Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Структура эндоглина 14
1.2. Тканевая и клеточная экспрессия эндоглина 17
1.3. Взаимодействие эндоглина с растворимыми факторами и их рецепторами 20
1.4. Участие эндоглина в клеточном сигналинге 23
1.5. Экспериментальные исследования роли эндоглина в биологии клеток
1.5.1. Роль эндоглина в регуляции пролиферации клеток 29
1.5.2. Роль эндоглина в регуляции миграции и инвазии клеток 31
1.5.3. Эффекты экспрессии эндоглина на адгезионные свойства клеток и организацию их цитоскелета 35
1.5.4. Иммунологические функции эндоглина 37
1.5.5. Регуляция процессов аутофагии в клетках эндотелия посредством эндоглина 38
1.5.6. Регуляция продукции растворимой формы эндоглина
1.6. Роль эндоглина в эмбриональном развитии 39
1.7. Роль эндоглина в патогенезе заболеваний человека
1.7.1. Онкологические заболевания солидной природы 40
1.7.2. Онкогематологические заболевания 41
1.7.3. Наследственная геморрагическая телангиэктазия I типа (HHT1) 42
1.7.4. Патологии беременности 43
1.7.5. Атеросклероз 44
1.8. МКАТ к эндоглину человека и области их применения 46
1.8.1. МКАТ к эндоглину, охарактеризованные в научной литературе 46
1.8.2. Применение МКАТ к эндоглину в иммуногистохимических исследованиях 49
1.8.3. Использование МКАТ к эндоглину в методах неинвазивной диагностики онкологических заболеваний 52
1.8.4. МКАТ к эндоглину как средство направленной доставки токсинов в опухоль 53
1.8.5. МКАТ к эндоглину как средство для анти-ангиогенной терапии онкологических заболеваний 54
1.8.6. Выявление растворимой формы эндоглина в биологических жидкостях 59
ГЛАВА 2. Материалы и методы 63
2.1. Получение рекомбинантных молекул эндоглина 63
2.1.1. Методы очистки и визуализации нуклеиновых кислот 63
2.1.2. Клонирование фрагментов кДНК эндоглина в векторные конструкции 63
2.1.3. Методы культивирования и электротрансформации клеток E.coli 66
2.1.4.Экспрессия и очистка рекомбинантных молекул эндоглина, синтезированных в клетках E.coli 67
2.2. Протоколы иммунизации мышей рекомбинантными молекулами эндоглина 68
2.3. Создание гибридом и получение МКАТ к эндоглину
2.3.1. Гибридизация спленоцитов мыши с миеломными клетками 68
2.3.2. Селекция гибридом-продуцентов антител 69
2.3.3. Наработка и очистка МКАТ 69
2.4. Иммунохимические методы, использованные для выявления молекул эндоглина и специфичных к ним антител 70
2.4.1. Получение рекомбинантных молекул эндоглина, меченных биотином 70
2.4.2. Перйодатный метод конъюгирования МКАТ с пероксидазой хрена
2.4.4. Иммуноферментный анализ 71
2.4.5. Электрофорез и вестерн-блот белков 73
2.4.6. Иммунопреципитация молекул эндоглина из плазмы крови человека 74
2.4.7. Выявление эндоглина на гистологических срезах 75
2.4.8. Определение локализации эндоглина на клетках методом иммунофлуоресценции 75
2.4.9. Выявление экспрессии эндоглина на клетках с помощью метода проточной цитофлуориметрии
2.5. Культуры клеток млекопитающих, использованные в работе 76
2.6. Методы оценки жизнеспособности клеток 77
2.7. Референтные реагенты и наборы 78
2.8. Методы статистической обработки и визуализации данных 78
ГЛАВА 3. Результаты 80
3.1. Получение, характеристика и исследование иммуногенности рекомбинантных молекул эндоглина 80
3.1.1. Анализ аминокислотных последовательностей эндоглина человека и мыши 80
3.1.2. Исследование экспрессии эндоглина различными культурами клеток человека 81
3.1.3. Получение и характеристика рекомбинантных молекул эндоглина 82
3.1.4. Определение иммунохимических методов выявления антител к эндоглину 86
3.1.5. Исследование иммуногенности рекомбинантных молекул эндоглина для мышей F1(SJL/JBALB/c)
3.2. Создание гибридом-продуцентов МКАТ к эндоглину человека 88
3.3. Исследование иммунохимических свойств полученных МКАТ к эндоглину и определение областей их применения
3.3.1. Иммунохимическая характеристика МКАТ 89
3.3.2. Использование МКАТ к линейным эпитопам для выявления эндоглина методами вестерн-блота и иммуногистохимии 93
