Сравнение нормальных и опухолевых CD5-положительных В-клеток человека Поташникова Дарья Марковна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Введение 4

1.1 Актуальность проблемы 4

1.2 Цель и задачи исследования 5

1.3 Научная новизна и практическая значимость работы

1.4 Апробация работы 7

ГЛАВА 2. Обзор литературы 8

2.1 В-лимфоциты в норме. Дифференцировка, созревание и иммунофенотип В клеток 8

2.1.1 Дифференцировка В-клеток 8

2.1.2 Синтез иммуноглобулинов. Антиген-независимый этап созревания В клеток 11

2.1.3 Антиген-зависимоый этап созревания В-клеток 13

2.1.4 В-клеточный рецептор и сигнальный каскад от него 15

2.1.5 Иммунофенотип В-клеток 18

2.2 В-клеточные опухоли. Дифференциальная диагностика. Гетерогенность в

группе CD5-положительных В-клеточных лимфом 22

2.2.1 Не-Ходжкинские лимфомы 22

2.2.2 Дифференциальная диагностика лимфом 24

2.2.3 Возможные предшественники СП5-положителъных лимфом 25

2.3 Биология передачи сигнала в CD5-положительных лимфомах 29

2.3.1 Строение В-клеточного рецептора СВ5-положителъных лимфом 29

2.3.2 Строение BCR-каскада СВ5-положителъных лимфом 30

2.4 Методические подходы к исследованию В-клеточных популяций 32

2.4.1 Клеточная сортировка чистых субпопуляций для анализа уровней экспрессии генов 32

2.4.2 Подходы к исследованию В-клеток при помощи ПЦР в реальном времени.

Проблема нормализации данных при анализе уровней экспрессии мРНК 34

ГЛАВА 3. Материалы и методы исследования 36

3.1 Пациенты и контроли 36

3.2 Гистология и иммуногистохимия 37

3.3 Проточная цитофлуориметрия

3.4 Клеточная сортировка 38

3.5 Получение РНК и кДНК 39

3.6 Подбор праймеров 39

3.7 ПЦР в реальном времени 41

3.8 Нормализация и статистический анализ 42

ГЛАВА 4. Результаты исследования 43

4.1 Классификация исследованных в работе опухолевых тканей и реактивных контролей 43

4.2 Определение уровней экспрессии мРНК генов сигнальных белков BCR каскада в опухолевой и реактивной лимфоидной ткани 51

4.3 Описание CD5+CD19+ популяции неопухолевых лимфоцитов миндалин 58

4.4 Сортировка нормальных и опухолевых В-клеток. Определение уровней экспрессии мРНК генов сигнальных белков BCR-каскада в чистых субпопуляциях 62

4.5 Совместный анализ данных по экспрессии мРНК генов сигнальных белков BCR-каскада в отсортированных и неотсортированных лимфоидных образцах 68

4.6 Анализ экспрессии ZAP-70 в CD5+CD19+ В-клетках миндалин методом проточной цитофлуориметрии 71

ГЛАВА 5. Обсуждение результатов 73

5.1 Опухолевые В-клетки В-ХЛЛ и ЛКМЗ имеют уникальный профиль экспрессии сигнальных белков 73

5.2 Клетки лимфом из «серой зоны» между В-ХЛЛ и ЛКМЗ отличаются как по экспрессии поверхностных антигенов, так и по уровням экспрессии сигнальных компонентов BCR-каскада 74

5.3 Характеристика CD5-положительных клеток миндалин 77

5.4 Уровни экспрессии генов сигнальных молекул BCR-каскада в норме и при патологии 78

ГЛАВА 6. Заключение 80

Выводы 82

Список сокращений и условных обозначений 83

Список литературы

• Научная новизна и практическая значимость работы
• Антиген-зависимоый этап созревания В-клеток
• Проточная цитофлуориметрия
• Определение уровней экспрессии мРНК генов сигнальных белков BCR каскада в опухолевой и реактивной лимфоидной ткани

Введение к работе

Актуальность проблемы. В-клетки - потомки общего лимфоидного предшественника, прошедшего в процессе дифференцировки и созревания ряд стадий с последовательной сменой поверхностного иммунофенотипа, эпигенетического и транскрипционного профилей. Основополагающую роль в выживании и дифференцировке В-лимфоцита играет сигнал фосфорилирования, получаемый через В-клеточный рецептор (BCR): митогенные и антиапоптотические сигналы передаются в ядро через BCR и ко-рецепторные комплексы. В зависимости от привлеченных ко-рецепторов сигнал может изменяться и приводить к разным последствиям для В-клетки. В дополнении и тонкой настройке сигнала от BCR задействован большой набор различных молекул плазматической мембраны В-лимфоцита. Вместе они обеспечивают активацию В-клеток, их миграцию в организме по сложным траекториям и, в конечном счете, выполнение их функции в составе иммунной системы.

