневом процессе при спонтанном заживлении и после воздействия обогащенной тромбоцитами плазмы крови и/или гидроимпульсной санации.

Основные положения, выносимые на защиту:

4. Установлена динамика численности субпопуляций нейронов СМУ при различных типах течения раневого процесса (асептическое и инфицированное). Выявлено, что применение различных методов регионального воздействия вносит существенный вклад в изменение числа нейронов в пределах субпопуляций, что может использоваться для косвенной оценки рациональности применения методов региональной стимуляции заживления повреждения.

5. Проведена оценка количественной характеристики долей нейронов различных субпопуляций, числа многоядрышковых клеток, реакции гли-ального окружения в зависимости от динамики сокращения раневого дефекта, что позволяет осуществлять прогноз хроновектора возникновения деструктивных форм нейронов в зависимости от используемой методики местного воздействия на поврежденные ткани.

6. По данным многомерного корреляционного анализа была установлена корреляция между уровнем оптической плотности РНК и белка, ядерно-цитоплазматическим индексом и площадью клетки: при асептическом течении в случае спонтанного заживления и использовании ОТПК выявлено увеличение площади нейронов, оптической плотности и индекса; при инфицированном течении наиболее гармоничное воздействие оказывало применение ГИС+ОТПК, что можно расценивать как наиболее адекватное применения методов регионального воздействия при гнойной форме раневого процесса.

7. Проведенное математическое моделирование выявило наличие специфических паттернов результирующих модели квадратичных поверхностей, находящих отражение в классической тинкториальной характеристике нейронов, что может быть использовано при проведении

комплексной оценки реакции спинномозговых узлов на тяжесть течения раневого процесса при регенерации кожной раны.

Личный вклад автора: весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую практику НИИ экспериментальной биологии и медицины при ГБОУ ВПО «Воронежский государственный медицинский университет имени Н.Н. Бурденко» МЗ РФ. Материалы диссертации используются на лекциях и практических занятиях кафедры анатомии и физиологии ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный педагогический университет» Министерства образования и науки РФ, кафедре гистологии ГБОУ ВПО «Воронежский государственный медицинский университет имени Н.Н. Бурденко» МЗ РФ.

По результатам выполнения работы оформлено одно рационализаторское предложение № 1513 от 15.05.2015 г.

Апробация работы. Основные положения диссертационного исследования доложены и обсуждены на III молодежном инновационном форуме (Воронеж, 2010); заседаниях Воронежского филиала ВНОАГЭ (Воронеж, 2011, 2014); VIII Всероссийской научной конференции «Бабухинские чтения в Орле» (Орел, 2011); II международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, фармакологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2011); III Эмбриологического симпозиума «Югра-Эмбрио-2011» (Ханты-Мансийск, 2011); общероссийской научной конференции «Инновационные медицинские технологии» (Москва, 2011); международной научной конференции «Актуальные вопросы морфологии» (Кишинев, Молдова, 2012); X, XI и XII Конгрессах Международной Ассоциации Морфологов (Ярославль, 2010, Самара, 2012, Тюмень, 2014); на заседании Воронежского филиала Российского хирургического общества (Воронеж, 2012); II межрегиональной научно-практической конференции «Наука – социально-значимые проекты», VII-го молодежного инновационного форума, II научно-практической конференции хирургов «Бурденковские чтения» (Воронеж, 2012); VI Всероссийской конференции молодых ученых «Комплексный подход к диагностике, лечению и профилактике в медицине» (Воронеж, 2013); Всероссийской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы морфологии, адаптогенеза и репаратив-ных гистогенезов», посвященной памяти чл.-корр АМН СССР профессора Ф.М. Лазаренко (Оренбург, 2013); международной научно-практической конференции «Макро-микроскопическая анатомия органов и систем в норме и патологии», посвященной 100-летию дня рождения профессора Ибрагимовой З.И. (Витебск, 2014); научном совещании «Учение о тканях. Гистогенез и регенерация» (Санкт-Петербург, 2015).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 29 научных работ, из них 10 статей – в рецензируемых журналах, рекомендованных

ВАК РФ для публикации результатов диссертационного исследования, и в системе цитирования (библиографической базе) Web of Science.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 169 страницах текста компьютерного набора, состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследований, 3 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, общего заключения, выводов, списка литературы и приложений. Работа содержит 16 таблиц, иллюстрирована 91 рисунком. Список литературы включает 267 источника, в том числе 127 зарубежных.