3.3.3. Использование МКАТ к конформационным эпитопам для выявления экспрессии эндоглина на живых и фиксированных клетках 95
3.4. Создание двухцентровой системы ИФА для количественного определения растворимой формы эндоглина 99
3.4.1. Подбор комплиментарных пар МКАТ и исследование их свойств 99
3.4.2. Характеристика двухцентровой системы ИФА 4Е4-4С9 106
3.5. Возможности применения созданных МКАТ к эндоглину в качестве инструментов для изучения биологии клеток 109
3.5.1. Исследование изменений в экспрессии эндоглина клетками эндотелия и МСК при культивировании в различных режимах 111
3.5.2. Исследование динамики обновления молекул эндоглина на мембране клеток 112
3.5.3. Исследование образования молекул растворимого эндоглина в культурах клеток 113
ГЛАВА 4. Обсуждение 118
Выводы 127
Список литературы
- Участие эндоглина в клеточном сигналинге
- МКАТ к эндоглину, охарактеризованные в научной литературе
- Протоколы иммунизации мышей рекомбинантными молекулами эндоглина
- Характеристика двухцентровой системы ИФА 4Е4-4С9
Участие эндоглина в клеточном сигналинге
Экспрессия эндоглина обнаружена в клетках сердечнососудистой, кроветворной, выделительной, дыхательной и репродуктивной систем человека. CD105 выявляют на клетках стромы различных органов и опухолевых новообразований. Эндоглин экспрессирует ряд постоянных клеточных линий.
Клетки эндотелия кровеносных сосудов обладают умеренным уровнем экспрессии эндоглина (Gougos, Letarte, 1988b; O Connell et al., 1992; Wong et al., 2000). Высокой плотностью антигена характеризуются лишь трабекулярные вены белой пульпы селезенки (Dagdeviren et al., 1998), венулы с высоким эндотелием лимфатических узлов, и эндотелиальная выстилка клапанов сердца (Mercado-Pimentel et al., 2007). Экспрессия эндоглина на клетках эндотелия возрастает под действием гипоксии (Sanchez-Elsner et al., 2002; Zhu et al., 2003; Tian et al., 2010) или оксидативного стресса (La Sala et al., 2014). Доминирующей изоформой антигена является L-эндоглин. При старении клеток эндотелия происходит увеличение экспрессии S-изоформы антигена (Blanco et al., 2008). CD105 также выявляют на микрочастицах, продуцируемых клетками эндотелия при активации или апоптозе (Jimenez et al., 2003; Latham et al., 2015).
Эндоглин в норме также экспрессирован на других элементах кровеносных сосудов: клетках гладких мышц аорты (Adam et al., 1998; Conley et al., 2001) и перицитах (Barry et al., 1999). Ряд авторов отождествляют перициты с МСК (Caplan, 2008). Эти клетки характеризуются наивысшим уровнем экспрессии антигена. При дифференциации МСК происходит постепенное снижение плотности эндоглина на мембране (Jin et al., 2009).
В настоящее время CD105 признан молекулярным маркером клеток эндотелия (Banerjee et al., 2011) и мезенхимных стволовых клеток (Barry et al., 1999). В красном костном мозге взрослого человека экспрессия эндоглина обнаружена только на поверхности клеток проэритробластов (Buhring et al., 1991; Rokhlin et al., 1995). У плода он также выявлен на пре-В-лимфоцитах (Rokhlin et al., 1995). Исследование гематопоэтических стволовых клеток мыши показало наличие высокого уровня экспрессии эндоглина на клетках мегакариоцитарно-эритроцитарной линии дифференцировки и умеренного уровня на клетках гранулоцитарно-моноцитарной линии (Pronk et al., 2008). Моноциты периферической крови характеризуются низкой экспрессией CD105. Однако их дифференциация в тканевые макрофаги сопровождается повышением плотности этого рецептора на мембране (O Connell et al., 1992; Ojeda-Fernandez et al., 2016). Аналогично клеткам эндотелия, при старении макрофагов происходит относительное увеличение экспрессии S-эндоглина (Aristorena et al., 2014).
Эндоглин выявлен на клетках гломерулярного мезангия почек (Rodriguez-Barbero et al., 2001; Diez-Marques et al., 2002), звездчатых клетках, миофибробластах печени (Meurer et al., 2004; Clemente et al., 2006), а также на фибробластах соединительной ткани (Gougos, Letarte, 1988b).