Набор поверхностных молекул на мембране В-лимфоцита позволяет дать развернутую характеристику его происхождения и функционального состояния. Значительный объем информации о структуре, функциях и паттернах экспрессии поверхностных антигенов, накопленный на сегодняшний день, позволяет описывать многообразие В-клеточных субпопуляций в норме, а также при патологических состояниях. Так, диагностика В-клеточных лимфом базируется на развернутом описании поверхностных антигенов. Однако поиск сходств и различий между нозологическими группами зачастую ограничивается анализом поверхностных маркеров и мутационного статуса В-клеточного рецептора, и не касается экспрессии проводящих элементов сигнального BCR-каскада, расположенных в цитоплазме.

Передача сигнала от зрелого BCR обеспечивается BCR-ассоциированными тирозинкиназами и тирозинфосфатазами (SYK, LYN, SHP-1, ZAP-70), которые активируют универсальные сигнальные молекулы - PI3K, PLC, РКВ и РКС (DeFranco, 1997; Geisberger et al., 2003; Harwood, Batista, 2010). Эффекторными молекулами BCR-каскада являются транскрипционные факторы, обеспечивающие размножение и выживание клеток. Так как важнейшие характерные свойства опухолевых клеток обусловлены аномальным функционированием сигнальных путей, контролирующих клеточный цикл и апоптоз (Hanahan, Weinberg, 2000; Hanahan, Weinberg, 2011), актуальным представляется изучение экспрессии сигнальных белков BCR-каскада в различных В-клеточных лимфомах.

В гетерогенной группе не-Ходжкинских лимфом выделяется значительная подгруппа В-зрелоклеточных лимфом с неканонической экспрессией маркера CD5.

Наибольшую часть случаев в Восточной Европе составляет В-клеточный хронический лимфолейкоз (В-ХЛЛ) (Sant et al., 2010), более редким и более агрессивным заболеванием является лимфома из клеток мантийной зоны (ЛКМЗ). Кроме того, выделяется ряд промежуточных форм между В-ХЛЛ и ЛКМЗ, представляющих трудность для современной диагностики (Zhao, 2009). Отправной точкой в исследовании сигналинга CD5+ В-клеточных опухолей стало разделение группы В-ХЛЛ на две подгруппы по способности запускать BCR-каскад (Lankester et al., 1995; Chiorazzi et al., 2005). Ha сегодняшний день для клеток В-ХЛЛ были показаны аберрантные уровни экспрессии верхних проводящих компонентов BCR сигнального каскада: CD79b (Cajiao et al., 2007), тирозинкиназ SYK и LYN, а также добавление к общему опухолевому фенотипу неканонической тирозинкиназы ZAP-70 (Chen et al., 2002, Seda, Mraz, 2015). Исследований BCR-ассоциированных сигнальных белков для других CD5+ В-клеточных лимфом проводилось сравнительно мало. На основании данных об гиперэкспрессии циклина D1 и общем высоком уровне активации клеток ЛКМЗ при общем низком уровне фосфорилирования сигнальных компонентов был сделан вывод об их неспособности проводить сигнал извне (de Boer et al., 1997). Исследования методом microarray показали значительно повышенные уровни компонентов РІЗК-Akt и Wnt сигнальных путей при ЛКМЗ, но данные о BCR-ассоциированных молекулах в них отсутствовали (Rizzatti et al., 2005).

Проблема клеток-предшественников CDS-положительных лимфом также представляет значительный интерес: ведется поиск субпопуляции нормальных В-клеток, наиболее близкой к В-ХЛЛ по фенотипу (Klein, Dalla-Favera, 2005). CD5+ В-клетки миндалин человека являются важными претендентами на роль опухолевых предшественников (Dono et al., 2004), хотя степень сходства этих групп опухолевых и нормальных клеток требует дальнейшего изучения.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было разделение В-клеточных лимфом и нормальных В-лимфоцитов по уровню экспрессии генов сигнальных BCR-ассоциированных белков. Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Подробно охарактеризовать и разбить на подгруппы выборку первичных CD5+ В-клеточных лимфом с использованием ключевых диагностических методов.

2. Определить уровни экспрессии мРНК генов сигнальных компонентов BCR-каскада (CD79A, CD79B, LYN, SYK, ZAP70, SHP1) в неотсортированных пробах CD5+ В-клеточных лимфом для выявления различий между разными нозологическими формами с известным фенотипом.

3. Составить подробное иммунофенотипическое описание наиболее похожей на клетки В-ХЛЛ субпопуляции нормальных CD5+ В-лимфоцитов человека, локализующейся в миндалинах.

4. Отсортировать чистые популяции нормальных CD5- В-лимфоцитов периферической крови и CD5+ В-лимфоцитов миндалин человека, а также опухолевых лимфоцитов В-ХЛЛ.

5. Определить и сравнить уровни экспрессии мРНК генов сигнальных компонентов BCR-каскада (CD79A, CD79B, LYN, SYK, ZAP70, SHP1) в отсортированных пробах опухолевых и неопухолевых лимфоцитов человека.

Новизна исследования.

1. Впервые с помощью современных диагностических методов удалось выделить группу лимфом «серой зоны» с фенотипом, промежуточным между В-ХЛЛ и ЛКМЗ. Таким образом, выборка CD5+ лимфом человека была разделена на 3 подгруппы для последующего исследования экспрессии генов сигнальных белков.