Представления о реакции нейронов спинномозговых узлов на наличие травмы периферических отростков различного генеза

Исследования характера реактивных изменений в узлах при различных травмах и заболеваниях органов многочисленны (Григорьева Т.А., 1951; Дойников Б.С., 1955; Берсенев В.А.,1980; Варзин С.А., 1996; Сотников О.С., 2001; Kandell E., 2000). Однако при создании классификации разнообразных изменений нервных клеток, возникают определенные трудности, ввиду невозможности выбрать принцип, на основании которого можно было бы построить такую классификацию (Жаботинский Ю.М, 1965).

Широкое распространение получила классификация Шпильмейера, базирующаяся – только на морфологических признаках. Он различает набухание, сморщивание, расплавление, свертывание, инкрустацию, патологические внутриклеточные отложения; однако, многие авторы указывает на ее схематичность и спорность (Челышев Ю.А., 2002; Рагинов И.С., 2006).

Первые работы о ретроградных процессах в нервной системе появились сравнительно давно. Однако наиболее подробно они были изучены Нисслем в 1892 году. Он заметил, что в нейронах лицевого нерва и мотонейронах сегментарных центров спинного мозга после перерезки отмечается увеличение объема нейрона, смещение ядер на периферию и распад или растворение ба-зофильных глыбок рибонуклеопротеидов. Изменения содержания базофиль-ной субстанции в нейроне Ниссль назвал хроматолизом, а всю реакцию, которой отвечает нейрон на повреждение своего аксона – первичным раздражением. Хроматолиз рассматривается как универсальная и наиболее характерная реакция нейронов на самые разнообразные внешние и внутренние факторы. Глубина его в разных элементах нервной системы неодинакова. Типичным первичным раздражением реагируют мотонейроны спинного мозга (Дорохова М.Т., 1971; Иткин С.И., 1972; Крюков М.А., 1990; Moussa T.A., 1978; Ne-gredo P. et al., 2004). В то же время, этот процесс выражен меньше в чувствительных клетках спинномозговых узлов (Бакальский Е.П., 1981; Muir T.C., 1973). При этом необходимо отметить, что хроматолитические изменения в периферической нервной системе (в нейронах спинномозговых узлов) часто выражены сильнее вследствие низкой эффективности гемато-нервного барьера в СМУ (Olson Y., 1984).

Изменения хроматофильного вещества в нервной системе могут быть обусловлены разными патологическими процессами: усиленной двигательной нагрузкой, при раздражении нервных элементов электрическим током, при действии радиоволн, при нервном шоке, при использовании ультразвука, при экспериментальной ишемии, воздействии лекарственных средств, алкоголя и др. (Струков А.И., 1960; Мезенцев А.Н., 1971; Ярыгин Н.Е., 1973; Гейнисман Ю.Я., 1974; Каминский Ю.В., 1990; Мотавкин П.А., 2003; Шевцов В.И., 2005; Кудрявцева И.П., 2014; Corsetti G., 1998; Holmes J., 1998; Burbach G., 2001; McKeage D., 2001; Fukai T., 2005). Н.П.Медведев, Г.А. Билич (1982) и С.И. Иткин (1972) показали, что при действии высокой температуры сначала развиваются изменения типа острого набухания, а при дальнейшем повышении – ее «тяжелые» изменения.