В первом триместре беременности для агрегатов мезенхимных клеток легких характерна низкая экспрессия эндоглина. В середине беременности этот антиген обнаруживают на перитубулярных мезенхимных клетках и клетках эндотелия периканаликулярных сосудов. На поздних этапах внутриутробного развития и после рождения экспрессия эндоглина в тканях легких характерна только для клеток сосудов альвеол, бронхиол и бронхов (Barresi et al., 2008).
Плацента характеризуется мощной экспрессией эндоглина в течение всех трех триместров беременности. Этот антиген присутствует на мембранах синцитиального и вневорсинчатого трофобласта (St-Jacques et al., 1994; Dagdeviren et al., 1998; Govender et al., 2015).
Экспрессия CD105 может быть выявлена на некоторых типах опухолевых клеток: клетках карциномы пищевода (Wong et al., 2008), лейкемических клетках (Zhang et al., 1996; Catchpoole et al., 2007; Chakhachiro et al., 2013; Vrbacky et al., 2014), клетках меланомы (Altomonte et al., 1996; Miquel-Serra et al., 2011), рака поджелудочной (Fujiwara et al., 2013), молочной (Henry et al., 2010) и предстательной желез (Kassouf et al., 2004; Lakshman et al., 2010). Примечательно, что их нетрансформированные предшественники не экспрессируют эндоглин.
Экспрессия эндоглина характерна для ряда постоянных линий клеток человека (таблица 1). Этот антиген обнаруживают на поверхности как нормальных, так и трансформированных клеток. Среди раковых клеток высокие уровни экспрессии CD105 характерны для сарком, тогда как карциномы, как правило, обладают умеренной экспрессией антигена. Особый интерес представляет собой тот факт, что некоторые клеточные линии, обладающие низкой плотностью эндоглина на мембране, концентрируют его в цитоплазме. Этот феномен показан для клеток SaOS-2, NPA, MDA-MBA-453 и COLO-853. Биологический смысл этого явления остается не ясным (Postiglione et al., 2005).
Растворимые факторы, с которыми взаимодействует эндоглин, имеют общее эволюционное происхождение и принадлежат к суперсемейству TGF-. Оно включает более 30 видов молекул. У млекопитающих цитокины этой группы подразделяют на четыре основных класса: TGF-, активины, BMP и GDF. Эти факторы синтезируются в форме незрелых предшественников, активация которых происходит путем протеолитического расщепления (ten Dijke, Arthur, 2007). Они играют активную роль в эмбриональном развитии (Francis-West et al., 1999;Nie et al., 2006; Wu, Hill, 2009; Hegarty et al., 2013), иммунном ответе (Tran, 2011; Voumvourakis et al., 2011; Biancheri et al., 2013), процессах репарации (Finnson et al., 2014; Hameedaldeen et al., 2014; Pakyari et al., 2014), ангиогенеза (Orlova et al., 2011; Jin et al., 2014; Jonker, 2014) и канцерогенеза (Bierie, Moses, 2009; Meulmeester, ten Dijke, 2010; Fabregat et al., 2013; Reader, Gold, 2015). Важной особенностью этой группы факторов является наличие сложной системы контроля их активации и рецепции. Ее развитие связано с широким распространением этих цитокинов в тканях и наличием специфичных рецепторов на множестве типов клеток (Lyons et al., 1988; Imai et al., 1997; Saharinen et al., 2000).
Лиганды рассматриваемой группы взаимодействуют с рецепторными комплексами, имеющими одинаковый тип организации. Рецепторы I и II типов являются Ser/Thr-тирозин-киназами и имеют Cys-богатые экстраклеточные домены (Lebrin et al., 2005). На мембране клеток эти молекулы экспрессированы в виде гомодимеров. При взаимодействии с лигандами происходит ассоциация двух рецепторов I типа и двух рецепторов II типа. Компоненты комплексов выполняют различные функции в генерации сигнала. Конститутивно активные рецепторы II типа активируют рецепторы I типа путем фосфорилирования их Gly/Ser последовательности. Рецепторы I типа активируются только при сборке комплексов и ответственны за специфичность генерируемого сигнала (Wieser et al., 1995). Белки III типа, к которым относятся эндоглин, бетагликан и ряд других молекул, выполняют корецепторную функцию. Они участвуют во взаимодействии с лигандами и модулируют генерируемые рецепторными комплексами сигналы (таблица 2, рис. 2).
