Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Боковой амиотрофический склероз 13
1.1.1. Общие сведения 13
1.1.2 Патологические механизмы развития БАС 14
1.1.3 Современное состояние исследований БАС и текущие стратегии лечения. 25
1.2 Пациент-специфичные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки как основа для исследования патологических состояний 32
1.3 Использование технологии CRISPR/Cas9 для моделирования патологических состояний и генной терапии 37
1.4 Генетически-кодируемые биосенсоры 41
1.4.1 Биосенсоры окислительно-восстановительных реакций 48
1.5 Заключение 52
Глава 2. Материалы и методы 54
2.1 Ростовые среды и условия культивирования 54
2.2 Получение пациент-специфичных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток... 2.2.1 Репрограммирование мононуклеарных клеток периферической крови к плюрипотентному состоянию 58
2.2.2 Характеристика плюрипотентного статуса ИПСК 59
2.3 Создание изогенных линий ИПСК с внесенными мутациями в ген SOD1 с помощью CRISPR/Cas9 61
2.3.1 Получение и очистка белка Cas9 с сигналом ядерной локализации. Гидролиз ДНК с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов in vitro 61
2.3.2 Доставка компонентов системы CRISPR/Cas9 в ИПСК с помощью электропорации на приборе Neon Transfection system 62
2.3.3 Анализ клонов на предмет наличия целевой замены 63
2.4 Получение трансгенных линий ИПСК, содержащих встройку последовательностей трансактиватора для доксициклин-управляемой экспрессии и биосенсоров Cyto-roGPFP2-Orp1 и Mito- roGPFP2-Orp1 в локусе AAVS1 65
2.4.1 Доставка компонентов CRISPR/Cas9 и донорных плазмид в ИПСК 65
2.4.2 Селекция ИПСК, содержащих целевые встройки 65
2.4.3 Выявление рекомбинантных клонов при помощи ПЦР 66
2.5 Направленная дифференцировка ИПСК в моторные нейроны. Исследование поведения моторных нейронов в ответ на стресс с помощью биосенсоров Cyto-roGFP2-Orp1 и Mito roGFP2-Orp1 66
2.5.1 Направленная дифференцировка ИПСК в моторные нейроны 66
2.5.2 Характеристика направленной дифференцировки ИПСК с моторные нейроны 68
2.5.3 Исследование реакции моторных нейронов на добавление Н2О2 в культуральную среду с помощью биосенсоров Cyto-roGFP2-Orp1 и Mito-roGFP2-Orp1 в реальном времени 70
2.5.4 Исследование реакции моторных нейронов в условиях хронической эксайтотоксичности с помощью биосенсоров Cyto-roGFP2-Orp1 и Mito-roGFP2-Orp1 73
Глава 3. Результаты 74
3.1 Внесение однонуклеотидных замен в ген SOD1 с помощью системы CRISPR/Cas9 74
3.1.1 Получение, очистка и функциональный анализ белка Cas9 74
3.1.2 Получение линий ИПСК, содержащих замены c.272A C (D90A) и c.382G C (G127R) в гене SOD1 76
3.2 Репрограммирование пациент-специфичных мононуклеарных клеток крови к плюрипотентному состоянию и характеристика полученных линий индуцируемых стволовых клеток 81
3.3 Получение трансгенных линий ИПСК, содержащих встройки биосенсоров перекиси водорода Cyto-roGFP2-Orp1 и Mito-roGFP2-Orp1 в локусе AAVS1 84
3.4 Направленная дифференцировка ИПСК в спинальные моторные нейроны 89
3.4.1 Получение и харакетристика зрелых спинальных моторных нейронов in vitro 89
3.4.2 Получение препаратов живых моторных нейронов для лазерной сканирующей микроскопии 90
3.4.3 Изменение экспрессии биосенсора в ходе дифференцировки в спинальные моторные нейроны 91
3.4.4 Морфометрический анализ моторных нейронов с внесенными в ген SOD1 мутациями 93
3.5 Функциональная характеристика биосенсоров Cyto-roGFP2-Orp1 и Mito-roGFP2-Orp1 94
3.5.1 Подтверждение функциональности биосенсоров Cyto-roGFP2-Orp1 и Mito-roGFP2-Orp1. Характеристика базального соотношения GFPox/GFPred 94
3.5.2 Реакция биосенсоров Cyto-roGFP2-Orp1 и Mito-roGFP2-Orp1 на добавление перекиси водорода в среду 99
3.5.3 Индукция хронической глутаматной эксайтотоксичности в моторных нейронах 103
Глава 4. Обсуждение 107