Исследования, проведенные на кошках, собаках, кроликах и крысах демонстрировали хроматолитическую реакцию в нейронах СМУ независимо от места и способа травматизации. При этом менялась лишь скорость наступления и степень выраженности реакции. Н.Aldskogius и соавт. (1985) сделали обзор по данной проблеме, отметив реакцию не только в телах нейронов, но и в их отростках. Авторы делают вывод о большой чувствительности нейронов СМУ к травме периферических отростков, но не дают объяснения наступления реактивных изменений в разные сроки экспериментов. Также отмечено, что ретроградные изменения в чувствительных нейронах могут через определнное время приводить к восстановлению нормальной структуры нейрона или к его деструкции. Хроматолитические реакции часто являются одним из проявлений ретроградного процесса, который в свою очередь развивается внутри тела нервной клетки параллельно процессам Уоллеровской дегенерации (Иванов И.Ф., 1961; Gaudet A., 2011). В зависимости от характера и тяжести травмы нерва, ретроградный процесс начинается через 10-24 часа. Наиболее глубокие изменения устанавливаются в нейронах на 10-15 день (Бородаевская Г.И., 1976). И только через 2-2.5 месяца клетка принимает свой первоначальный вид (Крюков М.А., 1990; Мотавкин П.А., 2003; Крюков К.И., 2005, 2008).

Весь процесс занимает значительный отрезок времени, в котором различают начальный, более короткий период дистрофических изменений, и продолжительный восстановительный. Первая стадия, длящаяся 24-30 дней, считается стадией реакции; вторая, при которой происходит восстановление ба-зофильного вещества – стадией восстановления (Мотавкин П.А., 2003). Характер ретроградного процесса зависит от тяжести, места травмы, физиологического состояния нейрона и его функции (Бакальский Е.П., 1981). Ю.М Жаботинский (1965) называет 3 типа ретроградных изменений, которые зависят от величины нейрона: типическое первичное раздражение в мелких клетках; хроматолиз, центральное или эксцентрическое положение ядра с пе-ринуклеарным накоплением тигроида в крупных клетках; в клетках средней величины – периферический хроматолиз с центрально лежащим ядром.

Рядом авторов одновременно отмечено, что определенным периодам в ретроградной реакции соответствует определенная структура и локализация базофильного вещества (Мотавкин П.А., 1957; Жаботинский Ю.М., 1965). В результате травмы, изменения базофильного вещества в клетках начинаются в промежуточной зоне и последовательно распространяются к периферии и к ядру (Гейнисман Ю.Я., 1974). Это характеризует первую фазу реакции, для которой типична диссимиляция тигроида. Вторая фаза начинается с накопления базофильной субстанции в перинуклеарной зоне. Она приводит к восстановлению нормальной структуры клетки, но часть клеток в спинномозговых узлах погибает (Баранов В.Ф., 1968; Himes B.T., 1989).

Методы гистологической и морфометрической обработки

При рассмотрении морфометрических особенностей нейронов СМУ заметно деление их на различные популяции в зависимости от их размера. Произведенные измерения размерных характеристик нейронов в контрольной группе животных продемонстрировали бимодальный характер распределения выборки (рис. 6), что было положено нами в основу разделения нейронов СМУ сегментов LIII-LV у экспериментальных животных на две группы – А и В типа. Это согласуется с классификацией предложенной рядом авторов (Andres K.H., 1961; Tandrup T., 1993). Учитывая особенности строения двух типов нейронов и различную функциональную нагрузку, был проведен анализ морфофункционального состояния отдельно для каждой популяции нервных клеток.

А-тип нейронов – крупные, светлые нейроны с отчтливыми глыбками базофильного вещества и волокнистой ядерной мембраной, одним большим центрально расположенным ядрышком или иногда с 1-2-мя мелкими ядрышками, чаще с миелинизированным аксоном, связанные с эпикритической чувствительностью (Крюков К.И., 2008; Andres K.H., 1961; Tandrup T., 1993). В контрольной группе доля таких клеток составляла 32,9%. По данным морфо-метрии средняя площадь центрального среза таких нейронов составляла 958,3±14,6 мкм2, площадь ядра 167±6,1 мкм2. Среднее значение ядерно-цитоплазматического индекса для А-типа нейронов составляло 0,211±0,04 ед., при этом у 7,1% клеток отмечалось эктопированное ядро. Рис. 6. Интервальная гистограмма распределения площадей срезов нейронов поясничных СМУ у интактных крыс. Бимодальный характер распределения. По оси абсцисс – площадь среза нейрона (S, мкм2), по оси ординат – число наблюдений.

