Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Аналитический обзор литературы 19
1.1 Морфофункциональные параллели в развитии периферических нервов на примере ветвей плечевого сплетения в фило- и онтогенезе 19
1.2 Общая характеристика внешнего строения нервов верхней конечности 30
1.3 Современные представления об источниках развития невральных оболочек, в том числе параневральных соединительнотканных структур периферических нервов, на примере ветвей плечевого сплетения 35
1.4 Морфо- функциональные особенности соединительнотканных оболочек периферических нервов 42
1.5 Возможности применения математических моделей 47
в функциональной морфологии 47
1.6 Заключение по обзору литературы 56
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 58
2.1 Дизайн исследования 58
Характеристика исследуемого материала 58
2.2. Методы исследования 63
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 74
3.1 Изучение гистологического строения соединительнотканных оболочек и параневральных соединительнотканных структур периферических нервов, на примере ветвей плечевого сплетения в области средней трети плеча в филогенетическом ряду 74
3.1.1 Морфологические особенности периферических нервов плечевого сплетения, в области средней трети плеча, иннервирующих мышцы – сгибатели 74
3.1.2 Морфологические особенности периферических нервов, иннервирующих мышцы – разгибатели 109
3.2 Морфогенез изменений соединительнотканных оболочек и параневральных соединительнотканных структур периферических нервов, на примере ветвей плечевого сплетения, в области средней трети плеча, в зависимости от степени двигательной активности конечности 140
3.2.1 Реактивные изменения структур периферических нервов, на примере ветвей плечевого сплетения в условиях естественной функциональной активности 140
3.2.2 Реактивные изменения структур периферических нервов ветвей плечевого сплетения в условиях эксперимента – «гипокинезии» и «гиперкинезии» 215
ГЛАВА 4. Математическое моделирование и прогнозирование степени развития и структурной организации параневральной соединительной ткани в эволюционном аспекте 241
Глава 5. Обсуждение полученных результатов 258
Заключение 258
Выводы 285
Практические рекомендации 288
Список иллюстративного материала 289
Список литературы 306
- Морфо- функциональные особенности соединительнотканных оболочек периферических нервов
- Характеристика исследуемого материала
- Морфологические особенности периферических нервов плечевого сплетения, в области средней трети плеча, иннервирующих мышцы – сгибатели
- Реактивные изменения структур периферических нервов, на примере ветвей плечевого сплетения в условиях естественной функциональной активности
Морфо- функциональные особенности соединительнотканных оболочек периферических нервов
Процесс развития периферической нервной системы в филогенезе отмечается большой динамичностью, в связи с этим, выявление определенных закономерностей и параллелей, имеет не только теоретический интерес, но представляет собой большую практическую ценность. Еще в 1966 году Н.И. Зазыбин, в результате проведенного микроморфологического исследования, убедительно доказал, что: «…нервная система представляет собой активный материал и существенно влияет на развитие других тканей и органов». Изучением анатомических особенностей периферических нервов передней конечности животных и верхней конечности человека занимались ученые еще в глубокой древности. Благодаря знаменитому римскому врачу Галену, в 131-211 г. н. э. сравнительное изучение животных достигло значительного развития. В XVI веке в работах Андрея Везалия и Леонардо да Винчи, анатомические знания о плечевом сплетении получили дальнейшее право на существование.
В конце 19 века были изучены длинные ветви плечевого сплетения у человека и ряда животных. Особенно интересны работы В. Грубера (1870), который, изучая строение нервов верхней конечности, подробно описал связи между срединным и локтевым нервами в области предплечья (115).
Интересно отметить, что все исследователи этого периода устанавливали частные варианты в строении, но не могли их систематизировать и представить формы изменчивости в анатомии нервов верхней конечности. Только Н.И. Пирогов (1843-1845) в ряде своих работ указывал на необходимость изучения индивидуальной изменчивости в строении систем и органов. В 90-х годах 19 века и в начале 20 века благодаря новым методам исследования начали изучать внутриствольную топографию нервов верхней конечности. Изучением анатомического строения плечевого сплетения и его длинных ветвей занимались многие авторы [11, 20, 28, 29, 30, 34, 71, 327, 328, 331]. Литературные данные показывают, что нервы верхней конечности имеют очень изменчивое строение [73, 105, 283, 322]. Такую изменчивость в строении большинство современных авторов объясняет общностью происхождения в фило- и онтогенезе [7, 15, 16, 24, 282, 284].