4.1 Обоснование подходов, использованных для создания модели БАС 107
4.1.1 Внесение однонуклеотидных замен в ген SOD1 с помощью CRISPR/Cas9 108
4.1.2 Встройка генетических конструкций, предназначенных для доксициклин-индуцируемой экспрессии биосенсоров, в локус AAVS1 109
4.2 Особенности реакции биосенсоров Cyto-roGFP2-Orp1 и Mito-roGFP2-Orp1 111
4.3 Влияние мутаций в гене SOD1 на функционирование моторных нейронов, полученных из ИПСК 114
4.4 Заключение 117
Выводы 119
Список литературы 120
- Патологические механизмы развития БАС
- Биосенсоры окислительно-восстановительных реакций
- Получение линий ИПСК, содержащих замены c.272A C (D90A) и c.382G C (G127R) в гене SOD1
- Влияние мутаций в гене SOD1 на функционирование моторных нейронов, полученных из ИПСК
Патологические механизмы развития БАС
Наличие нерастворимых агрегатов неправильно свернутых белков в моторных нейронах является частым признаком БАС, который можно наблюдать уже на самых ранних стадиях развития заболевания (McGoldrick et al., 2013; Parakh, Atkin, 2016; Philips, Rothstein, 2015). Такие белки могут стимулировать патологические процессы вследствие приобретения токсической функции, и/или недостатка их нормальной функции (Ravits et al., 2013; Soo, Atkin, 2015). Следовательно, накопление неправильно свернутых белков может привести к гибели нейронов либо посредством нарушения регуляции белкового обмена, либо путем выключения важных белков из клеточных процессов (Takalo et al., 2013). Причем, наличие в списке генов, ассоциированных с БАС, тех, которые вовлечены в белковый обмен, лишь подчеркивает общую сложность заболевания (Maurel et al., 2018).
Нейроны особенно чувствительны к нарушению укладки белков из-за специфики формы клеток и их функции. Во-первых, нейроны относятся к терминально дифференцированным клеткам, неспособным к делению; таким образом, у них нет возможности снижать концентрацию токсичных белковых агрегатов, разделяя его между дочерними клетками (Ciechanover, Kwon, 2015). Во-вторых, специфическая форма моторных нейронов (небольшое тело и длинный аксон) только усиливает токсический эффект, поскольку элиминация агрегатов из особо удаленных районов требует дополнительных ресурсов (Hollenbeck, 1993). Так как пассивная элиминация агрегатов посредством деления недоступна для МН, при достижении критической массы начинают включаться активные механизмы удаления агрегатов из клетки: аутофагия, деградация, ассоциированная с эндоплазматическим ретикулумом и убиквитин-зависимая деградация. Будучи исходно протективными, данные механизмы играют важную роль в выживании МН вначале, однако, в условиях хронического стресса (при продолжающемся накоплении агрегатов), их активация может привести к апоптозу (Рисунок 1).
Связь БАС и механизмов, ответственных за поддержание белкового гомеостаза подтверждается рядом фактов. Убиквитин-позитивные включения обнаруживаются в МН почти во всех случаях БАС и, вероятно, играют важную роль в развитии заболевания (Leigh et al., 1991; Urushitani et al., 2002). Кроме того, мутации в нескольких генах, участвующих в процессе убиквитин-зависимой деградации (UBQLN-2, SQSTM-1 и VCP), также были отмечены, как ассоциированные с БАС. Та же связь наблюдается и в отношении аутофагии: ряд белков, ответственных за процессы формирования и транспорта аутофагосом, связан с развитием заболевания (Gal et al., 2009). Эксперименты с индукцией аутофагии с помощью трегалозы, показывают, что патологический эффект мутаций в данных генах проявляется вследствие недостатка функции, поскольку активация аутофагии приводит к снижению уровня накопления агрегатов и более поздней манифестации симптомов БАС у трансгенных мышей (Castillo et al., 2013; Zhang et al., 2014). Аналогичные эксперименты также демонстрируют увеличение выживаемости нейронов и в клеточной модельной системе (Barmada et al., 2014; Ryu et al., 2014).