В-тип нейронов – мелкие, тмные клетки с диффузным распределением базофильного вещества, часто со светлым ореолом в центре клетки, гладкой ядерной мембраной, с одним или более мелкими ядрышками, часто расположенными на периферии ядра, преимущественно с немиелинизированными отростками. Такие нейроны являются висцеросенситивными, a также передают термическую и осязательную протопатическую чувствительность (Крюков К.И., 2008; Andres K.H., 1961; Tandrup T., 1993). Доля таких нейронов у интакт-ных животных составляла 61,6%. Средняя площадь среза нейрона составляла 335,4±10,2 мкм2, площадь ядра 98,8±3,2 мкм2. Среднее значение ядерно-цито-плазматического индекса равнялось 0,418±0,11 ед., при этом у 2,1% клеток отмечалось эктопированное ядро, а 9,3% клеток имели больше двух ядрышек.

В пределах указанных подтипов отмечались группы клеток отличных по своим тинкториальным характеристикам от размерных аналогов. Данную популяцию мы расценивали как клетки с реактивными изменениями, проявляющимися в значительных изменениях хроматофильной субстанции, формы ядра и перикариона, и хорошо различимыми на светооптическом уровне. Реактивные изменения представляют собой совокупность конформационных, метаболических и пролиферативных изменений внутриклеточных биополимеров, цитомембран, которые, с одной стороны, превышают объем физиологической изменчивости, а с другой, – не достигают уровня типовых патоло 42 гических состояний. Доля нейронов А-типа с проявлениями реактивных реакций в контрольной группе была незначительной и составила 1,8% от всех изученных нейронов. Площадь среза таких нейронов составляла 956,4±17,7 мкм2, площадь ядра 179,4±8,3 мкм2. Среднее значение ядерно-цитоплазмати-ческого индекса равнялось 0,231±0,18 ед.

Доля нейронов В-типа с признаками дистрофических реакций в контроле была также незначительна и составила 2,8%. Площадь среза таких нейронов составляла 337,6±11,4 мкм2, площадь ядра 101,1±4,9 мкм2. Среднее значение ядерно-цитоплазматического индекса равнялось 0,428±0,14 ед.

Отдельно наблюдались единичные клетки с выраженными признаками нарушения метаболизма, проявляющимися в виде крайней степени изменений тинкториальных свойств, выраженным пикнозом и процессами лизиса клеточного тела. Фактически наблюдались клетки, вошедшие в стадию необратимых дистрофических и деструктивных изменений. Данная группа клеток определялась нами как деструктивно измененные нейроны, их доля в контрольной группе составила 0,9%. Наличие таких нервных клеток в группе интактного контроля возможно объяснить как следствие естественной физиологической деструкции. Вследствие значительной деформации клеточного тела и распада ядра измерения их морфометрических характеристик и деление их на подгруппы нами не производилось.

В экспериментальной группе со спонтанным заживлением асептической раны отмечалась различная динамика изменений размеров нейронов двух популяций. Анализ гистограммы распределения нервных клеток на основании планиметрических характеристик продемонстрировал большую гетерогенность популяции нейронов СМУ: увеличивался диапазон минимальных и максимальных размеров клеток, возникали клетки с промежуточными показателями площади среза. Однако бимодальность распределения сохранялась, что позволяло нам рассматривать характеристики в отдельных группах нейронов (рис. 7).