По представлениям И.В. Гайворонского (2011), И.П. Горшкова (2009), Голуба Д.М. (1982), формирование плечевого сплетения начинается из спинномозговых нервов (С5 - Th1 и частично Th2) в результате их дихотомии на передние и задние ветви [31, 35, 45, 48, 326]. Так, на стадии зародыша человека длиною 5 мм, плечевое сплетение выявляется в виде рыхлой волокнистой массы, не подразделенной на отдельные стволы. На стадии 9 мм длин зародыша, в закладке выявляются три первичных ствола, сливающиеся в дистальном направлении в единый ствол, который истончается и заканчивается рядом тонких веточек у основания закладки почки конечности. В целом сплетение имеет вид нервной пластины, состоящей из рыхло расположенных нервных волокон, петли сплетения, при этом, еще не сформированы.
На стадии 11 мм длины зародыша, сформированные ранее три первичных нервных ствола, направляются к закладке верхней конечности и образуют компактную массу, которая в проксимальной части конечности делится на вентральный и дорсальный стволы. Дорсальная часть сплетения еще не дифференцирована, в вентральной части выявляется латеральный корешок срединного нерва и первоначальная закладка передних грудных нервов. Локтевой нерв, как самостоятельное образование не выявляется. Нервы еще не ветвятся, имеют рыхлую структуру [45].
На стадии 12-13 мм длины зародыша, после деления сплетения на вентральную и дорсальную части, из первой формируется мышечно-кожный нерв, срединный и локтевой нервы. Дорсальная часть сплетения делится на подкрыльцовый и лучевой нервы. В целом сплетение приобретает компактное расположение нервных волокон в стволах [45].
У зародыша 16 мм длины в образовании сплетения участвует С4 своей передней частью, а у зародыша 17 мм отмечена связь С4 - С5, Th2 - Th1, Th3h2. Верхний первичный ствол образован соединением С4-С5-С6, средний С7 и нижний С8- Th1. Первичные стволы делятся на вентральные и дорсальные ветви, которые, соединяясь между собой, формируют петли плечевого сплетения и три вторичных ствола – латеральный, медиальный и задний [45, 111, 112].
Характеристика исследуемого материала
Полученные цифровые данные (выраженные в пикселях) были переведены в мкм и мм (мкм2; мм2) при помощи деления пикселей на коэффициенты, специально для этого выведенные: объективы х4 – 1018333, х10 – 6379251, х40 – 98911797. С целью объемного изучения поверхности среза периферических нервов и окружающих их оболочек с кровеносными сосудами, был использован метод электронной растровой микроскопии на базе Междисциплинарного нано технологического центра ФГБОУ ВПО «Курский Государственный университет», согласно методическим рекомендациям M. Dufek, 2010 [255]. В начале исследования проводили пробоподготовку образцов (получен приоритетный номер на изобретение №2015115068/15(023550) от 30.06.2015г. «Способ пробоподготовки образцов биологических тканей для исследования методом атомно-силовой микроскопии»), затем материал помещали на токопроводящий углеродный скотч в камеру электронного растрового микроскопа Quanta 650 FEG. В режиме вторичных электронов детектором Эверхарта - Торнли в режиме высокого вакуума от 810-3 до 310-3 Па с ускоряющими напряжениями 1,5-2 кВ, при относительном диаметре пучка величиной 0,1 нА были получены изображения кровеносных сосудов соединительнотканных оболочек периферических нервов, периневрия, самих нервных пучков и нервных волокон. В процессе исследования осуществляли фотографирование участков изучаемых структур с одновременным нанесением размерной шкалы.
С целью изучения микрорельефа невральных оболочек, в том числе и параневральных соединительнотканных структур был применен метод атомно-силовой микроскопии, выполненный на сканирующем зондовом микроскопе «СОЛВЕР НЕКСТ» (НТ-МДТ, Россия) [121, 182]. В полуконтактном режиме с использованием кремниевых кантилеверов серии NSC19/Cr-Au (masch, Эстония), имеющих следующие характеристики: радиус закругления зонда – менее 40 нм; длина кантилевера - 125±5 мкм; резонансная частота от 52 до 113 кГц; жесткость от 0,17 до 1,7 Н/м; толщина металлического покрытия Cr-20 нм, Au – 20 нм, были получены сканы микрорельефа поверхности образцов периневрия, общего фасциального футляра, стропных элементов. Размером 50x50 мкм с разрешением 512x512 точек в режимах отображения высоты скана для визуализации морфологии поверхности, а также в режиме фазового контраста – для отображения распределения сил трения между зондом и образцом по поверхности.