Клеточные механизмы, обеспечивающие гомеостаз белков, в наибольшей степени интересны для фармакологических исследований, как потенциальные мишени для лекарственного воздействия. Известно, что базальная активность процессов, связанных с утилизацией неправильно свернутых белков, в моторных нейронах находится на относительно низком уровне, и это объясняет их повышенную чувствительность к накоплению агрегатов (Tanaka, Matsuda, 2014; Zhao et al., 2017). Следовательно, терапевтическая активация этих механизмов может быть одним из возможных вариантов коррекции патологического состояния пациентов на ранних этапах заболевания. Дефекты внутриклеточного транспорта
Вследствие сложной структуры нейронов, внутриклеточный транспорт очень важен, поскольку большое количество процессов происходит на расстоянии друг от друга. Аксональный транспорт, в частности, играет ключевую роль в функционировании МН: доставка белков, органелл и удаление метаболитов из дистальной части аксона. Нарушения внутриклеточного транспорта могут быть вызваны двумя причинами: дефекты транспортных систем, вызванные мутациями транспортных белков с потерей функции, или изоляция белков-переносчиков во включениях. Действительно, мутации в гене DCTN1, кодирующем одну из субъединиц динактина – компонента молекулярного мотора – в редких случаях обнаруживают у пациентов с БАС. Эти мутации характеризуются преимущественным поражением периферического моторного нейрона, поскольку он более зависим от аксонального транспорта (Mnch et al., 2005). И в культуре клеток, и в трансгенных животных моделях, G59S мутация DCTN1 вызывает прогрессивную дегенерацию нейронов вследствие нарушенного везикулярного транспорта, накопления убиквитинированных включений и аномальной морфологии ЭПР (Laird et al., 2008; Mnch et al., 2004; Puls et al., 2003).
Другая сторона дефектов транспорта, ассоциированных с БАС, проявляется и в модельных системах с мутантным SOD1, где неправильно свернутый SOD1 связывает и ингибирует белки – молекулярные моторы, ответственные за ретроградный и антероградный транспорт – динеин и кинезин-ассоциированные белки (Ligon et al., 2005; Tateno et al., 2009). Таким образом, МН неспособны поддерживать нормальное функционирование, что приводит не только к их гибели, но и денервации мышечных клеток, которые они питают, и, следовательно, атрофии последних (Рисунок 1). Нарушения метаболизма РНК
Нарушения метаболизма РНК считают одной из основных причин нейродегенерации. Термин «метаболизм РНК» подразумевает совокупность процессов, связанных с трансляцией, модификацией, транспортом РНК, а также их регуляцию. В целом, нарушения любого из этих процессов вследствие недостатка функции (loss-of-function), или избытка функции (gain-of-function), могут вызывать патологию, ассоциированную с БАС. Среди генов, ассоциированных с БАС, немало тех, что кодируют белки с РНК-связывающим доменом: TDP-43, FUS, ANG, C9ORF72 – что свидетельствует о доминантной роли «loss-of-function» механизма в развитии патологии.
TDP-43 и FUS кодируют белки с РНК-связывающим доменом, которые имеют преимущественно ядерную локализацию (Ling et al., 2013). Главная их функция – регуляция транскрипции и сплайсинга пре-мРНК. Причем, среди их мишеней были обнаружены тысячи различных генов, в том числе и те, которые были ассоциированы с нейродегенерацией ранее (Lagierourenne et al., 2012; Polymenidou et al., 2011). Таким образом, нарушение функционирования TDP-43 и FUS приводит изменению экспрессии множества генов и аберрантному сплайсингу РНК (Lagierourenne et al., 2012; Ling et al., 2013; Polymenidou et al., 2011).