МКАТ к эндоглину, охарактеризованные в научной литературе
Внутрисосудистая локализация эндоглина делает его легкодоступной мишенью для вводимых в кровь препаратов. На основе МКАТ к эндоглину созданы различного рода контрастирующие реагенты, обеспечивающие специфичную визуализацию сосудистой сети опухолей. Они могут быть использованы в ходе предоперационного обследования онкологических больных с целью увеличения чувствительности диагностических процедур, основанных на ультразвуковом исследовании (УЗИ), молекулярной магнитно-резонансной томографии (мМРТ) и позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ). Эти контрасты позволяют не только локализовать область нахождения основной опухолевой массы, но и определять местонахождение мелких метастазов (Zhang et al., 2011b; Paauwe et al., 2013).
Впервые возможность визуализации опухолей с помощью МКАТ к эндоглину была показана в эксперименте по развитию карциномы молочной железы у собак. Меченные 125I антитела MAEND3 быстро накапливались в сосудах опухоли. Специфичный сигнал превышал фоновые значения в 8-9 раз (Fonsatti et al., 2000). Позднее целесообразность использования МКАТ к эндоглину была подтверждена в опыте с перфузией сосудов почек, удаленных у пациентов, страдавших почечной карциномой. Гистопатологическое исследование органов подтвердило, что области накопления радиоактивной метки соответствовали участкам опухолевого роста (Costello et al., 2004).
УЗИ получило широкое распространение в клинической практике благодаря простоте использования, безопасности и низкой себестоимости. МКАТ к эндоглину, конъюгированные с микропузырьками, были использованы для мониторинга опухолевого ангиогенеза в экспериментальных моделях меланомы, рака яичника, поджелудочной и молочной желез (Korpanty et al., 2007; Deshpande et al., 2011; Leguerney et al., 2014). Несмотря на небольшую глубину тканевого проникновения УЗИ, разработка новых контрастирующих реагентов на основе МКАТ к эндоглину способно повысить диагностическую ценность этого метода (Zhang et al., 2011b; Paauwe et al., 2013).
мМРТ обладает большим разрешением, контрастом и глубиной проникновения, по сравнению с УЗИ. Для создания специфичных контрастов МКАТ к эндоглину конъюгировали с магнитными метками, представлявшие собой липосомы (Zhang et al., 2008), наночастицы из золота и оксида железа (Dassler et al., 2012; Zhang et al., 2014) или углеродные нанотрубки (Al Faraj et al., 2015a; Al Faraj et al., 2015b). На примере рака молочной железы показано, что использование этих препаратов позволяет уточнять прогноз течения заболевания и оценивать агрессивность опухолей (Li et al., 2015).
Наиболее многообещающим методом визуализации опухолей является позитронно-эмиссионная томография. В опытах на животных были исследованы различные варианты контрастов, изготовленные с применением 64Cu (Hong et al., 2011; Zhang et al., 2011a;Shi et al., 2013; Luo et al., 2015), 66Ga (Engle et al., 2012; Hong et al., 2012a), 89Zr (Hong et al., 2012b; Zhang et al., 2012b) или 111In (Bredow et al., 2000). В качестве специфичного агента чаще всего используют гуманизированные МКАТ к эндоглину SN6j (TRC105). Рядом авторов предложена комбинированная методика, сочетающая позитронно-эмиссионную томографию и ближнюю инфракрасную флуоресценцию – NIRF (Hong et al., 2012b; Zhang et al., 2012a, 2012b, 2013; Chen et al., 2014). В этих работах МКАТ к эндоглину метили радиоактивной медью и меткой NIRF. Несмотря на то, что инфракрасная флуоресценция обладает низкой проницаемостью, она может быть полезна при эндоскопии и некоторых вариантах хирургической техники (Paauwe et al., 2013).
Ингибирование роста солидных опухолей возможно с использованием иммунотоксинов, состоящих из МКАТ к эндоглину и различного рода цитотоксических компонентов. Эта концепция подразумевает уменьшение кровоснабжения солидных опухолей за счет целенаправленного разрушения питающих их сосудов. В результате уничтожение небольшого числа нормальных клеток эндотелия вызовет гибель большой массы опухолевых клеток. Впервые для экспериментального изучения этого подхода к лечению онкологических заболеваний были использованы МКАТ TEC-11, конъюгированные с дегликоизированным рицином А. Полученный иммунотоксин ингибировал синтез белка в пролиферирующих клетках HUVEC в 3000 раз сильнее, чем в клетках конфлюентной культуры (Burrows et al., 1995). Аналогичные результаты получены в эксперименте in vitro на клетках эндотелия мышей. Иммунотоксины, созданные на основе МКАТ SN6f, SN6j и SN6k обладали слабым токсичным действием на клетки эндотелия мышей. В то же время, в in vivo модели показан мощный противоопухолевый эффект этих препаратов в отношении неэкспрессирующих эндоглин клеток рака молочной железы MCF-7. Показательно, что у некоторых мышей наблюдалась полная регрессия опухолей без проведения дополнительной терапии в течение всего эксперимента, длившегося 100 д (Seon et al., 1997; Matsuno et al., 1999).