2. Использование корректной стратегии нормализации данных ПЦР в реальном времени позволило найти различия между 3 группами CD5+ В-клеточных лимфом по уровням экспрессии РНК генов сигнальных белков BCR-каскада.

3. Получен подробный иммунофенотип малой субпопуляции CD5+ неопухолевых В-клеток миндалин человека.

4. Сравнение отсортированных опухолевых клеток В-ХЛЛ и нормальных В-лимфоцитов показало пониженный уровень экспрессии генов сигнальных белков за исключением гена CD79A в опухоли по сравнению со всеми нормальными контролями.

5. Сравнение чистых популяций неопухолевых В-лимфоцитов из разных источников позволило установить, что профиль экспрессии генов сигнальных белков в нормальных В-клетках универсален и достоверные различия имеются только в уровнях экспрессии мРНК гена ZAP70.

Научно-практическая значимость исследования. Полученные результаты могут быть применены в дифференциальной диагностике лимфоидных опухолей. Данные об экспрессии сигнальных белков, участвующих в проведении сигнала от В-клеточного рецептора, в субпопуляциях опухолевых и нормальных В-лимфоцитов могут быть использованы в курсах лекций по иммунологии, гематологии и клеточной биологии. Апробация работы. Материалы диссертации доложены на международных конференциях: международной конференции «Experimental Hematology Association» (2010), второй Международной Школе по практической проточной цитометрии (Москва, 2011) и 18-й международной конференции «18th Leipziger Workshop on Cytomics and

Congenital Heart Disease» (Лейпциг, 2013), а также обсуждены 1 апреля 2015 года на специализированном семинаре кафедры клеточной биологии и гистологии Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова. Работа поддержана 1-месячной стипендией ICRETT Union for International Cancer Control (UICC).

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 3 тезисов международных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописи и состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», заключения, выводов и приложений. Работа содержит 18 рисунков и 13 таблиц. Библиографический материал включает в себя ссылки на 251 источник литературы. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Научная новизна и практическая значимость работы

В-клетки - потомки общего лимфоидного предшественника, прошедшего в процессе дифференцировки и созревания ряд стадий с последовательной сменой поверхностного иммунофенотипа, эпигенетического и транскрипционного профилей. Основополагающую роль в выживании и дифференцировке В-лимфоцита играет сигнал фосфорилирования, получаемый через В-клеточный рецептор (BCR): митогенные и антиапоптотические сигналы передаются в ядро через BCR и ко-рецепторные комплексы. В зависимости от привлеченных ко-рецепторов сигнал может изменяться и приводить к разным последствиям для В-клетки. Помимо специфического комплекса BCR на поверхности В-клетки находится большой набор различных молекул, являющихся рецепторами, ко-рецепторами, лигандами, транспортерами или молекулами адгезии. Вместе они обеспечивают активацию В-клеток, их миграцию в организме по сложным траекториям и, в конечном счете, выполнение их функции в составе иммунной системы.

Набор поверхностных молекул на мембране В-лимфоцита позволяет дать развернутую характеристику его происхождения и функционального состояния. Значительный объем информации о структуре, функциях и паттернах экспрессии поверхностных антигенов, накопленный на сегодняшний день, позволяет описывать многообразие В-клеточных субпопуляций в норме, а также при патологических состояниях. Так, диагностика В-клеточных лимфом базируется на развернутом описании поверхностных антигенов. Однако поиск сходств и различий между нозологическими группами зачастую ограничивается анализом поверхностных маркеров и мутационного статуса В-клеточного рецептора, и не касается экспрессии проводящих элементов сигнального BCR-каскада, расположенных в цитоплазме.

Передача сигнала от зрелого BCR обеспечивается BCR-ассоциированными тирозинкиназами и тирозинфосфатазами (SYK, LYN, SHP-1, ZAP-70), которые активируют универсальные сигнальные молекулы - PI3K, PLC, РКВ и РКС (DeFranco, 1997; Geisberger et al., 2003; Harwood, Batista, 2010). Эффекторными молекулами BCR-каскада являются транскрипционные факторы, обеспечивающие размножение и выживание клеток. Так как важнейшие характерные свойства опухолевых клеток обусловлены аномальным функционированием сигнальных путей, контролирующих клеточный цикл и апоптоз (Hanahan, Weinberg, 2000; Hanahan, Weinberg, 2011), актуальным представляется изучение экспрессии сигнальных белков BCR-каскада в различных В-клеточных лимфомах. В гетерогенной группе не-Ходжкинских лимфом выделяется значительная подгруппа В-зрелоклеточных лимфом с неканонической экспрессией маркера CD5. Наибольшую часть случаев в Восточной Европе составляет В-клеточный хронический лимфолейкоз (В-ХЛЛ) (Sant et al., 2010), более редким и более агрессивным заболеванием является лимфома из клеток мантийной зоны (ЛКМЗ). Кроме того, выделяется ряд промежуточных форм между В-ХЛЛ и ЛКМЗ, представляющих трудность для современной диагностики (Zhao, 2009). Отправной точкой в исследовании сигналинга CD5+ В-клеточных опухолей стало разделение группы В-ХЛЛ на две подгруппы по способности запускать BCR-каскад (Lankester et al., 1995; Chiorazzi et al., 2005). На сегодняшний день для клеток В-ХЛЛ были показаны аберрантные уровни экспрессии верхних проводящих компонентов BCR сигнального каскада: CD79b (Cajiao et al., 2007), тирозинкиназ SYK и LYN, а также добавление к общему опухолевому фенотипу неканонической тирозинкиназы ZAP-70 (Chen et al., 2002, Seda, Mraz, 2015). Исследований BCR-ассоциированных сигнальных белков для других CD5+ В-клеточных лимфом проводилось сравнительно мало. На основании данных об гиперэкспрессии циклина D1 и общем высоком уровне активации клеток ЛКМЗ при общем низком уровне фосфорилирования сигнальных компонентов был сделан вывод об их неспособности проводить сигнал извне (de Boer et al., 1997). Исследования методом microarray показали значительно повышенные уровни компонентов РІЗК-Akt и Wnt сигнальных путей при ЛКМЗ, но данные о BCR-ассоциированных молекулах в них отсутствовали (Rizzatti et al., 2005).