Хотя TDP-43 и FUS по большей части расположены в ядре, что связано с их РНК-ассоциированными функциями, они могут транспортироваться в цитоплазму вместе с РНК, в виде транспортных рибонуклеопротеиновых гранул, и служить в качестве переносчика РНК в определенные компартменты клетки (например, аксон), где она должна быть транслирована (Ayala et al., 2008). Это особенно важно для нейронов, в которых синтез белка часто происходит на значительном удалении от ядра, например, в терминальных частях аксонов (Alami et al., 2014; Fallini et al., 2012; Ling et al., 2013). Мутации в TDP-43 действительно нарушают аксональный транспорт м-РНК, влияя на мобильность аксонов, их регенерацию, рост и формирование синапсов (Alami et al., 2014; Donnelly et al., 2013; Liu-Yesucevitz et al., 2011) (Рисунок 1).
Биосенсоры окислительно-восстановительных реакций
Окислительно-восстановительные (ОВ) реакции являются неотъемлемой частью жизнедеятельности клетки. В норме АФК – побочный продукт реакций окисления – быстро обезвреживаются антиокислительными системами клетки (Рисунок 3).
Однако в случае большого количества АФК, или некорректной работы какой-либо системы утилизации, концентрация АФК в клетке, или ее отдельных компартментах возрастает, что приводит к изменению химического состояния среды и дисфункции клетки. Именно нарушение ОВ баланса, или окислительный стресс, называют в качестве одной из причин гибели нейронов при нейродегенеративных заболеваниях, например, БАС (Chinta, Andersen, 2008; Esposito et al., 2017). Тем не менее, до сих пор не ясно, является ли в данном случае окислительный стресс первопричиной или следствием нарушений других клеточных процессов.
В настоящее время существует ряд генетически-кодируемых биосенсоров, чувствительных к изменению концентрации основных участников ОВ реакций: H2O2, глутатион (восстановленная и окисленная форма), НАД-H (Lukyanov, Belousov, 2014). Работа некоторых из этих сенсоров основана на обратимом окислении аминокислотных остатков цистеина, находящихся в активном центре хромофора, что приводит к изменению его флуоресцентных свойств (Рисунок 4а).
Один из наиболее известных биосенсоров – HyPer – позволяет исследовать роль перекиси водорода в различных клеточных процессах. В его основе лежит желтый ФБ (YFP, yellow fluorescent protein), который соединен с регуляторным доменом чувствительного к окислению бактериального транскрипционного фактора OxyR (Рисунок 4а). Окисление цистеиновых остатков регуляторного домена OxyR в присутствии Н2О2 приводит к образованию дисульфидной связи. Возникающие изменения конформации передаются на связанный с ним ФБ и меняют его спектральные характеристики. Разные HyPer сенсоры различаются по динамическому диапазону и чувствительности к pH и позволяют измерять относительные изменения в концентрации Н2О2 в клетке (Билан и др. 2015).
Другая группа ОВ-сенсоров работает на основе ОВ-чувствительного GFP (roGFP), чьи флуоресцентные свойства зависят от состояния ключевых остатков цистеина в собственном функциональном центре. Атомы серы этих остатков ведут себя аналогично цистеинам в глутатионе: существуют в виде двух тиольных остатков (восстановленная форма roGFP), или формируют дисульфидную связь (окисленная форма roGFP). Как и в случае с биосенсоров HyPer, окисленная и восстановленная формы roGFP имеют разные спектральные характеристики. Максимум возбуждения для восстановленной формы roGFP – 400 нм, восстановленной – 490 нм. Таким образом, возбуждая белок лазерами с длинами волн 405 нм и 488 нм (UV-диодный и аргоновый, соответственно), можно получить представление о соотношении окисленной и восстановленной форм roGFP в клетке и, следовательно, ее состоянии (Schwarzlnder et al., 2016). Изменения в соотношении окисленной и восстановленной формы roGFP могут отражать соотношение восстановленного и окисленного глутитиона за счет реакции тиол-дисульфидного обмена между roGFP и глутатионом, которая, однако, лимитирована доступностью глутаредоксина. Следовательно, сенсор, состоящий из одного roGFP может и не отражать реальное соотношение GSH/GSSG, если глутаредоксина недостаточно. Данная проблема была решена путем получения биосенсора, в котором roGFP связан пептидной связью с глутаредоксином (Grx1-roGFP) (Gutscher et al., 2008), что позволило избежать неточностей в измерении, связанных с различной доступностью глутаредоксина в разных клетках и компартментах клетки (Рисунок 4б).