Другая группа исследователей создала и испытала ряд иммунотоксинов на основе МКАТ к эндоглину человека 44G4 и к эндоглину мыши MJ7/18, конъюгированных с эбулином и нигрином b. Эти агенты обладают меньшей токсичностью, по сравнению с дегликозилированным рицином (Benitez et al., 2006; Munoz et al., 2007, 2012a). Авторы исследования показали, что полученные ими препараты высоко активны в отношении экспрессирующих эндоглин миобластов человека и крысы, и практически безвредны для не экспрессирующих CD105 клеток. Исследование обработанных иммунотоксинами клеток с помощью метода иммунофлуоресценции выявило их накопление в перинуклеарном пространстве (Munoz et al., 2007). Испытание этих препаратов в in vivo модели показало, что иммунотоксины блокировали рост меланомных клеток B16MEL4A5 в течение 7 д. Однако после истечения этого срока некоторые из опухолей возобновляли свой рост (Munoz et al., 2012a). Аналогичный эксперимент проведен на мышиной модели с тканевым повреждением хвоста. Введение иммунотоксинов приводило к усилению дегенеративных процессов в хвосте животных, что подтверждало направленность терапии против вновь образующихся сосудов (Munoz et al., 2012b).
Несмотря на то, что иммунотоксины, полученные на основе МКАТ к эндоглину, демонстрируют мощное анти-ангиогенное действие, их токсичность для организма в целом остается очень высокой. В опытах на лабораторных мышах установлено, что оптимальные, с точки зрения эффективности противоопухолевой терапии, дозы этих препаратов достигают 24-45% от уровня LD50 (Seon et al., 1997; Matsuno et al., 1999).
Протоколы иммунизации мышей рекомбинантными молекулами эндоглина
Вектор pQE-30 содержал последовательность, которая кодировала гексагистидиновый мотив на N-конце рекомбинантных белков. Для выявления синтезированных бактериями молекул эндоглина был проведен электрофорез и вестерн-блот лизатов индуцированных и не индуцированных культур с коммерческим реагентом HisProbe (рис. 12, б). Пептид, воспроизводящий последовательность центрального фрагмента эндоглина, как и ожидалось, имел молекулярный вес 25 кДа. Далее в тексте он обозначен аббревиатурой Eng-fr. В лизатах бактерий, которые экспрессировали белок, воспроизводивший полную последовательность экстраклеточного домена антигена, обнаружена серия пептидов с гексагистидиновыми мотивами. Их молекулярный вес варьировал от 12 до 60 кДа. По всей видимости, пептиды с меньшим весом представляли собой фрагменты рекомбинантного белка, синтез которых преждевременно прервался. Ввиду N-концевого положения гексагистидинового мотива все пептиды выявлялись с помощью HisProbe. Для получения препарата, состоявшего только из полноразмерных рекомбинантных молекул, кДНК эндоглина была клонирована в вектор pET-21b(+). Его константная часть обуславливала наличие гексагистидиновых мотивов на С-конце рекомбинантных полипептидов. Экспрессию белка проводили в клетках E.coli BL21(DE3). Действительно, с помощью вестерн-блота с HisProbe в лизатах этих бактерий выявлена только одна полоса белка с молекулярным весом 60 кДа (рис. 12, б). Рекомбинантные молекулы, соответствовавшие экстраклеточному домену эндоглина с N- и C-концевыми гексагистдиновыми мотивами, получили обозначение Eng-N и Eng-C, соответственно.
При экспрессии в клетках E.coli все рекомбинантные белки образовывали нерастворимые тельца включения. Поэтому их очистку проводили на колонке с Ni-NTA-Resin в буфере с 8 М мочевиной. Снимок полиакриламидного геля с очищенными рекомбинантными белками представлен на рис. 13 (а). Рис. 12. Электрофорез (а) и вестерн-блот (б) лизатов клеток E.coli до и после индукции синтеза рекомбинантных белков с помощью IPTG. Разделение в 8% полиакриламидном геле. Окраска геля произведена с помощью раствора Coomassie Brilliant Blue R-250. Специфичное выявление рекомбинантных белков осуществлено с помощью коммерческого реагента HisProbe.
