Содержание к диссертации
Введение
1. Воспаление и эндотелиальные дисфункции 12
1.1. Синдром системного воспалительного ответа 12
1.2. Фактор некроза опухоли (ФНО) 15
1.2.1 Сигнальный комплекс I – TRADD-RIP1RAF2 17
1.2.1.1. Активация NFB-зависимого каскада 18
1.2.1.2. Активация МАР-киназного каскада 19
1.2.2 Сигнальный комплекс II—TRADD-RIP-1RAF-2-FADD- прокаспаза 8/10 19
1.2.2.1. Внешний путь индукции апоптоза 21
1.2.2.2. Внутренний путь индукции апоптоза 22
1.2.2.3. Семейство белков Bcl-2 и регуляция апоптоза 23
1.2.2.4. Регуляция белка Bcl-2 в клетке 24
1.3. Эндотелиальные дисфункции и механизмы их возникновения 26
1.3.1. Организация межклеточных контактов эндотелия 28
1.3.1.1 Плотные межклеточные контакты 29
1.3.1.1.1. Трансмембранные белки плотных контактов 30
1.3.1.1.2. Внутриклеточные белки плотных контактов 31
1.3.1.2 Адгезионные межклеточные контакты 32
1.3.1.2.1. Регуляция проницаемости за счет изменения уровней
экспрессии белков адгезионных контактов 35
1.3.1.2.2. Регуляция проницаемости за счет фосфорилирования белков адгезионных контактов 36
1.3.1.2.3. Регуляция проницаемости за счет ферментативного расщепления белков адгезионных контактов 39
2. Активные формы кислорода и их функции 44
2.1. Окислительный стресс и дисфункции митохондрий 47
2.1.1. Митохондриально-направленные антиоксиданты 48
2.1.1.1. Семейство MitoQ 48
2.1.1.2. Семейство SkQs 49
2.1.1.3. Соединения семейства TEMPO 50
2.1.2. Разобщители окислительного фосфорилирования 50
2.1.2.1. 2,4-Динитрофенол 50
2.1.2.2. Липофильные катионы семейства SkQs 52
3. Материалы и методы исследования 56
3.1. Клеточные культуры 56
3.1.1. Иммунофлуоресцентная микроскопия 57
3.1.2. Иммуноблотинг 58
3.1.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени 58
3.1.4. Проницаемость эндотелия in vitro 59
3.1.5. Зимография 59
3.2. Животные 59
3.2.1. Инъекции, мониторинг 60
3.2.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени
3.2.2.1. Выделение РНК из аорт мышей 60
3.2.2.2. Обратная транскрипция 61
3.2.2.3. Анализ концентрации мРНК методом ПЦР в реальном времени 61
3.3. Статистическая обработка результатов 63
4. Результаты и обсуждение 64
4.1. Низкие дозы разобщителей окислительного фосфорилирования и митохондриально-направленных антиоксидантов подавляют проницаемость эндотелия, вызванную ФНО in vitro 65
4.2. Низкие дозы разобщителей окислительного фосфорилирования и митохондриально-направленных антиоксидантов подавляют вызванное ФНО расщепление VE-кадгерина металлопротеазой внеклеточного матрикса-9 (ММР-9) 75
4.3. Низкие дозы разобщителей окислительного фосфорилирования и митохондриально-направленных антиоксидантов подавляют стимулированную ФНО экспрессию мРНК ММР-9 83
4.4. Подавление стимулированной ФНО экспрессии мРНК ММР-9 под действием разобщителей окислительного фосфорилирования и антиоксидантов происходит за счет ингибирования активации NFB 85
4.5. Низкие дозы разобщителей окислительного фосфорилирования и митохондриально-направленных антиоксидантов предотвращают гибель мышей, вызванную внутривенным введением мФНО 91
4.6. Низкие дозы разобщителей окислительного фосфорилирования и митохондриально-направленных антиоксидантов снижают уровни экспрессии молекул адгезии в аортах мышей после внутривенного введения мФНО 93
Заключение 100
Выводы 103
Благодарности 104
Список литературы
- Внешний путь индукции апоптоза
- Соединения семейства TEMPO
- Полимеразная цепная реакция в реальном времени
- Подавление стимулированной ФНО экспрессии мРНК ММР-9 под действием разобщителей окислительного фосфорилирования и антиоксидантов происходит за счет ингибирования активации NFB
Внешний путь индукции апоптоза
После диссоциации SODD, с DD взаимодействует белок TRADD (TNFR type 1-associated death domain protein), который привлекает адапторные белки RIP-1 (proteins-receptor interacting protein-1) и TRAF2 (TNF receptor-associated factor-2). Далее сформированный активный комплекс TRADD-RIP1RAF2 диссоциирует от рецептора. В свою очередь, RIP-1 и TRAF2 регулируют провоспалительные и антиапоптозные сигнальные каскады в основном за счет активации транскрипционных факторов NFKB и АР-1 (Рисунок 2). Эти транскрипционные факторы отвечают за экспрессию различных цитокинов, молекул адгезии, пролиферативных и клеточных факторов созревания, металлопротеаз, хемокинов и др. (Bradley, 2008; Eder, 1997; Hsu et al., 1996).