Площадь интактных А-нейронов на 1-е сутки соответствовала значениям контрольной группы животных. Начиная с 3-х суток отмечался рост средних значений их площади с максимумом на 7-е сутки в 967±22 мкм2. На 14-е и 21-е сутки показатели площади снижались до 963±26,1 мкм2 и 960±20,1 мкм2, при этом недостоверно превышая показатели интактных животных. Для реактивных А-нейронов был отмечен резкий скачок размеров до 971±19,2 мкм2 на 1-е сутки (рис. 8), что соответствовало преобладанию хро-матолитических реакций и связанных с ними явлений острого набухания нервных клеток. За этим, на фоне нарастания пикнотических изменений (рис. 9), следовало снижение показателя до 955±20,6 мкм2 на 3-и сутки и до 949±24,4 мкм2 на 5-е сутки, снижаясь ниже уровня контрольных значений. На 7-е сутки отмечался очередной пик размеров нейронов – 966±25,6 мкм2, с последующим снижением до 959±22,5 мкм2 на 21-е сутки.

Интактные В-нейроны демонстрировали схожую динамику изменения размеров, нарастая с 336±10,9 мкм2 на 1-е сутки до 342±14,3 мкм2 на 7-е сутки, и снижаясь к уровню контрольных значений на 21-е сутки.

Для реактивных В-нейронов был характерен небольшой рост на 1-е сутки до 339±12,1 мкм2, на 3-и сутки показатель площади снижался ниже контрольных значений. В дальнейшем, параллельно с возникновением разнонаправленных морфологических изменений – с одной стороны пикноза (см. рис. 9), с другой стороны регенераторных гиперпластических процессов, значения площади, плавно снижаясь, располагались в диапазоне 336 – 340 мкм2.

Динамика размеров ядер и изменение количества ядрышек в субпопуляциях нейронов в зависимости от вида воздействия и типа течения раневого процесса

Через две недели после нанесения раны и е обработки ГИС отмечалось значительное снижение доли реактивно измененных больших А-нейронов до 9,7%. В основной массе ими являлись бледные нейроны с эктопированными ядрами и незначительное число интенсивно окрашенных клеток. Доля же В-нейронов с реактивными изменениями оставалась на таком же высоком уровне, как и на предыдущем сроке исследования. Однако явления хроматолиза в таких клетках проявлялись в меньшей степени в отличие от конфор-мационных изменений и выраженной базофилии.

На 21-е сутки соответственно нарастанию доли нейронов, не имеющих на светооптическом уровне изменения формы и тинкториальных свойств, уменьшались доли измененных клеток: нейроны А-типа составляли 8,1%, нейроны В-типа 26,9%. Процессы деструкции, выражавшиеся в возникновении нейронов с тяжелыми формами дистрофии, демонстрировали схожую с естественным за 64 живлением динамику. Наблюдалось активное нарастание их доли с 3-х суток (4,8%) до максимума в 6,4% сместившегося в данной экспериментальной группе на 21-е сутки.

Обобщая полученные результаты, можно отметить более быстрое нарастание реактивных изменений и соответственное увеличение долей реактивно измененных нейронов всех субпопуляций на протяжении первых 5 суток эксперимента в сравнении с естественным течением заживления асептической раны. При этом морфологические изменения в эти сроки соответствовали реакциям, развивающимся вследствие повреждения периферических отростков нейронов в раневом дефекте и, в меньшей степени, гиперпластическим регенераторным процессам. Следствием этого явилось и незначительное, но достоверное увеличение доли нейронов с деструктивными изменениями. Вс это возможно проявления дополнительного травмирующего воздействия, оказываемого применяемым методом терапии при обработке раневого дефекта.

При использовании ОТПК на 1-е сутки соотношение неизмененных нейронов и нервных клеток с различными тинкториальными изменениями в общем соответствовало таковому в предшествующих экспериментальных группах (рис 27). Выявлялось незначительное количество крупных А-нейронов с центральным хроматолизом – 3,3% от всей популяции клеток узла. Доля измененных В-клеток составляла 11,8% и была представлена нейронами с различными проявлениями дистрофических процессов – хроматоли-тическими реакциями, пикнотическими изменениями, в меньшей степени вакуолизацией и дистопией ядер.