Похожим способом был сконструирован биосенсор для измерения Н2О2. Принцип его работы базируется на основе естественной реакции тиолпероксидаз с Н2О2, в результате которой перекись водорода восстанавливается до воды, а два тиольных остатка образуют дисульфидную связь. В биосенсоре, roGFP соединен с тиолпероксидазой дрожжей Orp1: реакция такого химерного белка с перекисью приводит вначале к окислению Orp1 с образованием дисульфидной связи, которая затем восстанавливается, окисляя два остатка серы в активном центре roGFP (Рисунок 4в). Такая реакция является необратимой в физиологических условиях, тем не менее, биосенсор способен к восстановлению in vivo за счет, вероятно, глутаредоксина, что позволяет проводить динамические измерения.
Получение линий ИПСК, содержащих замены c.272A C (D90A) и c.382G C (G127R) в гене SOD1
Для создания изогенных линий ИПСК, мутантных по SOD1, мы выбрали варианты мутаций в кодирующей области гена, которые приводят к заменам аминокислот в белке: с.272A C, приводит к смене аспарагиновой кислоты на аланин (D90A); c.382G C, приводит к смене глицина на аргинин (G127R). В качестве исходной для получения мутантных линий ИПСК была использована линия K7-4 (https://hpscreg.eu/cell-line/ICGi022-A), полученная ранее в лаборатории эпигенетики развития из клеток периферической крови здорового донора (Malakhova et al., 2020). Анализ клинического экзома донора клеток, из которых была получена данная линия, не выявило каких-либо мутаций, ассоциированных с заболеваниями (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRR11413027). Поэтому, эту же линию мы использовали далее в работе в качестве здорового контроля.
Для осуществления CRISPR-опосредованного двунитевого разрыва в гене SOD1 были подобраны направляющие РНК, содержащие последовательности спейсеров для узнавания соответствующих участков гена SOD1. В качестве матрицы для гомологичной рекомбинации для внесения замен были использованы одноцепочечные олигонуклеотиды, концы которых были модифицированы фосфотиоатными связями для обеспечения их устойчивости к действию клеточных нуклеаз (Приложение 2).
В процессе электропорации и субклонирования ИПСК было получено 66 клонов для замены с.272A C и 112 клонов для замены c.382G C. Поскольку клетки, в которых произошли целевые события, ничем не отличаются от остальных, было необходимо разработать метод скрининга, который позволил бы отобрать клоны с заменой, без использования секвенирования.
Первоначально, мы обратились к методу количественной ПЦР с зондами. В таком подходе, используя в одной реакции два зонда: для гибридизации с последовательностью дикого типа и для гибридизации с последовательностью с заменой – можно найти образцы с мутацией, которые отличаются наличием сигнала от соответствующего зонда (Рисунок 8а, 8б). Для двух вариантов мутаций были подобраны пары праймеров, амплифицирующие соответствующие участки SOD1 и пары зондов (Приложение 2).
Чувствительность данного метода оказалась невысокой, но все же достаточной в случае с мутацией c.382G C, чтобы можно было выделить ряд клонов, предположительно, имевших целевую замену. Для окончательного подтверждения мутации, мы секвенировали участок 5 экзона гена SOD1 этих клонов.
К сожалению, в случае с мутацией с.272A C, этот метод не был успешен: гибридизация зондов происходила вне зависимости от того, какой вариант последовательности присутствовал в образце. Поэтому, было необходимо применить другой подход для обнаружения замен.