Семейство транскрипционных факторов NFKB представлено как гомо-, так и гетеродимерами, в состав которых входят белки р65 (RelA), RelB, с-Rel, р50 и р52, содержащие Rel-домен. Этот домен необходим для димеризации белков, транслокации из цитоплазмы в ядро и связывания транскрипционного фактора с ДНК (Li and Verma, 2002). Дим еры семейства NFKB в цитоплазме ассоциированы с ингибиторными белками ІкВа, 1кВ3 или ІкВє, предотвращающими транслокацию белков NFKB в ядро (Siebenlist et al., 2005). Согласно литературным данным, основным путем активации транскрипционного фактора NFKB является “канонический путь” активации. Ключевым моментом трансдукции сигнала “каноническим путем” является активация 1кВ киназного комплекса (IKK) (Devin et al., 2000). IKK состоит из каталитических субъединиц IKKa и IKK3, а также регулирующей субъединицы NEMO (ІККу). Передача сигнала осуществляется через TRAF2 и RIP-1, которые, в свою очередь, фосфорилируют IKKa и 1КК3. Активированная киназа 1КК3 фосфорилирует ингибиторный белок ІкВа по с 32 с 36 остаткам Ьег и Ьег , что ведет к убиквитинированию последнего и транслокации активного транскрипционного комплекса NFKB (чаще всего представленного комплексом белков р50/р65) в ядро (Bonizzi and Karin, 2004; Zandi et al., 1997). Трансдукция сигнала “неканоническим путем” может осуществляться как фактором некроза опухоли, так и липополисахаридами, лимфотоксинами, фактором активации В-лимфоцитов BAFF и др. (Sun, 2012). В основе механизма лежит активация киназы NIK (NFKB-inducing kinase) посредством TRAF2. Далее посредством NIK активируется киназный комплекс IKK, в свою очередь осуществляющий фосфорилирование предшественников plOO (NFKB2) и р105 (NFKBI). Затем происходит протеолитический процессинг С-терминальных концов рЮО и р105 с образованием активных р50 и р52 и дальнейшая транслокация димеров p50/RelA, p52/RelB в ядро. Важно отметить, что “неканоническим путем” в основном регулируется процесс дифференцировки клеток, в то время как “каноническим путем” регулируется ответ клеток на провоспалительные стимулы (Bonizzi and Karin, 2004; Sun, 2012).
Семейство митоген-активируемых протеинкиназ (МАР-киназы) включает в себя три группы: ERKs (the extracellular signal regulated kinases, изоформы: ERK-1 и ERK-2), JNKs (c-Jun TVerminal kinases, изоформы: JNK-1, JNK-2 и JNK-3) и киназы p38 (изоформы: p38-a, р38-Д p38-y и p38-c)). Каждая группа МАР-киназ активируется комплексом TRADD-RIP1RAF2 через каскад последовательных реакций фосфорилирования, начинающихся с MAP3Ks. Активированные MAP3Ks фосфорилируют MAP2Ks, которые в свою очередь активируют различные МАР-киназы (Brown and Sacks, 2009).