Далее, в соединительной ткани невральных оболочек, в том числе и параневрии, была проведена количественно-качественная оценка клеточного компонента. По цито- и кариологическим признакам в соединительнотканных оболочках периферических нервов были выделены следующие типы клеток (рисунок 11): фибробласты (А) – самые распространенные клетки соединительной ткани, имеют очень крупную резко базофильную цитоплазму с выростами неправильной формы. В центре клетки располагается овальное, светлое, слабо базофильное ядро с эксцентричным, темно базофильным крупным ядрышком; фиброциты (Б) – по размерам значительно меньше, чем фибробласт, имеют веретеновидную форму. Мелкое, темное ядро палочковидной формы, цитоплазма светлая, ацидофильная; плазмоциты (В) – крупные овальные клетки с базофильной цитоплазмой. Сферическое ядро расположено эксцентрично, в кариоплазме которого, компактный гетерохроматин в виде крупных глыбок чередуется со светлыми участками примерно одинаковых размеров, напоминая по конфигурации циферблат часов. Около ядра располагается бледно окрашенный участок, так называемый - «светлый дворик», место локализации комплекса Гольджи и центриоли; макрофаги (Г) – клетки крупных размеров, цитоплазма, образующая значительное количество отростков, содержит хорошо различимые лизосомы и расположенное эксцентрично, ядро, неправильной формы; тучные клетки (рисунок 12) – овальной, округлой или прямоугольной (в условиях «гипокинезии») формы. Цитоплазма заполнена базофильными секреторными гранулами, которые часто маскируют мелкое сферическое ядро, расположенное в центре клетки [5, 132, 164, 194, 208, 321, 329]. Количественную оценку клеточного состава проводили в расчете на 100 клеток, не менее чем в 10 полях зрения.
Для объективизации формирования заключения о клеточной составляющей соединительнотканных оболочек периферических нервов, вычисляли соотношение клеток-резидентов (фибробласты, фиброциты и макрофаги) к клеткам-нерезидентам (гранулоциты, агранулоциты, тучные клетки и плазмоциты) и получали, условно обозначенный, клеточный индекс по следующей формуле: где Фб- фибробласты, Фц – фиброциты, Мф-макрофаги, Н-нейтрофилы, Э-эозинофилы, Л-лимфоциты, Мц-моноциты, ТК-тучные клетки, П-плазмоциты. В зависимости от количества цитоплазматических гранул и, как следствие, интенсивности фонового окрашивания клетки, а так же, учитывая классификацию Д.П. Линдера, 1976, 1980 [100, 101] и способ оценки тучных клеток Г.В. Порядина [148] , было выделено четыре типа тучных клеток (рисунок 12). Клетки 0-типа - очень темные, плотно заполнены интенсивно окрашенными гранулами, отдельные гранулы и ядро не различимы; I-тип -темные клетки, с хорошо различимым ядром и отдельными гранулами в цитоплазме; II-тип - светлые клетки, рыхло заполнены хорошо видимыми гранулами, менее интенсивно окрашенными и с отчетливо различимым ядром; III-тип - светлые клетки, с небольшим количеством окрашенных гранул в цитоплазме, с признаками нарушения целостности клеточной мембраны и выделения в окружающее пространство цитоплазматических гранул.
Морфологические особенности периферических нервов плечевого сплетения, в области средней трети плеча, иннервирующих мышцы – сгибатели
Соединительнотканные прослойки, отходящие от внутренней части периневрия, образуют эндоневрий. В рыхлой волокнистой соединительной ткани эндоневрия встречается большое количество мелких кровеносных сосудов – 9-10 в поле зрения. На правой конечности его толщина составила -1,372±0,055 мкм, на левой конечности - 1,635±0,038 мкм.
Нервные пучки образованы миелиновыми (65% и 73%) и безмиелиновыми (35% и 27%) нервными волокнами, среди которых, на долю средних волокон приходилось 73%, на долю крупных волокон – 27%, мелких и очень крупных волокон не было выявлено. Толщина миелина в мякотных волокнах составила – 2,940±0,050 мкм и 3,080±0,052 мкм, на правой и левой конечности соответственно. При этом, необходимо отметить, что почти четырехкратное статистически значимое снижение значений отношения диаметра осевого цилиндра к толщине миелиновой оболочки, свидетельствует об увеличении ее толщины и ускорении передачи нервного импульса в экспериментальном ряду животных.
В связи с полифункциональностью грудной конечности, в филогенетическом ряду позвоночных, наиболее ярко выраженные эволюционные преобразования произошли именно с ней. Не стали исключением и насекомоядные, являющиеся низшим звеном плацентарных млекопитающих.