Проблема клеток-предшественников CDS-положительных лимфом также представляет значительный интерес: ведется поиск субпопуляции нормальных В-клеток, наиболее близкой к В-ХЛЛ по фенотипу (Klein, Dalla-Favera, 2005). CD5+ В-клетки миндалин человека являются важными претендентами на роль опухолевых предшественников (Dono et al., 2004), хотя степень сходства этих групп опухолевых и нормальных клеток требует дальнейшего изучения.

Целью данной работы было разделение В-клеточных лимфом и нормальных В-лимфоцитов по уровню экспрессии генов сигнальных BCR-ассоциированных белков. Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Подробно охарактеризовать и разбить на подгруппы выборку первичных CD5+ В-клеточных лимфом с использованием ключевых диагностических методов. 2. Определить уровни экспрессии мРНК генов сигнальных компонентов BCR-каскада (CD79A, CD79B, LYN, SYK, ZAP70, SHP1) в неотсортированных пробах CD5+ В 6 клеточных лимфом для выявления различий между разными нозологическими формами с известным фенотипом. 3. Составить подробное иммунофенотипическое описание наиболее похожей на клетки В-ХЛЛ субпопуляции нормальных CD5+ В-лимфоцитов человека, локализующейся в миндалинах. 4. Отсортировать чистые популяции нормальных CD5- В-лимфоцитов периферической крови и CD5+ В-лимфоцитов миндалин человека, а также опухолевых лимфоцитов В хлл. 5. Определить и сравнить уровни экспрессии мРНК генов сигнальных компонентов BCR каскада (CD79A, CD79B, LYN, SYK, ZAP70, SHP1) в отсортированных пробах опухолевых и неопухолевых лимфоцитов человека.

Антиген-зависимоый этап созревания В-клеток

Помимо исследований механизмов малигнизации клеток, вопрос о происхождени опухолей включает в себя также и поиск их нормальных клеток-предшественников. Этот вопрос широко обсуждается в литературе и в случае с опухолями лимфатической системы однозначный ответ не всегда достижим из-за большого разнообразия вариантов поверхностного иммунофенотипа лимфоцитов и его частых смен на протяжении жизни клетки по мере прохождения ею разных функциональных стадий. Наличие на клетках В-ХЛЛ и ЛКМЗ неканонического маркера CD5 долгое время считалось одним из основных проявлений их опухолевой природы и до сих пор заставляет рассматривать нормальные CD5+ В-клетки как их наиболее возможных предшественников. Исторически, небольшая субпопуляция нормальных В-клеток, несущих CD 5 на поверхности, впервые была описана у мышей и названа В1 (или В 1а) клетками. Они отличаются от обычных В-лимфоцитов (В2- или ВО-клеток по разной номенклатуре) по целому ряду иммунофенотипических признаков (уровням экспрессии IgM, IgD, CD43 и CD45), а также по локализации и функции в организме. У мышей В1а клетки были изучены наиболее подробно: это долгоживущие, крупные клетки, демонстрирующие повышенные величины как прямого, так и бокового светорассеяния. Помимо коэкспрессии CD5/CD19, они имеют иммунофенотип: CD45 low, CD23", CD43+, IgM high, IgD low. Эти клетки обнаруживаются в плевральной и перитонеальной полостях (Berland, Wortis, 2002). Большинство работ по исследованию локализации и функций Bla-клеток в организме также проводились на мышах. Преобладает мнение, что эта линия В-лимфоцитов выделяется на ранних этапах в эмбриогенезе и далее существует обособленно и независимо от других В-лимфоцитов постнатального костного мозга. Вторая гипотеза опирается на результаты опытов по индуцированной дифференцировке in vitro и заключается в том, что иммунофенотип Bla-клеток приобретается нормальными В2-лимфоцитами в ответ на их стимуляцию Т-независимыми (ТІ-2) антигенами (Faragasan, Honjo, 2000).