МАР-киназы участвуют в процессах воспаления (регулируют экспрессию ряда провоспалительных генов, молекул адгезии за счет активации транскрипционных факторов NFKB и АР-1 (Hess et al., 2004; Olson et al., 2007)), пролиферации, дифференцировки и апоптоза (Grethe et al., 2004; Kaminska, 2005; Kyriakis and Avruch, 2001; Yan et al., 2002).
Формирование сигнального комплекса I (TRADD-RIP1RAF2) приводит к активации сигнальных путей, направленных на процессы выживания, в то время как формирование сигнального комплекса II (TRADD-RIP-1RAF-2-FADD-прокаспаза 8/10) приводит к индукции апоптоза, путем автолиза, осуществляемого семейством каспаз и белком Bid (Zelov and Hoek, 2013).
Молекулярные механизмы апоптоза Апоптоз представляет собой сложную генетическую программу с большим количеством сигнальных каскадов и регуляторов. В индукции апоптоза различают два основных сигнальных каскада: “внешний путь” и “внутренний путь”. Внешний путь запускается взаимодействием “лигандов смерти” с рецепторами TNFR1 и ведет к формированию DISC комплекса (сигнального комплекса II) и активации каспазы- 8. Внутренний путь запускается выходом цитохрома с из митохондрий и приводит к образованию апоптосомы и активации каспаз - 9. В дальнейшем, каспазы - 8 и - 9 активируют сигнальный каскад, включающий каспазу - 3, ведущий к гибели клеток (Hotchkiss et al., 2005) (Рисунок 3).
Соединения семейства TEMPO
Белок эндотелиальных межклеточных контактов VE-кадгерин подвержен ферментативному расщеплению. Причем, разные исследователи методически оценивают этот процесс по-разному. Одни измеряют уменьшение общего количества белка, другие - накопление продуктов его расщепления.
Известно несколько протеаз, расщепляющих VE-кадгерин in vivo и in vitro. Так, матричные металлопротеазы (ММРs) обладают способностью к расщеплению компонентов внеклеточного матрикса, в состав которых может входить VE-кадгерин. В результате расщепления VE-кадгерина ММРs высвобождается внеклеточный С-концевой домен этого белка. Повышение содержания внеклеточного домена VE-кадгерина является своего рода маркером развития различных патологий, в частности атеросклероза, ревматоидного артрита и диабета (Navaratna et al., 2007; Sidibe et al., 2012; Soeki et al., 2004). В ряде исследований in vitro было показано, что активация различных матричных металлопротеаз (MMP-9, MMP-2, MMP-7) способствует появлению в культуральной среде внеклеточного домена VE-кадгерина, и как следствие, повышению проницаемости эндотелия для альбумина (Ishikawa et al., 2001; Navaratna et al., 2007; Wu, 2003). Для Zn2+-зависимых металопротеаз семейства ADAMs также показана способность к специфическому расщеплению внеклеточного домена VE-кадгерина. В исследованиях на клетках HUVEC повышение активности металлопротеазы ADAM10 способствовало протеолитическому расщеплению VE-кадгерина, а также увеличению проницаемости и миграции лейкоцитов через эндотелий (Schulz et al., 2008).
MMPs – это семейство Ca2+ и Zn2+-зависимых белков (более 20 представителей), играющее важнейшую роль в процессах воспаления, ангиогенеза, заживлении ран и метастазировании опухолей (Stamenkovic, 2003). Активность матричных металлопротеаз регулируются на нескольких уровнях: транскрипционном, трансляционном и посттрансляционном. Провоспалительные цитокины в зависимости от типа клеток могут выступать как в качестве позитивных, так и негативных регуляторов экспрессии мРНК генов MMPs. Например, под воздействием ФНО экспрессия мРНК MMP-9 повышается в ряде типов клеток: эндотелиальных клетках (Genersch et al., 2000), клетках почечных канальцев (Nee et al., 2004), фибробластах (Sato et al., 1996). При этом, в фибробластах легких человека экспрессия мРНК MMP-9 падает под действием ФНО и ИЛ-1, (Sasaki et al., 2000). После секреции из клеток, активность MMPs контролируется как протеолитической активацией латентных проферментов, так и взаимодействием со специфическими ингибиторами металлопротеаз (Yao et al., 1997).
