Введение к работе
Точная сегрегация генома, необходимая для сохранения постоянства генетической информации в ряду клеточных поколений, осуществляется благодаря работе ценгромерного района хромосом, или центромерного комплекса. При делении клеток в этой зоне формируется кинетохор - ДНК-Оелковая структура, обеспечивающая правильную сегрегацию хромосомного материала. "Зрелый", т.е. полностью сформированный кинетохор, состоит из трех слоев: наружной и внутренней пластинок, разделенных промежуточным слоем - средней пластинкой (Earnshaw 1994). Пластинки кинетохора обеспечивают взаимодействие и прочную свзь митотических хромосом с микротрубочками веретена деления. По-видимому, именно в этой зоне расположены специфические моторные белки, осуществляющие движение и сегрегацию хромосом, а также факторы, регулирующие
Процесс КЛеТОЧНОГО ДеЛеНИЯ (Pluta et al.,1995).
Благодаря многочисленным исследованиям центромерного района метафазных хромосом человека в составе этого домена было обнаружено несколько классов специфических белков, включая
CENP, INCENP И CLIP 6ЄЛКИ (Schulman, Bloom 1991). ДЛЯ МНОГИХ ИЗ
них установлены точная аминокислотная последовательность, кодирующая их последовательность ДНК, ультраструктурная
Локализация В Области центромеры (Pluta et al.,1995).
В литературе, однако, имеется очень мало сведений о динамике структурных преобразований ценгромерного комплекса в ходе клеточного цикла. Не известно, каким образом происходит сборка и разборка кинетохоров в митозе, не понятен принцип организации "зрелых" кинетохоров и характер их взаимодействия с материалом хромосом, не установлена роль многих центромерных белков при функционировании центромеры.
Особенно удобным объектом для исследований такого рода являются клетки мыши. У этого объекта, в отличие от клеток человека и многих других млекопитающих, блоки центромерного гетерохроматина морфологически выявляются не только в митозе, но и на стадии интерфазы, когда они формируют индивидуальные
ХрОМОЦеНТрЫ (Natarajan, Gropp, 1972). ЭТО обстоятельство
позволяет изучать центромерный район хромосом в течение всего клеточного цикла. Однако литературные данные об организации центромерного комплекса у мыши практически отсутствуют.
В связи с этим, основной целью настоящей работы стало исследование ультраструкгурной организации и антигенных свойств центромерного комплекса мышиных фибробластов в динамике клеточного цикла, включая последовательные стадии митоза и интерфазу, а также при искусственной модификации центромеры и патологии митоза.
В работе были поставлены следующие конкретные задачи:
1. С помощью электронной микроскопии и серийных ультратонких
срезов описать морфологию центромерного комплекса
последовательно на всех стадиях митоза в клетках мыши.
Определить фазы митоза, когда формируется и полностью исчезает
характерная структура кинетохоров.! Описать особенности
ульграструктурной организации кинетохора в условиях
прометафазного, метафазного и анафазного движения хромосом.
2. Отработать методику получения препаратов митогических
хромосом для иммуноцитохимического анализа. С помощью
антицентромерных сывороток описать поведение основных
центромерных белков сеир-а, в и с в динамике митоза в клетках
мыши.
3. Описать распределение и взаимное расположение
центромерного гегерохроматина (хромоцентров) и прекинетохоров в
интерфазных ядрах мыши.
-
Описать динамику появления растянутых центромерных районов хромосом в митозе при инкубации клеток мыши с бензимидом Хехст 33258. Изучить ультраструктуру, антигенные свойства и функциональное состояние искусственно модифицированной центромеры.
-
Принимая во внимание данные о появлении патологических митозов при цитомегаловирусной инфекции, провести ультраструктурное и иммуноцитохимическое исследование центромеры и кинетохоров в фибробластах человека в норме и при патологии.
Научная новизна _и. практическое .значение м работы
В работе впервые был проведен детальный анализ поведения центромерного комплекса клеток мыши последовательно на всех стадиях митоза и в интерфазе. Подробно изучен процесс формирования и . разборки кинетохоров, а также проведено исследование их ультраструктурной организации на всех стадиях активного движения хромосом. Показано, что кинетохоры появляются на хромосомах в ранней прометафазе, одновременно с возникновением первых разрывов в ядерной оболочке. Впервые показано, что наружная пластинка мегафззных кинетохоров мшш в нормальных условиях состоит из отдельных фрагментов, каждый из которых взаимодействует с одной микротрубочкой. Установлено, что разрушение кинетохоров происходит в течение короткого периода времени в ранней телофазе и не является "обратным" повторением динамики их формирования.
С целью поиска новых белков центромеры проведен скрининг более 100 сывороток крови от аутоиммунных больных и найдены три сыворотки, содержащие антитела к центромерным районам хромосом.
Разработана методика получения препаратов митотических хромосом для иммуноцитохимического исследования центромеры и других участков митотических хромосом. С помощью этого метода с использованием аутоиммунных сывороток исследовано поведение центромерных белков cenp-a,b и с последовательно на всех стадиях митоза.
Изучено распределение хрошцентров и прекинетохоров в интерфазных ядрах мыши. Впервые показано их пространственное взаимодействие.
Впервые подробно исследовано влияние бензимида Хехста 33258 на морфологию, ультраструктуру, антигенные свойства и функцию центромеры мыши в митозе. Показано, что действие Хехста 33258 на живые клетки l- 929, приводящее к растяжению центромеры на
стандартных Препаратах ХРОМОСОМ (Hilwig, Gropp, 1973), не
приводит к нарушению структуры кинетохоров и их антигенных свойств, а также способности хромосом к движению и сегрегации в митозе.
Впервые изучены структура и антигенные свойства центромерного района метафазных хромосом в фибробластах человека при цитомегаловирусной инфекции, вызывающей появление в культуре клеток патологических митозов (Makarova et ai., 1995). Показано, что при патологии типичные кинетохоры на хромосомах не формируются, хотя- основные центромерные белки - CENP-A,в,с, сохраняются в составе хромосом. Высказано предположение, что при заражении клеток человека цитомегаловирусом наблюдается особый тип К-митозов, при котором блокировка клеточного деления происходит не за счет разборки митотического веретена, а в результате нарушения структуры кинетохоров.
Апобащя_р_аботы
Материалы диссертации были представлены на хххи Ежегодной конференции Американского общества по клеточной биологии (Денвер, США, 15-19 ноября 1992 г.), на vi Международной
Конференции "Frontiers in biochemistry and molecular biology. The legacy of Andrey Belozersky" (Москва, РОССИЯ, 18-22 декабря
-
г.), на хп Всероссийском симпозиуме по структуре И функциям клеточного ядра (Санкт-Петербург, Россия, 22-24 октября
-
г.), а также докладывались на семинарах в НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского и на кафедре цитологии и гистологии биологического факультета МГУ.