У человека, как и у мышей, по наличию маркера CD5 была выделена субпопуляция так называемых «В-клеток врожденного иммунитета», зачастую в обзорах CD5+ В-лимфоциты мыши и человека рассматриваютя вместе (Sindhava, Bondada, 2012). Однако из-за серьезных различий в строении иммунной системы этих двух видов прямые аналогии не всегда корректно проводить. Не следует также забывать, что у других видов млекопитающих (например, в периферической крови кролика) все В-лимфоциты могут быть положительны по CD5 (Raman, Knight, 1992).

У человека локализация CD5+ В-лимфоцитов преимущественно связана с лимфоидной тканью слизистых оболочек (mucosa-associated lymphoid tissue, MALT), преимущественно с областью кольца Пирогова-Вальдейера. Это объясняется тем, что в иммунологическом плане она одна из самых активных, и разнообразие В-клеточных популяций в ней наибольшее (Bienenstock, 1982; Lugton, 1999; Dono et al., 2004). По данным разных авторов, количество CD5+ В-клеток в составе лимфоидной ткани миндалин может достигать 30% от общего числа В-лимфоцитов (Dono et al., 1996). Их количество является индивидуальной характеристикой человека и снижается с возрастом в связи с развитием системы приобретенного иммунитета. Было показано, что маркер CD5 экспрессируют В-клетки мантии вторичного фолликула, а также некоторые лимфоциты субэпителиальной зоны миндалин, весьма гетерогенной по клеточному составу. В-лимфоциты, коэкспрессирующие в норме поверхностные маркеры CD5 и CD 19, по аналогии с мышиными, иногда называются Bla-клетками. Уровень экспрессии CD5 27 на таких В-клетках сильно снижен по сравнению, как с нормальными Т-клетками, так и с опухолевыми В-клетками. CD5+ В-клетки миндалин человека являются важными претендентами на роль опухолевых предшественников (Dono et al., 2004).

CD5+ В-клетки относят к первой линии защиты организма от инфекции. Основной их функцией является выработка так называемых «натуральных» антител, выявляющихся в организме даже при отсутствии антигенной стимуляции. Это, как правило, IgM-антитела, обладающие пониженной аффиннностью, часто поли- и аутореактивные. На ранних этапах жизни организма эти клетки замещают более специфичную, но еще не до конца развитую в это время стандартную систему В-клеточной защиты. В отличие от других В-лимфоцитов, CD5+ В-клетки используют лишь небольшой эмбриональный набор V-генов для продукции иммуноглобулинов. Помимо реакций на бактериальные патогены они демонстрируют слабую аутореактивность. Возможно, это играет роль при удалении апоптотических продуктов в организме (Duan В, Morel L, 2006). Считается также, что этот тип клеток специально проходит положительную селекцию на реакцию с аутоантигенами, что позволяет им приобрести крайне важную в эволюционном плане специфичность к наиболее распространенным антигенным эпитопам.

Если придерживаться гипотезы о многоуровневой организации иммунной системы (Tung et al., 2004), CD5+ В-клетки принадлежат к более раннему уровню организации, экспрессируя молекулярный репертуар, направленный на общее распознавание патогена, а не на антигенспецифичность и высочайшую аффинность антител (Baumgarth et al., 2005). При этом риск возникновения аутоиммунных реакций в процессе развития этих клеток сведен к минимуму: они не контактируют с Т-хелперами, не проходят связывание поверхностной молекулы CD40 и не направляются в терминальные центры фолликулов лимфатических узлов, а значит, не проходят перестройку рецептора, повышающую аффинность продуцируемых ими антител. Также для них не является характерным и сдвиг изотипа от IgM к IgG.

Как было сказано ранее, поверхностная молекула CD5 была изначально описана на Т-клетках и на В-клетках при ряде патологических состояний. Долгое время экспрессия этого поверхностного маркера считалась нехарактерной для нормальных В-клеток. Помимо набора В-клеточных опухолей, повышенные количества CD5+ В-клеток выявляются у человека при аутоиммунных процессах (ревматоидный артрит, системная красная волчанка, некоторые органоспецифические аутоиммунные заболевания (Youinou, 1993; Youinou, Renaudineau, 2011). Однако это не означает, что именно они являются продуцентами основной массы аутоантител. Имеются сведения, что при наличии тяжелых аутоиммунных расстройств вырабатываются IgG-антитела повышенной аффинности и основными их продуцентами являются В-лимфоциты, не несущие поверхностного CD5 (Shirai et al., 1991). Несмотря на это, CD5+ В-клетки были

28 поставлены посередине между двумя крупными патологическими процессами: аутоиммунными и малигнизационными. Важную роль в этом сыграл и тот факт, что при В-ХЛЛ в качестве осложнений часто встречаются аутоиммунная гемолитическая анемия и тромбоцитопения. В литературе появился ряд статей, указывающих на особенную подверженность CD5+ В-клеток трансформации (Dighiero, 1996; Pritsch et al., 1998; Pers et al., 1999). В качестве причины такой особенности предполагалась постоянная стимуляция рецептора этих клеток аутоантигенами, способствующая их малигнизации. Альтернативная версия заключалась в том, что CD5+ В-клетки относятся к фетальной самоподдерживающейся линии В-клеток, имеют селективное преимущество перед более поздними лимфоцитами и специальные генетические программы, нацеленные на повышение их выживаемости. Однако из-за отсутствия исчерпывающих доказательств того, что CD5+ В-лимфоциты - это целиком обособленная популяция, не связанная с остальными лимфоидными предшественниками, эта гипотеза находится под вопросом.