У представителей класса млекопитающие, отряда ежеобразные (насекомоядные) - Еж европейский (Erinaceus europaeus), макроскопически, периферические нервы выглядели в виде плотных белых шнуров разного диаметра, находящихся на медиальной поверхности плеча в сопровождении крупных магистральных сосудов покрытых соединительнотканными оболочками (рисунок 20А). При микроскопическом изучении (рисунок 20Б) форма СНП нервов сгибателей была треугольной. Снаружи, все компоненты СНП были покрыты очень тонким, слабо выраженным, общим фасциальным футляром, толщиной 3,553±0,024 мкм и 3,262±0,022 мкм на левой и правой конечностях соответственно. Площадь поперечного сечения СНП на правой конечности составила – 2,169±0,010 мм2. При этом, площадь окружающей соединительной ткани составила – 1,467±0,009 мм2.
Следует отметить, что в сравнении с представителями класса птиц, соотношение нервной ткани к соединительной достоверно (р0,05) снижено в 1,9 раза, что свидетельствует о большем развитии соединительнотканных структур или невральных оболочек. Рисунок 20 – Микрофотография СНП нервов сгибателей в области средней трети плеча у представителей класса млекопитающие, отряда насекомоядные - Еж европейский (Erinaceus europaeus). А – макроскопический вид, Б – микроскопический вид, окрашено гематоксилином и эозином. Ув.х100. В окружающем эпиневрии, в прослойках рыхлой волокнистой соединительной ткани присутствует белая жировая ткань и крупные магистральные сосуды. Среди клеток эпиневрия преобладают клетки резиденты, на долю которых приходится 56% (Фб-22%, Фц-19%, Мф-15%). Значения КИ не имеют статистически значимых отличий от предыдущей группы наблюдения – представителей класса птицы (КИ=1,27). Площадь поперечного сечения нервных пучков (в количестве трех) варьирует от 0,107±0,001 мм2 до 0,145±0,002 мм2. Все пучки окружены тонким периневрием, толщиной – 5,858±0,024 мкм, плотно прилегающим к нервным волокнам. Кровеносные сосуды в периневрии встречаются редко, маленького диаметра. От периневрия во внутрь периферического нерва отходят тонкие прослойки соединительной ткани эндоневрия, толщиной 1,446±0,030 мкм. В толще эндоневральных прослоек встречаются единичные кровеносные сосуды. Нервные пучки образованы преимущественно миелиновыми (количество миелиновых – 57%, безмиелиновых 43%), диаметр которых составил – 4,732±0,028 мкм и толщинам миелина – 1,3484±0,016 мкм. Необходимо отметить, что в поле зрения преобладают мелкие и средние волокна, на долю последних приходится – 65%.
На левой конечности площадь, занимаемая СНП в 1,4 раза меньше, чем на правой конечности, при этом соотношение нервной ткани к соединительной, не имело достоверных отличий при сравнении с противоположной конечностью. Площадь окружающей соединительной ткани достоверно (р0,05) меньше, чем на правой конечности (таблица 4). В поле зрения преобладают фибробласты (24%), фиброциты (20%), макрофаги (16%) и тучные клетки (15%).
Реактивные изменения структур периферических нервов, на примере ветвей плечевого сплетения в условиях естественной функциональной активности
У представителей класса земноводные - Лягушка прудовая (Pelophylax lessonae), при макроскопическом изучении, периферический нерв, иннервирующий мышцы-разгибатели и расположенный по наружной стороне (задне - латеральной поверхности) плеча между мышцами, имел вид белой шнуроподобной структуры (рисунок 29А).
При микроскопическом изучении поперечных гистологических срезов СНП нерва разгибателей в области средней трети плеча, было выявлено, что его форма на правой конечности была треугольной или овальной. Общий фасциальный футляр, окружающий все компоненты СНП, тонкий (его толщина на правой конечности – 3,772±0,025 мкм, на левой – 2,685±0,018 мкм), не всегда визуализируемый, при окраске пикросириусом красным -ярко оксифильный (рисунок 29Б, В).
Площадь поперечного сечения СНП составила – 0,489±0,014 мм2. При этом, площадь поперечного сечения окружающей соединительной ткани или эпиневрия, была на 10% меньше, чем в СНП нервов сгибателей и составила 0,350±0,014 мм2. В клеточном составе преобладали клетки фибробластического ряда, на долю которых приходилось 49% от общего количества клеток. Количество макрофагов составило 22%, тучных клеток 19%, лимфоцитов – 7%, а количество нейтрофилов, плазмоцитов и моноцитов было единичным в поле зрения.
