Введение к работе
Актуальность проблемы.
Проблема межклеточных взаимодействий является весьма актуальной, поскольку она охватывает различные аспекты жизнедеятельности тканей и органов в норме и при патологии. В частности, межклеточные взаимодействия играют важную роль в регуляции эмбриогенеза гисто- и органогенеза, канцерогенеза и других процессов. Одним из подходов к изучению этой проблемы является анализ кинетики синтеза белка в клетках. Всестороннее исследование результатов использования данного показателя позволило сделать выводы о том, что основной механизм организации суммарного ритма синтеза белка обусловлен прямыми межклеточными взаимодействиями. Ритм синтеза белка — один из вариантов метаболических околочасовых ритмов. Он, как и другие околочасовые ритмы, не имеющие внешнего пейсмекера, является фундаментальным свойством клетки. Наличие этого ритма свидетельствует о степени согласованности (синхронизации) активности клеток при выполнении органом определенных функций, а линейная кинетика – показатель несинхронного состояния популяции, то есть отсутствие интенсивных межклеточных взаимодействий. (Бродский, 2014). Особое значение имеют исследования на модели культуры клеток, поскольку клеточная культура - это хорошо контролируемая (идеализированная) система для изучения эффектов различных биологически активных веществ в определенных дозах. Приобретаемая при этом информация является важным компонентом для изучения более сложных межклеточных взаимодействий, осуществляющихся в условиях целого организма.
Степень разработанности проблемы.
В настоящее время особое внимание уделяется поиску механизмов регуляции синхронизации деятельности клеток с позиции проблемы межклеточных взаимодействий (Hammond K.D. et al. 1989; Brodsky VY, 1975; Бродский В.Я., 1998 Бродский В.Я. 2000; Brodsky V.Y., 2006; Н.Д. Звездина и др., 2008). Есть основания считать, что основными звеньями формирования единого ритма синтеза белка являются: воздействие на клетки определенных факторов-организаторов, изменение уровня ионов кальция в цитоплазме клеток, активация протеинкиназ и изменение интенсивности фосфорилирования белков. Кроме того, существенную роль в регуляции функциональной активности клеток при формировании околочасвого ритма синтеза белка играют ганглиозиды, которые вырабатываются самими клетками
и отделяются от их поверхности (Бродский В.Я. и др., 1996; Звездина Н.Д. и др., 2000; Brodsky V.Y., 2006), а также вещества, поступающие из крови и воздействующие на клетки извне через рецепторы. К их числу относятся: адреналин и норадреналин, серотонин и его производное – мелатонин; из известных фармакологических препаратов таким свойством обладает фенилэфрин (Бродский В.Я. и др., 2000; Звездина Н.Д. и др., 2008; Бродский В.Я., 2009). Показано, что наиболее эффективным организатором околочасового ритма синтеза белка в культуре является мелатонин (Звездина Н.Д. и др., 2008), и что он обладает синхронизирующим эффектом при введении in vivo с последующим приготовлением культур. (Brosdky V.Y et al, 2008; Brodsky V.Y. et al, 2010).
В настоящей работе продолжено изучение эффектов мелатонина в организации ритма синтеза белка, в частности, исследована продолжительность сохранения его действия при введении in vivo. Кроме того, было изучено влияние нового (в контексте данной проблемы) вещества – дофамина. При этом надо отметить, что в предыдущих исследованиях основные сведения о регуляции становления ритма синтеза белка были получены в основном в условиях культуры. В этой связи надо отметить, что действия указанных факторов при введении их in vivo изучены недостаточно, и поэтому в настоящей работе было проведено исследование эффектов фенилэфрина, мелатонина и дофамина при их прижизненном введении животному с последующим приготовлением культуры клеток для соответствующего анализа кинетики синтеза белка.
В целях углубления представлений о механизмах регуляции состояния межклеточных взаимодействий в работе, кроме вышеперечисленных, целесообразно изучить следующие показатели: динамику количества белка, выделяемого из клетки; интенсивность его разрушения в протеасомах. Это исследование может дать представление о механизмах удаления белка из клетки, что является негативным контролем ритма синтеза белка. Также следует изучить действие уже известных синхронизаторов ритма синтеза белка (мелатонина, норадреналина, ганглиозидов) в условиях сниженной активности протеасом, и роль протеинкиназ в данном процессе в аналогичных условиях.
Цель работы:
исследовать влияние мелатонина дофамина и других факторов в регуляции межклеточных взаимодействиях на основе анализа ритма синтеза белка в культурах гепатоцитов.
Задачи исследования:
-
Исследовать динамику длительности сохранения эффекта синхронизации ритма синтеза белка в культуре, полученной из печени животного в определенные сроки после введения им мелатонина; провести сравнительный анализ действия мелатонина и фенилэфрина на кинетику синтеза белка в аналогичных условиях.
-
Изучить влияние дофамина на кинетику синтеза белка в культуре гепатоцитов in vitro.
-
Изучить влияние дофамина на кинетику синтеза белка в культуре, полученной из печени животного в определенные сроки после прижизненного введения им дофамина.
-
Изучить динамику процессов выделения белка из клеток и значение внутриклеточной деградации белка в реализации механизмов межклеточных взаимодействий.
-
Исследовать влияние мелатонина и других синхронизаторов ритма синтеза белка (мелатонин, ганглиозиды, активатор протеинкиназ ФМА) в условиях сниженной активности протеасом.
Степень обоснованности научных положений, выводов, рекомендаций.
Научные положения и практические рекомендации, сформулированные автором в диссертации, основаны на изучении достаточного объема материала, полученного от экспериментальных животных. В работе использованы методы исследования, полностью отвечающие поставленным задачам. Приведены результаты 17 экспериментов. Графики, полученные в результате статистического анализа достоверно отражают наличие или отсутствие межклеточной кооперации. Выводы аргументированы и вытекают из проведенных автором исследований.