На 3-и сутки доля измененных нейронов достигала максимальных значений в 9,2% и 16,5% для А- и В-нейронов соответственно. При этом для обеих популяций были характерен высокий полиморфизм изменений: присутствовали клетки как с признаками первичного раздражения – центральным хроматолизом и эктопированными ядрами, с нарастающими дистрофическими реакциями – вакуолизацией, ретракцией цитоплазмы и пикнозом ядер и перикарионов, так и с гиперпластическими реакциями – крупными интенсивно окрашенными ядрами, с несколькими ядрышками, высоким уровнем базофилии цитоплазмы. І 12% !

С 5-х суток в данной экспериментальной группе уже отмечалось снижение доли реактивных нейронов – для А-типа до 8,3%, для В-типа до 14,0%. При этом среди таких нейронов во вс меньшем количестве регистрировались сильно деформированные клетки.

Тенденция к значительному снижению доли измененных нейронов наблюдалась в данной группе и на протяжении оставшегося времени. На 7-е сутки доли составляли 7,5% и 9,1%, на 14-е – 5,3% и 7,1% для А- и В-нейронов соответственно.

На 21-е сутки соотношение долей интактных и реактивно измененных нейронов обеих субпопуляций становится близким к показателям у интактных животных, превышая их не более чем на 1%. Единственным следствием дистрофических процессов является увеличившаяся доля деструктивных клеток до 2,9%, сохраняющаяся на таком уровне с 3-х по 21-е сутки эксперимента.

Таким образом, применение ОТПК значительным образом меняет временную динамику структурно-функциональных перестроек в нейронах СМУ в процессе заживления асептической раны: на фоне естественных вследствие повреждения нервных волокон процессов дистрофии уже с 3-х суток быстро нарастают регенерационные гиперпластические процессы и достоверно снижается доля деструктивно измененных нейронов.

Морфологическая картина изменений нейронов СМУ при гнойном течении раневого процесса принципиально не отличалась от таковой при асептической ране. Однако выраженность дистрофических реакций и их разнообразие было выражено заметно сильнее. Так инфицированному течению были свойственны более выраженные изменения коллоидов цитоплазмы, проявлявшиеся в дезагрегации хроматофильной субстанции с формированием тотального хроматолиза, повышенной частоте гидропических изменений в виде массивной вакуолизации перикариона (рис. 28).

Чаще встречались кариорексис, деформация и фрагментация ядер. Клетки с тяжелыми формами дистрофии часто располагались группами, вокруг которых находились нейроны без признаков изменения тинкториальных свойств. Можно предположить, что дендриты этих нейронов (дистрофически измененных) были непосредственно повреждены в области раневого дефекта. Переход дистрофии в необратимые изменения приводил к возникновению лизирующихся нейронов и формированию, вследствие нейронофагии, на их месте крупных «глиальных узелков».

Отдельно необходимо отметить разнообразные проявления базофилии: с одной стороны встречалось, особенно на поздних сроках, значительное число интенсивно окрашенных сильно деформированных нейронов на поздних стадиях дегенерации (рис. 29), с другой стороны отмечались незначительно деформированные и увеличенные в размерах нейроны (преимущественно В-типа) с интенсивной окраской хроматофильной субстанции, которые можно охарактеризовать как усиленно функционирующие и компенсаторно измененные.

В случае естественного заживления гнойной раны отмечалось постепенное снижение долей интактных нейронов: для А-нейронов с 29,9% на 1-е сут до 15,9% на 7-е сут; для В-нейронов с 54,1% на 1-е сут до 23,1% на 14-е сутки. Соответственно вышеописанным сдвигам нарастало число нейронов с признаками реактивных изменений (рис. 30). Рис. 28. Дистрофические изменения в нейронах СМУ (обозначено стрелками). Гнойная рана с селективным применением ТК, 14 сут. Окраска по Нисслю, 400.