По периферии СНП, в острых углах, так называемого треугольника, располагались кровеносные сосуды – артерия, площадь поперечного сечения которой, составила – 0,020±0,0006 мм2 и вена, площадью – 0,015±0,0004 мм2, в центре – нервный ствол. В 80% наблюдений периферический нерв состоял из двух пучков, разделенных волокнами, достаточно тонкого, периневрия и окруженных общим фасциальным футляром (рисунок 29Б).
В 20% случаев второй пучок был отделен рыхлой соединительной тканью эпиневрия и располагался на значительном расстоянии от большого пучка. Площадь поперечного сечения нервного пучка была в 1,2 раза меньше, чем на той же конечности в нервах сгибателей, на фоне отсутствия статистически значимых отличий в значениях площади поперечного сечения эпиневрия. Периневрий, окружающий нервный пучок, имел незначительное разделение на внутренний клеточный и наружный волокнистый слои, толщина его составила – 3,542±0,014 мкм. От периневрия, внутрь нервного пучка отходят тонкие прослойки эндоневрия, толщиной – 1,171±0,033 мкм, окружающие миелиновые (диаметр – 6,663±0,039 мкм) и безмиелиновые (диаметр – 5,234±0,030 мкм) нервные волокна. Сосудов в эндоневрии мало – один-два в поле зрения. На левой конечности форма СНП была веретеновидной, площадь поперечного сечения составляла – 0,502±0,010 мм2 (рисунок 29В). В центре располагался однопучковый нерв, площадью – 0,118±0,001мм2, состоящий из миелиновых и безмиелиновых волокон, расположенных достаточно рыхло. В поле зрения преобладали миелиновые волокна, на долю которых приходилось 53% (на правой конечности их количество было в 1,2 раза больше и составило 66%). На фоне чуть большего диаметра как безмиелиновых, так и миелиновых волокон, толщина миелина последних не имела статистически значимых (р0,05) отличий от правой конечности и составила – 4,322±0,003 мкм.
В эндоневрии встречались мелкие и крупные кровеносные сосуды, в количестве 3-4 в поле зрения. Тонкий, плотно прилежащий к нервным волокнам периневрий, толщиной 3,851±0,012мкм, не подразделялся на слои, хорошо выражен только внутренний клеточный слой. Ядра клеток периневрия сигарообразной формы, расположены в 1-2 ряда. Количество эпиневрия незначительное, в нем расположены две артерии и вена, вокруг которых много темных клеток в стадии накопления секрета.
Микрофотография периферического нерва разгибателей на наружной стороне (задне- латеральной поверхности) плеча, в области средней трети, у представителей класса земноводные - Лягушка прудовая (Pelophylax lessonae). Макроскопический вид (А), микроскопический вид СНП нерва разгибателей на правой (Б) и левой (В) конечностях. Окрашено пикросириус красным. Ув. х100.
Площадь окружающей соединительной ткани, без достоверных отличий между конечностями, составила - 0,337±0,010 мм2. В клеточном компоненте преобладали клетки резиденты (Фб – 29%, Фц – 17%, Мф – 22%), при этом значение КИ варьировало от 2,13 в эпиневрии левого нерва разгибателей до 2,45 в эпиневрии правого. У представителей класса пресмыкающиеся - Ящерица прыткая (Lacerta agilis), эволюционные преобразования передней конечности, в связи с изменением ее функции, приводят к структурным изменениям как проводникового, так и стромального аппаратов нервов плечевого сплетения, иннервирующих мышцы-разгибатели. Макроскопический вид нерва разгибателей представлен на рисунке 30А. При световой микроскопии форма СНП нерва разгибателей на правой конечности была овальной или сигарообразной. В сравнении с земноводными, происходит достоверное (р0,05) двукратное снижение площади поперечного сечения СНП (рисунок 30Б). Снаружи, весь СНП заключен в собственное тонкое фасциальное влагалище, образован 2-3 нервными стволами и крупными кровеносными сосудами артериального и венозного русла, между которыми располагается соединительная ткань, обеспечивающая тесную взаимосвязь между компонентами сосудисто-нервного пучка и объединяющая их в анатомически и функционально единое целое. Толщина общего фасциального футляра была статистически значимо в 2 раза меньше, чем у представителей класса земноводные, не имела достоверных отличий между конечностями и составила – 1,887±0,012 мкм. Соединительнотканных строп, отходящих от фасциального футляра, не выявлено.
Волокна эпиневральной соединительной ткани расположены более компактно и упорядоченно, в сравнении с предыдущим классом. В поле зрения преобладали клетки фибробластического ряда, на их долю приходилось 42%.