В норме больше всего CD5+ В-клеток детектируется в пуповинной крови и у детей в первые годы жизни (Hannet et al., 1992). Со временем их количество снижается, очевидно, по мере того, как в дополнение к системе врожденного иммунитета развивается система адаптивного иммунитета. Второй всплеск количества CD5+ В-клеток наблюдается у людей пожилого возраста (Veneri et al., 2007), зачастую выливающийся в так называемый MBL-синдром - повышенный В-лимфоцитоз, не перетекающий в опухолевый процесс. К сожалению, подробных сравнений между CD5+ клетками ранних и поздних этапов жизни человека не проводилось. Недавно также была выявлена постоянно присутствующая в крови минорная популяция В-клеток, экспрессирующая CD5 на низком уровне, которая у людей получила название регуляторных В-клеток (Griffin et al., 2011). Предстоит выяснить их связь с другими CD5+ популяциями нормальных В-лимфоцитов, а также с CD5+ лимфомами (Chiorazzi, Ferrarini, 2003).

Таким образом, проблема клеток-предшественников CD5+ лимфом представляет значительный интерес и исследуется в различных аспектах. Ведется поиск субпопуляции нормальных В-клеток, наиболее близкой к В-ХЛЛ по иммунофенотипу, в основном внимание исследователей привлекает область подслизистой лимфоидной ткани миндалин. Многие авторы склонны полагать, что именно эта популяция клеток и дает начало В-ХЛЛ, хотя окончательно это не было показано и степень сходства групп опухолевых и неопухолевых клеток требует дальнейшего изучения.

Проточная цитофлуориметрия

В первой части работы были исследованы 79 образцов первичных В-клеточных лимфом человека (61 образец мононуклеаров периферической крови, 4 образца костного мозга, 9 образцов суспензии лимфатических узлов и 5 образцов суспензии селезенок). Для 77 образцов было проведено иммунофенотипирование клеток в суспензии методом проточной цитофлуориметрии. Диагноз «В-клеточное лимфопролиферативное заболевание» устанавливался путем анализа количества В-клеток в образце и их клональности по легким цепям иммуноглобулина (Рисунок 3). Преобладание одного из двух вариантов легких цепей иммуноглобулина может быть детектировано на высоком уровне простым поверхностным окрашиванием В-лимфоцитов, как в случае лимфомы из клеток мантийной зоны. Однако в некоторых случаях легкие цепи иммуноглобулинов не детектируются на поверхности клетки и требуют цитоплазматического окрашивания для визуализации клона, что в наибольшей степени характерно для клеток В-ХЛЛ.

Образцы солидных тканей были дополнительно описаны посредством гистологического и иммуногистохимического окрашивания на парафиновых срезах. Примеры гистологического (гематоксилин + эозин) и иммуногистохимического (пероксидаза/диаминобензидин + гематоксилин) окрашиваний парафиновых срезов ткани селезенки приведены на Рисунке 4 и Рисунке 5 соответственно.

Кроме того, для образцов было определено относительное нормализованное количество кДНК гена циклина D1, что является фактором дифференциального диагноза для лимфомы из клеток мантийной зоны. Разделение образцов по нозологическим формам проводилось согласно рекомендациям ВОЗ (WHO lymphomas classification, 2001) на базе иммунофенотипа, гистологической картины (для солидных опухолей) и данных об экспрессии гена циклина D1 (BCL1/CCND1).

Анализ клоналъности В-лимфоцитов человека при иммунофенотипировании методом проточной цитофлуориметрии. Окрашивание поликлоналъными кроличьими антителами kappa-FITC, lambda-PE (Dako). (А-Г) Клоналъностъ опухолевых клеток выявляется как при поверхностном, так и при внутриклеточном окрашивании; (Д-3) Клоналъностъ опухолевых клеток выявляется только при внутриклеточном окрашивании, фенотип «low»; (И-М) Клетки поликлоналъны. А,Д,И - выделение лимфоцитарного полигона в суспензии живых клеток; Б,Е,К двойное поверхностное флуоресцентное окрашивание; В,Ж,Л - изменение формы лимфоцитарного полигона после фиксации и пермеабилизации клеток; Г,3,М двойное внутриклеточное флуоресцентное окрашивание.

Морфология опухолевых и неопухолевых образцов ткани селезенки. Окрашивание гематоксилином и эозином. Объектив х10. Масштабный отрезок - 50 мкм. А - реактивный процесс. Соотношение между красной и белой пульпой умеренно смещено в пользу последней. Белая пульпа представлена умеренно гиперплазированными селезеночными муфтами типичного строения. Тяжи красной пульпы инфильтрированы клетками гранулоцитарного ряда на разных стадиях созревания, а также лимфоидными клетками и немногочисленными макрофагами. Митозы не встречаются. Б - В-клеточная опухоль (В-ХЛЛ). Соотношение между красной и белой пульпой смещено в пользу последней. Лимфоидная ткань характеризуется диффузным ростом и представлена в основном мелкими клетками с округлыми ядрами. Митозы не встречаются. В - В-клеточная опухоль (ЛКМЗ). Морфология ткани полностью нарушена, все пространство среза заполнено диффузным, умеренно полимофным клеточным пролифератом. Митозы не встречаются.