Научная новизна работы.
В работе впервые показано, что продолжительность сохранения
синхронизирующего действия мелатонина на ритм синтеза белка при его введении in vivo в различные сроки после введения мелатонина с последующим анализом кинетики синтеза белка в культуре составляет как минимум двое суток. Установлено, что фенилэфрин, введенный in vivo, не синхронизирует синтез белка в культуре.
Дофамин нарушает предсуществующий ритм синтеза белка. При этом существенно, что дезорганизующий эффект дофамина обратим, а также ритм может быть восстановлен под влиянием других, исследуемых в работе синхронизаторов (ганглиозидов и мелатонина). Проведено исследование роли процессов выделяемого белка из клетки, а также его протеасомной деградации в формировании рисунка кинетики синтеза белка, т.е. изучена возможность влияния катаболизма белков на ритм их синтеза, т.е. на межклеточные взаимодействия. При этом выявлено существенное влияние снижения активности протеасом на состояние межклеточных взаимодействий, а именно их снижение, что отражается в нарушении ритма синтеза белка. Исследованы особенности эффектов мелатонина и других известных синхронизаторов ритма синтеза белка на фоне ингибирования активности протеасом, они восстанавливают ритм синтеза белка, то есть улучшают межклеточные взаимодействия.
Научно-практическая значимость.
Исследование носит экспериментальный характер и направлено на изучение
влияния определенных биологически активных веществ на регуляцию межклеточных
взаимодействий. Сведения, полученные об особенностях действия мелатонина
фенилэфрина, ганглиозидов, норадреналина и дофамина на межклеточные
взаимодействия в различных ситуациях могут быть полезны при дальнейшем
исследовании различных аспектов изучаемой проблемы с практической и
теоретический точки зрения. Это обусловлено, в частности, тем, что используемые в
экспериментах вещества активно применяются в клинической практике.
Существенно, что при оценке эффектов этих веществ выявлено положительное влияние на межклеточные взаимодействия мелатонина, и отрицательное влияние на них дофамина. Особое значение имеет информация о роли процессов выделения и деградации белков в регуляции межклеточных взаимодействий. Эти сведения важны для углубления существующих представлений в данной области клеточной биологии, поскольку в настоящее время выявлена важная роль состояния протеасомной активности в регуляции деятельности клеток различных популяций. Кроме того, полученная информация, на наш взгляд, представляет интерес в плане изучения «ненервной» функции некоторых нейротрансмиттеров (в частности, норадреналина), используемых в нашей работе. Полученные данные, возможно, следует учитывать
при сочетанном применении препаратов, обладающих антагонистическими
эффектами на межклеточные взаимодействия. Результаты проведенного
исследования могут быть использованы в учебном процессе на кафедрах биологии, гистологии, фармакологии, а также в работе лабораторий, занимающихся соответствующими аспектами проблем клеточной биологии, гепатологии, онкологии и других областей.
Положения, выносимые на защиту.
-
В работе получены дополнительные сведения о влиянии биологически активных веществ (мелатонин, дофамин, ингибитор протеасом MG132) на степень кооперации гепатоцитов, о чем свидетельствуют показатели кинетики синтеза белка и его выделения.
-
Синхронизирующее влияние мелатонина на ритм синтеза белка (повышающее интенсивность межклеточных взаимодействий), исследованное в экспериментах с введением его in vivo и последующем получении культуры гепатоцитов продолжается минимум двое суток. Фенилэфрин в аналогичной ситуации не оказывает синхронизирующего влияния на культуры гепатоцитов.
-
Дофамин не обладает синхронизирующим ритм синтеза белка эффектом в отличие от мелатонина и других, ранее изученных (в контексте данной проблемы) катехоламинов – норадреналина и адреналина.
-
Дофамин обладает дезорганизующим действием на предсуществующий ритм синтеза белка как при внесении его в культуру, так и после введения его in vivo, то есть дофамин нарушает межклеточные взаимодействия. Указанный эффект в обоих случаях обратим.
-
Характер регистрируемой кинетики синтеза белка зависит от скорости его синтеза, от скорости выделения белка из клетки, а также от интенсивности его катаболизма. Выделение белков из клетки происходит в околочасовом ритме.
-
Активность протеасом влияет на состояние межклеточных взаимодействий, о чем свидетельствует нарушение ритма синтеза белка при их ингибировании.
Апробация работы.
Материалы работы на совместном заседании сотрудников кафедры гистологии,
эмбриологии и цитологии лечебного факультета и кафедры биологии
педиатрического факультета федерального государственного бюджетного
образовательного учреждения высшего образования «Российского национального исследовательского медицинского университета имени Н.И. Пирогова» Минздрава России 18 апреля 2017 года. Основные положения работы доложены на Пироговской конференций студентов и молодых ученых в 2013 году и XVI Школе-Конференции «Актуальные проблемы биологии развития» ИБР РАН, 28.10. 2013)
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 4 – статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Личный вклад автора.
Основные результаты получены при непосредственном участии автора на всех этапах процесса исследования, анализа имеющейся научной литературы, непосредственном участии в проведении экспериментов, обработки полученных результатов, в том числе проведения статистического анализа, личном участии в апробации результатов исследования, подготовке основных публикаций по выполненной работе и написании текста диссертации.
Объем и структура работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемых литературных источников, состоящего из 157 ссылок (35 отечественных и 122 иностранных). Общий объем диссертации составляет 142 страниц машинописного текста. Иллюстративный материал содержит 23 рисунка и 17 таблиц.