MMP-2 и MMP-9 – основные металлопротеазы, участвующие в разборке межклеточных контактов эндотелиальных клеток. Несмотря на то, что MMP-2 и MMP-9 имеют схожую субстратную специфичность, существует разница в регуляции их экспрессии (Senior et al., 1991). Так, экспрессия мРНК MMP-2 постоянна (Rosalind P. Fabunmi et al., 1996). В противоположность этому, провоспалительные цитокины, в частности ФНО, способствуют продукции MMP-9 различными типами клеток: лейкоцитами, эндотелиальными клетками, мышечными клетками и фибробластами (Moon et al., 2004; Schwingshackl et al., 1999).
Известны сигнальные каскады, приводящие к активации MMP-9 в эндотелиальных клетках под действием провоспалительных цитокинов. В эндотелиальных клетках показано, что под действием ФНО индуцируется сигнальный каскад Raf/MEK/ERK, который участвует в регуляции активности экспрессии мРНК MMP-9 через активацию транскрипционных факторов NFB и AP-1(Genersch et al., 2000; Moon et al., 2004).
Помимо ферментативного расщепления металлопротеазами внеклеточного домена VE-кадгерина, каспазы также могут вносить свой вклад в увеличение проницаемости эндотелия под действием ФНО (Рисунок 8). В исследованиях in vitro было показано, что низкие концентрации ФНО (при которых не наблюдается процесс апоптоза) индуцируют активацию каспазы-3, приводящую к перераспределению белков VE-кадгерина и ZO-1 в зоне межклеточных контактов. Необходимо отметить, что низкие концентрации ФНО не снижали общее содержание этих белков в эндотелиальных клетках, тем самым указывая на опосредованную роль каспаз в регуляции VE-кадгерина (Lopez-Ramirez et al., 2012). Субстратами для каспаз могут выступать -катенин и плакоглобин, расщепление которых способствует нарушению комплекса межклеточных адгезионных контактов и перераспределению VE-кадгерина (Herren et al., 1998).
Полимеразная цепная реакция в реальном времени
Образцы для иммуноблотинга готовились методом Лэммли. Культуральную среду удаляли из плашек с клетками, затем клетки дважды промывали холодным раствором ФБС и лизировали 2х-кратным Sample buffer для образцов. Лизаты переносили в чистые эппендорфы, прогревали при температуре 95 C в течение 2-х минут, замораживали и хранили при -200С.
Перед нанесением на полиакриламидный гель (ПААГ) пробы прогревали при 95C в течение 2-х минут. Электрофорез проводили в 12% ПААГ. Разделенные белки переносили на PVDF мембрану (Amersham Sciences, Hybond-P). Далее 5% обезжиренным молоком в ТБСТ буфере (25мM Tris pH 7,4, 0,15M NaCl, 0,1% Tween20) блокировали сайты неспецифического связывания. Затем мембраны инкубировали в течение ночи при температуре +4C с антителами в 5% растворе БСА/ТБСТ (антитела против VE-кадгерина, p-IB, p-p38, p-SAPK/JNK (все - eBiosciense), в качестве хаускиппинг были выбраны антитела против тубулина (Sigma) и антитела против GAPDH (Sigma)). Со вторыми антителами (против мышиных или кроличьих иммуноглобулинов, коньюгированных с пероксидазой хрена (Sigma) и разведенных в 5% растворе БСА/ТБСТ) мембраны инкубировали в течение 1 часа. Белки визуализировали с использованием ECL-набора в соответствии с рекомендациями производителей (GE Healthcare). Проявленные пленки сканировали, результаты обрабатывали при помощи программы ImageJ.
Определение концентрации мРНК в эндотелиальных клетках EA.hy926 проводили с использованием RNeasy Mini-набора в соответствии с рекомендациями производителей (QIAGEN). После окончания инкубации с ФНО клетки промывали холодным раствором ФБС и лизировали в 350 мкл буфера RLT. Выделение мРНК из клеток, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили аналогично схеме работы с животной тканью (см. ниже).