Иммуногистохимическое окрашивание последовательных срезов образца опухолевой ткани селезенки. Объектив х10. Масштабный отрезок - 50 мкм. А - anti-CD3. Позитивна небольшая часть клеток, расположенных диффузно. Б - anti-CD5. Позитивно большинство клеток на срезе. В - anti-CD79a. Позитивно большинство клеток на срезе. Г -anti-CD20. Позитивно большинство клеток на срезе, окрашивание яркое. Д - anti-CD23. Большая часть клеток на срезе позитивна. Е - anti-cyclin D1. Позитивны ядра малочисленных лимфоидных клеток, образующих небольшие рыхлые скопления. Лимфоидная ткань характеризуется диффузным ростом и представлена в основном мелкими клетками с округлыми ядрами. Митозы не встречаются. Наблюдаемая картина соответствует В-ХЛЛ.

Дальнейшей задачей работы было разделение образцов В-клеточных лимфом по нозологическим группам при помощи комплексной оценки диагностических факторов. Выборка из 79 образцов была разделена на 3 группы: ЛКМЗ, В-ХЛЛ и лимфомы «серой зоны».

Лимфома из клеток мантийной зоны (ЛКМЗ) имеет характерный иммунофенотип CD19+/CD5+/CD20+/CD22+/CD23-/FMC7+ (Рисунок 6). Для опухолевых клеток характерны высокие уровни экспрессии поверхностных ко-рецепторных молекул, ассоциированных с BCR, и легких цепей иммуноглобулина (Рисунок 3, А-Г). Также В-лимфоциты ЛКМЗ отрицательны или слабо положительны по поверхностному маркеру CD43 и, как правило, положительны по маркеру активации CD38. Отличительной чертой лимфомы из клеток мантийной зоны является наличие ведущей хромосомной транслокации t(ll;14) и гиперэкспрессия гена циклина D1 (CCND1).

В исследуемой выборке первичных В-клеточных лимфом 27 случаев были классифицированы как ЛКМЗ. Возраст пациентов составлял от 27 до 77 лет (медиана - 58 лет). В одном случае опухолевые В-клетки не несли на поверхности маркер CD5, однако образец был включен в выборку на основании сведений о транслокации, гиперэкспрессии циклина D1 и клинических данных. Также в выборку было включено 5 случаев, отрицательных по маркеру FMC7, но соответствующих ЛКМЗ по остальным параметрам иммунофенотипа и уровню экспрессии гена циклина D1. Уровень экспрессии поверхностных ко-рецепторных молекул CD20 и CD22, а также легких цепей иммуноглобулина был высоким на опухолевых клетках во всех образцах. Маркер CD23 отсутствовал или был экспрессирован слабо. Относительное нормализованное количество кДНК гена циклина D1 в выборке ЛКМЗ составляло от 0,0145 до 107,19 (медиана - 4,414). Для 7 пациентов из 27 дополнительно было известно о наличии хромосомной транслокации. Полное описание образцов ЛКМЗ приведено в Приложении 1.

Определение уровней экспрессии мРНК генов сигнальных белков BCR каскада в опухолевой и реактивной лимфоидной ткани

Так как субпопуляция CD5+CD19+ В-клеток считается наиболее всего похожей на CD5+ В-клеточные опухоли по иммунофенотипу и из-за этого часто называется нормальным предшественником В-ХЛЛ, в данной работе они использовались в качестве нормальных контролей для оценки уровней экспрессии генов сигнальных белков BCR-каскада.

Для определения уровней экспрессии генов BCR-ассоциированных сигнальных молекул в чистых популяциях была предпринята сортировка клеток с многоцветной флуоресцентной меткой при помощи FACS сортера. Были отсортированы CD5+ В-клетки из 23 образцов В-ХЛЛ и 10 образцов суспензии миндалин. Дополнительно в качестве контроля были отсортированы Т-клетки периферической крови здоровых доноров и В-клетки периферической крови здоровых доноров, которые в норме не несут на поверхности маркер CD5.

Эффективность сортировки во всех случаях превысила 98%.

Из отсортированных образцов опухолевых и неопухолевых клеток была выделена РНК, транскрибирована кДНК и поставлена полимеразная цепная реакция в реальном времени для оценки уровней экспрессии генов сигнальных молекул BCR-каскада в Т- и В-клетках периферической крови, в субпопуляции CD5+ В-клеток миндалин, а также в отсортированных образцах В-ХЛЛ.

Значения относительных нормализованных уровней экспрессии генов в выборках не подчиняются законам нормального распределения, как и в случае с неотсортированными пробами (Рисунок 16). Для статистического анализа, таким образом, использовались разброс, медиана и тест Манна-Уитни для сравнения выборок.