Для этого мы использовали tetra-primer ARMS-PCR (Ye et al., 2001), метод, обычно применяемый для скрининга однонуклеотидных полиморфизмов в популяции. Он основан на наличии у праймеров строгой чувствительности к несоответствиям на 3 -конце при гибридизации с матрицей. Имея в реакционной смеси два таких праймера: один для гибридизации с вариантом дикого типа, второй – для гибридизации с заменой – можно получать разные ПЦР продукты, которые, затем, анализировать с помощью рутинного электрофореза (Рисунок 9).
Таким образом, был обнаружен ряд клонов, предположительно содержавших замену с.272A C (Рисунок 10). Для подтверждения наличия замены, мы секвенировали участок 4 экзона гена SOD1 этих клонов.
В результате анализа клонов, полученных после трансфекции CRISPR/Cas9 и донорных одноцепочечных нуклеотидов, был получен ряд линий ИПСК с различными вариантами аллелей гена SOD1:
1) D90A/wt
2) D90A/del 5 п.н.
3) D90A/del 105 п.н. (Затрагивает границу между 3 интроном и 4 экзоном. Приводит к нарушению сплайсинга мРНК SOD1, где сразу за 3 экзоном следует 5, и сдвигу рамки считывания)
4) D90A/ins 1 п.н.
5) G127R/del 5 п.н. (Приводит к образованию стоп кодона в 130 позиции)
6) G127R/del 9 п.н.
7) G127R/K128X
8) G127R/ins1 п.н.
Для дальнейших экспериментов были выбраны линии SOD1D90A/del105 п.н. (SOD1-D90A) и SOD1G127R/K128X (SOD1-G127R), которые также были охарактеризованы на предмет соответствия критериям плюрипотентных стволовых клеток человека по стандартной процедуре (Рисунок 11).
Влияние мутаций в гене SOD1 на функционирование моторных нейронов, полученных из ИПСК
Окислительный стресс – один из основных патофизиологических процессов, приводящих к гибели нейронов при БАС. Нарушение баланса между образованием активных форм кислорода и их утилизацией косвенно выражается в увеличении концентрации промежуточных продуктов, таких как Н2О2. Несмотря на то, что именно SOD1 катализирует образование перекиси из супероксид-радикалов, современные представления касательно патологии БАС не рассматривают потерю функции, как основную причину развития патологии. Скорее, наоборот, мутации в SOD1 связывают с повышением концентрации Н2О2, а также с увеличением образования не менее вредоносных для клетки гидроксил-радикалов (Liu et al., 1999; Moon Bin Yim et al., 1996).
В подавляющем большинстве случаев, БАС проявляется в зрелом возрасте, из-за чего, его моделирование на клеточных линиях затруднено, поскольку требуется время для развития заметных патологических изменений. Мутации, которые были внесены в ИПСК для создания модели в данной работе отличаются друг от друга. Первая замена - c.272A C – приводит к смене аспарагиновой кислоты на аланин (D90A) – и является одной из наиболее распространенных в европейской популяции (Giannini et al., 2010). Она характеризуется относительно мягкой клинической картиной: средний возраст манифестации симптомов – около 50 лет, больные могут жить с симптомами БАС более 5 лет и у них редко развиваются дополнительные неврологические нарушения помимо моторных (Bali et al., 2017). Кроме того, известно, что среди пациентов с БАС, мутация c.272A C может иметь как рецессивный, так и доминантный тип наследования, что позволяет предполагать наличие пока неизвестного фактора-модификатора заболевания у таких людей (Andersen et al., 1997). Другая мутация, c.382G C, которая приводит к смене глицина на аргинин (G127R), не является распространенной. Тем не менее, она интересна тем, что клинически выражается в агрессивной форме течения заболевания с быстрой прогрессией симптомов и преимущественным вовлечением спинальных моторных нейронов и выраженным болевым синдромом, резистентным к лечению опиоидами (Holmy et al., 2010).
Негативный эффект мутации c.382G C проявил себя более высоким базовым уровнем перекиси водорода в цитоплазме и митохондриях по сравнению с контрольными нейронами K7-4 и нейронами SOD1-D90A уже по окончании дифференцировки (Рисунок 23б). Кроме того, депривация питательных веществ повышала степень окисления не только биосенсора Mito-roGFP2-Orp1, но и Cyto-roGFP2-Orp1, чего не наблюдалось для других линий (Рисунок 23а), что говорит о существовании дополнительных стрессовых факторов для этих нейронов, которые голодание только усиливает.