Установленным в п. 3.1.1. критериям также соответствовал коммерческий препарат рекомбинантных молекул эндоглина человека, синтезированных клетками мышиной миеломы NS0 (R&D Systems, 1097-EN-025). Согласно описанию, эти молекулы воспроизводили полную последовательность экстраклеточного домена эндоглина человека (Glu26-Gly586) и имели димерную структуру. При электрофорезе в восстанавливающих условиях их молекулярный вес должен был находиться в пределах 75-85 кДа. Далее в тексте этот белок обозначен аббревиатурой Eng-NS0.
Используемые в работе рекомбинантные молекулы эндоглина обладали различными структурными особенностями. Полученные в E.coli пептиды были мономерными и не содержали углеводного компонента. Растворение в буфере с мочевиной способствовало расправлению полипептидных цепей этих антигенов. Напротив, синтезированные в клетках мышиной миеломы молекулы имели димерную структуру и характерные для белков млекопитающих фолдинг и гликозилирование. Различия молекулярного веса Eng-C и Eng-NS0 показывают, что на углеводный компонент последнего приходилось около 20 кДа.
Краткая характеристика рекомбинантных белков, использованных в работе, приведена в таблице 8. Схемы антигенов представлены на рис. 13 (б).
Иммунохимические методы детекции специфичных антител играют существенную роль в гибридомной технологии. Их применяют для оценки уровня и антигенной специфичности иммунного ответа животных, а также для мониторинга продукции антител гибридомными клетками в ходе процедур клонирования. Использование различных методов выявления антител способствует достижению двух целей. Во-первых, тестирование одних и тех же образцов позволяет подтвердить антигенную специфичность антител. Во-вторых, этот прием способствует расширению спектра иммунохимических свойств, получаемых панелей МКАТ. В настоящей работе для выявления антител к эндоглину было использовано три варианта ИФА.
Первый метод представлял собой непрямой ИФА. Антитела, находившиеся в исследуемых образцах, взаимодействовали с молекулами рекомбинантных антигенов, адсорбированных на твердую фазу. Выявление специфичных иммуноглобулинов осуществляли с помощью поликлональных антител к иммуноглобулинам мыши, меченных пероксидазой хрена.
Второй вариант тестирования позволял выявлять антитела, которые были способны взаимодействовать с молекулами антигена, находившимися в растворе. Для связывания иммуноглобулинов мыши использовали адсорбированные на твердую фазу козьи антитела к иммуноглобулинам мыши. Далее в ячейки последовательно вносили исследуемые образцы и меченные биотином рекомбинантные молекулы эндоглина. Выявление специфического сигнала осуществляли с помощью стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Препараты меченных биотином молекул для этого теста были получены с использованием рекомбинантных полипептидов, синтезированных в клетках бактерий. Для проведения реакции конъюгирования молекулы Eng-fr, Eng-N и Eng-C диализовали в ФСР. Однако в ходе этой процедуры в препаратах полноразмерных пептидов Eng-C наблюдалось появление большого количества белкового осадка. Напротив, белки Eng-fr и Eng-N сохраняли растворимость в ФСР на протяжении длительного времени. Эти различия в растворимости препаратов в ФСР могут быть объяснены большей склонностью молекул Eng-C к агрегации. Они, в отличие от пептидов Eng-fr и большинства молекул Eng-N, включали полную последовательность ZP-домена. Ввиду этих особенностей тестирования образцов этим методом ИФА проводили с использованием пептидов Eng-N и Eng-fr, меченных биотином.
Наконец, третий метод выявления антител к эндоглину представлял собой непрямой ИФА на клетках. Адгезионные культуры клеток выращивали до 95% конфлюента в 96-луночных планшетах, фиксировали глютаральдегидом и использовали для проведения теста. Для выполнения рутинных скринингов сывороток крови мышей и надосадков гибридом были выбраны клетки гепатокарциномы HEP G2. Несмотря на умеренный уровень экспрессии эндоглина они выгодно отличались от остальных культур. Во-первых, эти клетки обладали высокой скоростью пролиферации, что позволяло быстро подготавливать новые планшеты для скрининга культуральных жидкостей гибридом. Во-вторых, благодаря хорошим адгезионным свойствам при проведении ИФА практически весь монослой клеток сохранялся на дне лунок.
Иммунизацию мышей F1(SJL/JBALB/c) проводили одним из трех рекомбинантных антигенов: Eng-NS0, Eng-fr или Eng-C. Полученные от животных образцы сывороток крови были исследованы с помощью описанных выше методов ИФА.