Для LYN (Рисунок 16, А) разброс значений относительных нормализованных уровней экспрессии составил от 1,84 до 0,05 (медиана - 0,24) в выборке отсортированных образцов В-ХЛЛ; от 0,09 до 0 (медиана - 0,01) в выборке отсортированных Т-клеток периферической крови; от 3,49 до 0,35 (медиана - 0,68) в выборке отсортированных В-клеток периферической крови; от 17,28 до 0,60 (медиана - 2,62) в выборке отсортированных CD5+ В-клеток миндалин. Статистически достоверные отличия (р 0,05) были получены для медианы группы отсортированных Т-клеток (самый низкий уровень экспрессии LYN, в 5 случаях из 10 не детектируемый) и медиан всех других групп. Кроме того, достоверные отличия были получены для медианы отсортированных образцов В-ХЛЛ и медиан всех других групп (экспрессия гена LYN при В-ХЛЛ выше, чем в Т- и ниже ,чем в нормальных В-клетках). Достоверных отличий между группами неопухолевых В-лимфоцитов периферической крови и CD5+ В-лимфоцитами миндалин обнаружено не было.

Для SHP1 (PTPN6) (Рисунок 16, Б) разброс значений относительных нормализованных уровней экспрессии составил от 4,63 до 0,01 (медиана - 0,53) в выборке отсортированных образцов В-ХЛЛ; от 2,70 до 0,24 (медиана - 0,91) в выборке отсортированных Т-клеток периферической крови; от 3,56 до 0,33 (медиана - 2,17) в выборке отсортированных В-клеток периферической крови; от 14,00 до 0,61 (медиана - 2,81) в выборке отсортированных CD5+ В-клеток миндалин. Достоверные отличия (р 0,05) были обнаружены для медианы выборки отсортированных Т-клеток периферической крови и медиан выборок неопухолевых В-клеток (как В-клеток периферической крови, так и от CD5+ В-клеток миндалин), но не для медианы выборки отсортированных Т-клеток и медианы выборки отсортированных образцов В-ХЛЛ. Выборка отсортированных образцов В-ХЛЛ также достоверно отличается от двух выборок неопухолевых В-клеток по уровню экспрессии SHP1. Достоверных отличий между группами неопухолевых В-лимфоцитов периферической крови и CD5+ В-лимфоцитами миндалин обнаружено не было.

Для SYK (Рисунок 16, В) разброс значений относительных нормализованных уровней экспрессии составил от 5,79 до 0,08 (медиана - 0,68) в выборке отсортированных образцов В-ХЛЛ; от 0,91 до 0,02 (медиана - 0,06) в выборке отсортированных Т-клеток периферической крови; от 12,97 до 5,32 (медиана - 7,03) в выборке отсортированных В-клеток периферической крови; от 26,81 до 1,80 (медиана - 3,12) в выборке отсортированных CD5+ В-клеток миндалин. Статистически достоверные отличия (р 0,05) были получены для медианы группы отсортированных Т-клеток и медиан всех других групп, а также для медианы выборки отсортированных образцов В-ХЛЛ и медиан всех других групп (экспрессия гена SYK при В-ХЛЛ выше, чем в образцах Т-клеток и достоверно ниже, чем в нормальных В-клетках). Достоверных отличий для медиан групп неопухолевых В-лимфоцитов крови и неопухолевых CD5+ В-лимфоцитов миндалин обнаружено не было.

Для ZAP70 (Рисунок 16, Г) разброс значений относительных нормализованных уровней экспрессии составил от 0,78 до 0 (медиана - 0,07) в выборке отсортированных образцов В-ХЛЛ. В отсортированных образцах сохранилась та же тенденция, что и в неотсортированных пробах В-ХЛЛ (Рисунок 9, Г): общая выборка В-ХЛЛ делится на группы с низким и высоким уровнем экспрессии мРНК ZAP70. Полученные результаты позволяют утверждать, что подобный разброс является следствием разных свойств опухолевых клеток В-ХЛЛ у разных пациентов и никак не зависит от примесей Т-клеток в пробе. В выборках неопухолевых контролей разброс значений относительных нормализованных уровней экспрессии ZAP70 составил от 2,42 до 0,66 (медиана - 1,30) в выборке отсортированных Т-клеток периферической крови; от 0,68 до 0,02 (медиана - 0,08) в выборке отсортированных В-клеток периферической крови; от 0,45 до 0,06 (медиана - 0,22) в выборке отсортированных CD5+ В-клеток миндалин. Статистически достоверные отличия (р 0,05) удалось получить для медианы группы отсортированных Т-клеток (самый высокий уровень экспрессии ZAP70) и медиан всех других групп. Также достоверные отличия были получены для медиан групп В-клеток периферической крови и CD5+ В-клеток миндалин (в миндалинах уровень экспрессии гена ZAP70 достоверно повышен по сравнению с периферической кровью). Достоверных отличий для медианы выборки отсортированных образцов В-ХЛЛ и медиан выборок неопухолевых В-клеток (как В-клеток периферической крови, так и от CD5+ В-клеток миндалин) получить не удалось из-за большого разброса значений в выборке В-ХЛЛ. 100-1