Соотношение долей интактных (Инт) и измененных (Реакт) нейронов А- и В-типа при естественном заживлении инфицированной раны. Ось абсцисс: сроки забора материала; ось ординат: доля в процентах изучаемых подтипов клеток. Примечание: Дестр – суммарная доля нейронов обеих популяций с необратимыми деструктивными изменениями; ик – группа интактного контроля.

На первые сутки отмечались преобладающие явления центрального хроматолиза, более выраженные для малых В-нейронов с признаками реакции – 10,6% клеток, доля измененных А-клеток в этом сроке была незначительной и составляла 3,9% от всего числа оцененных клеток СМУ. С 3-х по 5-е сутки был зафиксирован активный рост доли измененных нейронов, среди которых возникали клетки с тотальным хроматолизом, явлениями эктопии ядра и различными пикнотическими изменениями. В максимуме на 5-е сутки доля измененных А-нейронов составляла 17,2%, В-нейронов – 37,6% соответственно. В продолжении эксперимента доля измененных А-нейронов незначительно снижалась к 21-м суткам до 14,5%, В-клетки продемонстрировали более значительное снижение с 36,3% на 14-е сутки до 31,8% на 21-е сутки.

Выявление суммарного белка в субпопуляциях нейронов

В реактивной субпопуляции выявлялись максимальные значения из всех оценивавшихся групп: рост оптической плотности в максимуме на 5-е сутки достигал 49,8% по сравнению с контролем. При этом результирующая кривая данного маркера была более высокой, максимальные значения превышали соответствующие им временные максимумы в период с 1-х по 7-е сутки, а к 21-м суткам отмечалось приближение к показателям контрольной группы.

В интактной субпопуляции нейронов В-типа при спонтанном течении раневого процесса отмечалось незначительное снижение оптической плотности РНК на 1-е сутки до 94,2% от значения интактного контроля. Максимум данного гистохимического маркера соответствовал 5-м суткам, когда достигал 118,2%, а к 21-м суткам снижался до 106% по сравнению с контролем.

В реактивной субпопуляции В-нейронов на 1-е и 3-и сутки отмечалось незначительное снижение оптической плотности РНК до 9,1% и 89,7% соответственно. В дальнейшем показатель нарастал, достигая 163,1% по сравнению с контролем, и к окончанию эксперимента снижался до 117,1% от контрольных значений.

При использовании ГИС отмечалось снижение оптической плотности РНК на 1-3 сутки до 90,3% и 94,5% соответственно, сменявшееся в дальнейшем повышением, достигающим максимума к 7-м суткам (131,8%), что существенно превышало величины, отмечавшиеся при спонтанном течении раневого процесса. К 21 суткам отмечалось плавное снижение данного показателя, превышавшее контрольные величины на 7,1%.

В реактивной субпопуляции В-типа 1-е и 3-и сутки также характеризовались снижением концентрации РНК на 11,8% и 22,6% соответственно, что статистически достоверно отличалось как от контрольной группы с естественным течением, так и от величин интактного контроля. Указанное первоначальное снижение РНК сменялось его повышением, достигавшим максимальных значений к 14-м суткам (до 67,5% по сравнению с контролем). К 21-м суткам отмечалось снижение показателей данного параметра, при этом статистически достоверно превышавшего значения контрольной группы (см. табл. 6).

Применение ОТПК для интактных В-нейронов формировало ход кривой подобный интактной субпопуляции А-типа, максимум соответствовавший 5 суткам характеризовался превышением значений контрольной группы на 36,2%, при этом необходимо отметить, что это соответствовало максимальным значениям оптической плотности РНК при данном типе течения раневого процесса, как при отсутствии регионального воздействия, так и при использовании ГИС.

В реактивной субпопуляции В-типа подобный максимум однопиковой кривой формировался на 7-е сутки (171,3% по сравнению с контролем). Данная величина также была наибольшей, как и в случае с интактной популяцией. Несмотря на указанное значительное повышение белковосинтетической активности в нейронах В-типа при применении ОТПК как метода региональной стимуляции регенерации, необходимо отметить, что к концу срока исследования (на 21-е сутки) статистически достоверных отличий по сравнению с интактным контролем не выявлялось (см. табл. 6).