Антитела из всех сывороток взаимодействовали с адсорбированными на фазу рекомбинантными молекулами Eng-C и Eng-NS0 и находившимися в растворе пептидами Eng-N, независимо от природы используемого иммуногена. Титры специфичных иммуноглобулинов достигали 1:105-106. Напротив, с эндоглином на мембране клеток HEP G2 связывались антитела только тех животных, которые были иммунизированы Eng-NS0 (рис. 14). Эти результаты свидетельствовали о высокой иммуногенности всех трех рекомбинантных белков для мышей F1(SJL/JBALB/c). Однако введение животным антигенов, полученных в клетках бактерий или млекопитающих, вызывало продукцию антител, направленных к различным группам детерминант. В первом случае в образцах сывороток крови обнаруживали только иммуноглобулины, специфичные к эпитопам рекомбинантных молекул. Во втором случае, у животных дополнительно появлялись антитела, распознававшие эпитопы мембранной формы эндоглина.
Характеристика двухцентровой системы ИФА 4Е4-4С9
Получение и характеристика молекул антигена является одним из ключевых этапов в процессе создания клеток-продуцентов МКАТ с помощью гибридомной технологии. Чистота и свойства препаратов антигена определяют уровень и специфичность иммунного ответа лабораторных животных. Анализ литературных источников показал, что многие штаммы гибридом, синтезирующих антитела к эндоглину, были созданы в результате иммунизации мышей различными клетками человека, экспрессировавшими антиген. Этот подход избавляет от необходимости получения очищенных препаратов антигена. Однако он не применим для создания панели гибридом из-за низкой частоты В-клеток, распознающих эндоглин, в селезенках мышей. Так, в ряде работ специфичные к CD105 гибридомы были созданы непреднамеренно (Quackenbush, Letarte, 1985; Haruta, Seon, 1986). Использование аффинно очищенных препаратов антигена для иммунизации животных позволяет существенно повысить частоту специфичных клеток в селезенках перед выполнением гибридизации. Этот подход был применен для создания наиболее известной панели МКАТ к эндоглину человека серии SN6 (Seon et al., 1997; Matsuno et al., 1999). Выделение антигена из лизатов лейкемических клеток человека осуществляли с помощью иммуноаффинной колонки с первым созданным реагентом этой серии – антителами SN6 (Seon et al., 1997). Еще одну панель МКАТ к антигену создали с помощью иммунизации мышей вакцинным вирусом, включавшим ген эндоглина (Luque et al., 1997).
В настоящей работе в качестве иммуногенов были использованы рекомбинантные белки, синтезированные в клетках бактерий или млекопитающих, которые воспроизводили последовательность экстраклеточного домена молекулы или его центральный участок. Технология создания рекомбинантных пептидов позволила получить высокоочищенные препараты белковых антигенов с заданной последовательностью. Несмотря на обилие работ, описывающих процедуры получения МКАТ к эндоглину, вопрос об иммуногенности молекулы в целом и ее фрагментов авторами практически не обсуждается. Проведенный in silico анализ показал, что, несмотря на высокий уровень гомологии последовательностей молекул CD105 человека и мыши, в их экстраклеточных доменах отсутствовали протяженные совпадающие участки. Эти результаты дали основания для предположения о том, что различные фрагменты эндоглина человека могли обладать высокой иммуногенностью для мышей. Выбор участков антигена для клонирования был основан на доступной в литературе информации о местонахождении детерминант охарактеризованных МКАТ к эндоглину. Оказалось, что центральный фрагмент молекулы содержал высоко иммуногенные для мышей линии BALB/c эпитопы.
Использованные в работе рекомбинантные фрагменты эндоглина обладали различными физико-химическими свойствами. Синтезированные в E.coli белки, в отличие от полученного в клетках млекопитающих Eng-NS0, были плохо растворимы в водных растворах. Эта особенность рекомбинантных фрагментов эндоглина была также отмечена другими авторами (Pichuantes et al., 1997; Van Le et al., 2009). По всей видимости, плохая растворимость бактериальных пептидов связна с отсутствием гликозилирования. Сравнение молекулярных весов Eng-C и Eng-NS0 показывало, что на углеводный компонент последнего приходилось около 20 кДа, что составляло четверть его массы. Эти данные согласуются с результатами дегликозилирования эндоглина, проведенного другими исследователями (Gougos, Letarte, 1988a). Эптиопы синтезированных в E.coli пептидов преимущественно имели линейную структуру. Напротив, молекулы Eng-NS0 обладали характерными для белков млекопитающих фолдингом и содержали конформационные эпитопы.