Примечательно, что положительное влияние нейротрофических факторов ограничивалось снижением уровня Н2О2 в только цитоплазме и только на 29 день дифференцировки (Рисунок 23в, 23д). Невозможность коррекции высокого уровня митохондриальной Н2О2 объясняется наличием неразрешимых нарушений в функционировании органоида, которые приводят к гибели клетки. Как и в случае с динамическими экспериментами по утилизации перекиси водорода: повышение уровня Н2О2 в митохондриях сложнее спровоцировать ввиду активной работы системы по ее обезвреживанию, но, если это происходит, то следующий за ним процесс гибели клетки остановить уже нельзя. Об этом косвенно говорит снижение положительного эффекта трофических факторов в течение последующих трех дней культивирования. Снижение скорости роста аксонов, которое мы наблюдали для моторных нейронов с данной мутацией (Рисунок 20), также является признаком нарушения функции митохондрий: энергетический дефицит, как следствие дисфункции вынуждает клетку «экономить» на нежизненноважных процессах, таких как перестройка цитоскелета (Shi et al., 2010).
Таким образом, можно говорить, что для гибели моторных нейронов линии SOD1-G127R нарушение баланса окислительно-восстановительных реакций в митохондриях является первичным и именно митохондриальная дисфункция лежит в основе наблюдаемых явлений (Allen et al., 2014).
Несмотря на значимое, пусть и не такое выраженное, снижение скорости роста аксонов (Рисунок 20), для моторных нейронов с мутацией c.272A C не было обнаружено отличий от контроля в уровне перекиси водорода в цитоплазме и митохондриях, что было ожидаемо, так как данная мутация отличается крайне благоприятным течением (Al-Chalabi et al., 2013). Наблюдаемое снижение степени окисления сенсоров в моторных нейронах iALS, вероятно, связано с особенностями линии ИПСК, из которой клоны были получены, а не с самой мутацией, поскольку нейроны SOD1-D90A, изогенные контролю К7-4 демонстрировали аналогичные контролю же показатели (Рисунок 23а, 23г). Это лишний раз доказывает необходимость использования изогенных клеточных линий в экспериментах, поскольку подобные отличия могут возникать повсеместно и провоцировать на неправильные выводы.
В ходе эксперимента по индукции эксайтотоксичности нам не удалось получить внятных данных относительно влияния глутамата натрия на мутантные моторные нейроны (Рисунок 27в, 27г). Несмотря на то, что уровень Н2О2 в цитоплазме по окончании эксперимента был достоверно выше для каждого отдельно взятого клона (Рисунок 27а), их объединение в одну выборку нивелировало все различия ввиду большого разброса значений между повторностями. Таким образом, влияние глутамата на уровень перекиси водорода в цитоплазме оказалось достоверным только в случае линии SOD1-D90A (Рисунок 27в). Значимой разницы в реакции на глутамат между контрольными МН и МН линий iALS и SOD1-D90A также отмечено не было, хотя и есть основания предполагать наличие тенденции к большему окислению цитоплазмы мутантных МН (Рисунок 27г). То же самое касалось и динамических тестов по утилизации перекиси водорода: для каждой отдельно взятой линии скорость восстановления клеток была снижена после глутаматного теста, однако, в целом, различия оказались незначимы (Рисунок 28).
Вероятно, параметры глутаматного теста оказались неоптимальными: использованной концентрации глутамата натрия оказалось недостаточно для индукции изменений, более выраженных, чем вариативность между клонами. В пользу этой гипотезы выступает тот факт, что по окончании теста, клетки не теряли своей способности к восстановлению после добавления Н2О2, а, значит, существует возможность для ужесточения условий эксперимента. Или же, эффект мутации c.272A C все же слабо проявляется в полученной клеточной модели ввиду недостаточного уровня созревания моторных нейронов и общего относительно благоприятного характера мутации. Подтвердить или опровергнуть наличие значимой разницы для такого слабого эффекта смогут только дополнительные исследования с другими параметрами и с включением в выборку большего количества повторов.