При инфицированном течении в интактных нейронах А-типа отмечалось снижение оптической плотности РНК на 1 и 3 сутки на 12% и 10% соответственно, что вероятно может отражать явления системной интоксикации, усугубляющие нарушения в нейронах в дополнение к травме периферических окончаний в зоне иннервации СМУ. Увеличение значения оптической плотности достигало максимума к 7 суткам – 12% от контроля (рис. 58, 59). К 21-м суткам статистически достоверных отличий от контрольных показателей не выявлялось.

В реактивной субпопуляции А-нейронов динамика была подобной таковой в интактной популяцци, однако снижение оптической плотности РНК на 1-е и 3-и сутки, до7% и 5% соответственно, было статистически не достоверным. В дальнейшем отмечалось повышение оптической плотности, максимум также соответствовал 14-м суткам, когда увеличение данного маркера достигало 38% по сравнению с контролем.

Применение ГИС изменяло динамику оптической плотности РНК, уже на 1-е сутки отмечалось увеличение до 19%, с формированием вторичного максимума на 7-е сутки в 26% в сравнении с контролем. Отмечавшееся на 3 сутки незначительное снижение показателя на 3% было статистически недостоверно (рис. 60). В реактивной субпопуляции формировалась однопиковая кривая с эксцентричным максимумом на 7-е сут, когда увеличение величины оптической плотности РНК достигало 55% от контроля. Снижение показателя в данной экспериментальной группе было более крутым: так, на 14 сутки он достигал 144%, а к 21-м превышение над величинами контроля составляло 5% и было статистически не достоверным (см. табл. 6).

Оптическая плотность РНК в субпопуляциях нейронов СМУ при селективном применении ГИС для терапии гнойного раневого процесса в зоне иннервации. Ось абсцисс – сроки забора материала; ось ординат – значение оптической плотности в усл. ед.

Изолированное применение ОТПК оказывало, по всей видимости, наиболее выраженный и негативный эффект, проявлявшийся в длительном, хотя и статистически не достоверном, снижении оптической плотности РНК в период с 1-х по 5-е сутки на 15%, 12% и 2% соответственно. Наблюдавшееся в дальнейшем повышение было крайне незначительным, не превышая в максимуме на 14-е сутки 6% (рис. 61).

Изменения в реактивной субпопуляции А-нейронов в большей степени были подобны спонтанному течению инфицированной раны: также отмечалось статистически не достоверное снижение оптической плотности продуктов реакции на 1-3 сутки, сменявшееся увеличением значений данного показателя до максимальных на 14 сутки (на 31% по отношению к контролю), однако данный прирост был менее выраженным по сравнению с группой без применения региональной терапии.

Оптическая плотность РНК в субпопуляциях нейронов СМУ при селективном применении ОТПК для терапии гнойного раневого процесса в зоне иннервации. Ось абсцисс – сроки забора материала; ось ординат – значение оптической плотности в усл. ед.

Комплексное использование ГИС, как метода физического воздействия, и ОТПК, как метода тканевой терапии, сопровождалось наиболее выраженной динамикой РНК, как показателя активности синтетических процессов в нейронах. В интактной субпопуляции уже с 1-х суток отмечалось увеличение данного параметра до 20% по сравнению с контролем (рис. 62, 63). Причем указанные значения демонстрировали незначительную тенденцию к повышению (2-3%), сохранявшуюся до 7-х суток. В дальнейшем отмечалось плавное снижение данного параметра на 10-11% от достигнутого максимума.

В реактивной субпопуляции А-нейронов также уже с первых суток отмечалась тенденция к повышению оптической плотности РНК: максимум формировался на 7-е сутки – 149% по сравнению с контролем, с последующим приближением к интактным значениям на 21-е сутки (с превышением на 1%, не достоверным) (см. табл. 6).