Несмотря на перечисленные выше различия рекомбинантные молекулы Eng-fr, Eng-C и Eng-NS0 обладали высокой иммуногенностью для мышей F1(SJL/JBALB/c). Об этом свидетельствовали результаты исследования сывороток животных в ИФА с адсорбированными на твердую фазу молекулами иммуногенов. Однако тестирование этих же образцов в ИФА на клетках HEP G2 показало, что мембранную форму антигена распознавали антитела только тех животных, которых иммунизировали Eng-NS0 (рис. 14). Эти данные указывали на существенный вклад вторичных модификаций полипептидной цепи в формирование структуры эпитопов нативных мембранных молекул эндоглина. Также на их основе было выдвинуто предположение о том, что антитела, выявляемые в ИФА с бактериальными рекомбинантными антигенами, и в ИФА на клетках HEP G2, обладали различными иммунохимическими свойствами. Поэтому для проведения гибридизации были использованы спленоциты мышей, иммунизированных Eng-NS0, а скрининги ростовых сред клеток-продуцентов вели с применением двух подходов. В первом варианте антитела выявляли в ИФА с рекомбинантными молекулами эндоглина, во втором – в ИФА на клетках HEP G2. Другие группы исследователей для селекции гибридом, продуцирующих МКАТ к CD105, использовали только один вариант скрининга.
Полученные МКАТ демонстрировали существенные различия в способности взаимодействовать с рекомбинантными молекулами эндоглина, адсорбированными на твердую фазу, и рецепторами, экспрессированными на мембране клеток HEP G2 (рис. 15). Оказалось, что эти расхождения были связаны со вторичной структурой антигенных детерминант. Реагенты, проявлявшие активность в ИФА на клетках, частично снижали способность к взаимодействию с Eng-NS0, подвергнутым тепловой обработке или восстановлению дисульфидных связей (рис. 16). Распознаваемые ими детерминанты были классифицированы как конформационные. Напротив, МКАТ 2Е1 и 4В7, не взаимодействовавшие с поверхностью клеток, одинаково эффективно связывались с нативными и денатурированными молекулами в ИФА. Детерминанты этих реагентов были классифицированы как линейные.
Аналогичные результаты были получены другими исследователями (таблица 3). Антитела, способные выявлять эндоглин на поверхности клеток, как правило, были направлены к конформационным эпитопам. В вестерн-блоте они взаимодействовали только с димерными молекулами антигена (т.е. с антигеном с интактными дисульфидными связями). На настоящее время достоверно известно только о четырех МКАТ (SN6h, SN6j, P3D1 и P4A4), которые специфичны к линейным эпитопам, представленным на мембранной форме эндоглина. Низкая вероятность получения реагентов к детерминантам такого рода имеет несколько возможных объяснений. Так, компактная структура и наличие дисульфидных связей внутри молекулы эндоглина могут обуславливать преобладание в ней конформационных эпитопов. Возможно, что линейные эпитопы вовлечены во взаимодействие эндоглина с другими рецепторами и растворимыми факторами. В пользу этого предположения свидетельствует наличие функциональной активности у МКАТ SN6h и SN6j (She et al., 2003; Tsujie et al., 2008) и способность последнего реагента ингибировать взаимодействие эндоглина с BMP-9 (Nolan-Stevaux et al., 2013). Наконец, конформационные и линейные детерминанты молекулы эндоглина могут обладать различной иммуногенностью. Однако это предположение противоречит результатам опыта по иммунизации мышей пептидами бактериального происхождения.
В работе показано, что детерминанты, распознаваемые созданными МКАТ, неравномерно распределены на поверхности молекулы антигена. Эпитопы семи реагентов имели частичные перекрывания друг с другом, а детерминанты пяти других МКАТ были пространственно изолированы от всех остальных. Кроме того, Eng-fr, который включал 45% аминокислотной последовательности экстраклеточного домена, содержал только одну из двенадцати детерминант, распознаваемых МКАТ. Эти данные дают основание полагать, что иммунный ответ использованных в работе животных был направлен преимущественно против одного или нескольких иммунодоминантных участков молекулы эндоглина, которые находились за пределами последовательности Eng-fr. Обнаруженные различия в иммуногенности центрального участка эндоглина для мышей BALB/c и F1(SJL/JBALB/c) подтверждают тезис об отличии эпитопных специфичностей иммунного ответа этих животных (Климович и др., 1999).