Тест проницаемости эндотелия in vitro проводили в соответствии с методом, описанным в работе (Chen et al., 2008) Эндотелиальные клетки EA.hy926 высаживали на фильтр Transwell (Corning Costar) и обрабатывали различными антиоксидантами или разобщителями. После достижения клетками 100% конфлюэнтного монослоя меняли среду, содержащую 10% сыворотки, на среду с 0,2% сыворотки на 12-18 часов для синхронизации клеточного цикла. Далее в культуральную среду добавляли ФНО (10 нг/мл). Через 24 часа в верхнюю камеру добавляли ТРИТЦ-декстран (1 мг / мл, 65-85 кДа). Количество ТРИТЦ-декстрана, прошедшего через монослой клеток в нижней камере, определяли флуорометрически на планшетном флуориметре Thermo Fisher Scientific Fluoroskan Ascent при длине волны 485/590 нМ.
Зимографическое определение активности ММР проводили в соответствии с методом, описанным в работе (Bogani et al., 2007). После инкубации клеток с ФНО электрофорез проводили с образцами (около 30 мкл культуральной среды) при 4С в 7,5% -ном полиакриламидном геле, содержащем 10% SDS и желатин (1мг / мл). После завершения электрофореза полиакриламидные гели промывали 2,5% раствором Triton X-100 (Sigma) при комнатной температуре в течение 60 минут. Затем гели инкубировали в активационном буфере (50мМ Tris-OH, 150мМ NaCl, 10мМ CaCL2, 1мМ ZnCl2) в течение 12 часов при 37С. Далее гели окрашивали 0,1% раствором Кумасси (Sigma) в 25% -ном метаноле и 7% -ной уксусной кислоты. Проявленные раствором Кумасси гели сканировали, результаты обрабатывали при помощи программы ImageJ.
Мыши C57BL / 6J в возрасте 8-12 недель были приобретены из Janvier, Франция. Содержались в виварии университета г. Гента (Бельгия). Все эксперименты на мышах были проведены в соответствии с институциональными, национальными и европейскими нормами. Протоколы экспериментов на животных были одобрены комитетом по этике Гентского университета.
Терапевтические инъекции SkQ1, ДНФ, C12TPP проводились следующим образом: 100 нмоль / кг SkQ1 (или C12TPP) вводили внутрибрюшинно на 1, 12, 24, 36, и 48 ч до инъекции мФНО; в общей сложности, каждое животное получало по 500 нмоль / кг SkQ1 или C12TPP. ДНФ в концентрации 1,1 мкмоль / кг (до конечной 5,5 мкмоль / кг) вводили по схеме, описанной для SkQ1. мФНО разводили в растворе ФБС (pH 6,8) и вводили внутривенно (объем 0,1 мл). Температура тела измерялась электрическим термометром (Comark Electronics). Образцы тканей аорт были собраны в назначенное время после инъекции.
Подавление стимулированной ФНО экспрессии мРНК ММР-9 под действием разобщителей окислительного фосфорилирования и антиоксидантов происходит за счет ингибирования активации NFB
Таким образом, предотвращение митохондриально-направленными антиоксидантами и разобщителями окислительного-фосфорилирования (как липофильными катионными, так и протонофорами) увеличения ММР-9-зависимой проницаемости эндотелия под действием ФНО вызвано снижением активации транскрипционного фактора NFB. Отметим, что антиоксидант, полученный из грибов Hericium erinaceus (НЕ) подавляет не только вызванные ФНО повышение экспрессии мРНК ММР-9 и 1С AMI, но и ФНО-зависимую активацию транскрипционного фактора NFKB в эндотелиальных клетках EA.hy926 (Chang et al., 2016). Антиоксидант а-липоевая кислота подавляет вызванную ФНО NFKB-зависимую экспрессию мРНК молекул адгезии ІСАМ1 и VCAM1, Е-селектина и МСР-1, а также адгезию моноцитов к поверхности эндотелиальных клеток НАЕС (human aortic endothelial cells) (Zhang and Frei, 2001).
Важнейшая роль митохондрий в процессе активации эндотелиальных клеток под действием ФНО была продемонстрирована раннее в нашей лаборатории. Показано, что разобщители окислительного фосфорилирования (как липофильные катионы, так и протонофоры) и митохондриально-направленные антиоксиданты подавляют вызванную ФНО NFKB-зависимую экспрессию молекул адгезии 1С AMI и VCAM1, а также адгезию нейтрофилов к поверхности эндотелиальных клеток (Romaschenko et al., 2015; Zinovkin et al., 2014).
Таким образом, подавление активности транскрипционного фактора NFKB антиоксидантами и разобщителями окислительного фосфорилирования приводит как к подавлению адгезии лимфоцитов на поверхности эндотелия, так и к подавлению увеличения проницаемости эндотелия, под действием ФНО.
Результаты, полученные в первой части диссертационной работы указывают, что антиоксиданты и разобщители окислительного фосфорилирования предотвращают увеличение проницаемости эндотелия, вызванное ФНО в системе in vitro. Как уже было отмечено, нарушение нормального функционирования эндотелия сосудов при развитии ССВО является необходимым этапом в развитии синдрома полиорганной недостаточности и смерти (Yuan and Rigor, 2011). В серии работ проведенных на животных было показано, что соединения семейства SkQs - SkQRl, обладают терапевтическим действием в патологических состояниях, протекающих на фоне острого воспаления (Isaev et al., 2012; Plotnikov et al., 2013). Введение липофильного катиона C12R1 семейства SkQs в модели in vivo способствовало улучшению функционального состояния органов при ишемии/реперфузии почки и рабдомиолизе. C12R1 снижал площадь повреждения при ишемии/реперфузии мозга (Khailova et al., 2014; Plotnikov et al., 2012).
Во второй части работы, основываясь на описанных выше данных, мы оценили влияние митохондриально-направленных антиоксидантов SkQ1 и разобщителей окислительного фосфорилирования ДНФ и С12TPP на выживаемость животных в модели ССВО, вызванной внутривенным введением ФНО. 4.5. Низкие дозы разобщителей окислительного фосфорилирования и митохондриально-направленных антиоксидантов предотвращают гибель мышей, вызванную внутривенным введением мФНО
Мы использовали так называемую стерильную модель сепсиса, вызванную введением ФНО, в качестве индуктора развития ССВО (Tracey, 1986). У мышей линии C57BL/6J (Janvier) внутривенное введение мышиного ФНО (мФНО) (12,5 мкг/кг) вызывает характерное для ССВО снижение температуры тела и гибель всех животных в контрольной группе (10 мышей) в течение 24 часов (Рисунок 22 (А, В)). Предварительное внутрибрюшинное введение (за 48 часов до мФНО) SkQ1 (500 нмоль/кг) или ДНФ (5,5 мкмоль/кг) приводило к подавлению падения температуры тела и снижению смертности животных на 70% и 50% соответственно.
Митохондриально-направленный антиоксидант SkQ1 и разобщители окислительного фосфорилирования предотвращают гибель мышей, вызванную внутривенным введением ФНО. (А-Г) Температура тела и выживание мышей линии C57BL/6J (A, n = 10; B, n = 10; Б, n5; Г, n5;) после внутривенного введения двух различных доз мФНО (A=12,5 мкг; B=12,5 мкг; Б=10 мкг; Г=10 мкг) и предварительного внутрибрюшинного (в.б.) введения SkQ1 (500 нмоль / кг), C12TPP (500 нмоль / кг) или ДНФ (5,5 мкмоль / кг). Терапевтический протокол для SkQ1 (C12TPP или ДНФ) был следующим: в.б. инъекция по 100 нмоль / кг SkQ1 (C12TPP) или по 1,1 мкмоль/кг ДНФ на 1, 12, 24, 36 и 48 ч. до внутривенного введения ФНО. Результаты, полученные в нескольких независимых опытах представлены в виде среднего ± SEM; p0.05 p0.01, p0.001, p0.0001 для SkQ1 (C12TPP или ДНФ) + мФНО по сравнению с соответствующей концентрацией мФНО.