Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1 .Общие сведения о меланоме 12
1.2.Матриксные металлопротеиназы в онкогенезе и меланомоонкогенезе .16
1.3. Сигнальные пути, отвечающие на ММП 26
1.4. Экспериментальные модели для идентификации мишеней ММП 33
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 42
2.1 .Экспериментальное моделирование меланомы кожи in vivo 42
2.2. Воз действие ингибитором матриксных металлопротеиназ 46
2.3.Исследование динамики опухолевого роста in vivo 46
2.4. Исследование морфометрических показателей 47
2.5.3имография 48
2.6.Иммуногистохимическое исследование 49
2.7.Выделение РНК и постановка ПЦР в реальном времени 51
2.8.Исследование лимфоцитарной инфильтрации первичных опухолевых узлов 54
2.9.Статистическая обработка 54
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 56
3.1.Оценка результатов трансплантации опухолевых клеток меланомы В-16 56
3.2.Оценка динамики опухолевого роста 56
3.3. Оценка морфометрических показателей первичных опухолевых узлов при вскрытии 57
3.4.Оценка результатов зимографии 59
3.5.Оценка уровней клеточной пролиферации опухолевых клеток 60
3.6.Оценка лимфоцитарной инфильтрации первичных опухолевых узлов меланомы 62
3.7.Оценка уровней экспрессии микроРНК miR-21 и miR-let-7b з
3.8.Оценка уровня экспрессии транскрипционного фактора Twist 1 67
3.9.Оценка уровней экспрессии TGF-pi 69
3.10.Анализ корреляционной взаимосвязи между исследуемыми параметрами 72
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 76
Выводы 101
Практические рекомендации 103
Список литературы
- Сигнальные пути, отвечающие на ММП
- Экспериментальные модели для идентификации мишеней ММП
- Исследование морфометрических показателей
- Оценка морфометрических показателей первичных опухолевых узлов при вскрытии
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Меланома - злокачественное новообразование кожи, возникающее вследствие трансформации меланоцитов, которое является самым смертоносным среди злокачественных новообразований кожи (Chin L. et al., 2006).
Заболеваемость и смертность от меланомы неуклонно растут как в Российской Федерации, так и в других странах мира со светлокожим населением (Каприн А.Д. и др., 2015; Karim-Kos Н.Е. et al, 2008). Также за последние несколько лет отмечен рост заболеваемости меланомой у лиц молодого возраста (Bleyer A. et al., 2009; Berk D.R. et al, 2010). Меланома ассоциирована с низкими показателями продолжительности жизни пациентов, однако в течение последних десятилетий наблюдается небольшая положительная динамика в этом отношении, что может быть обусловлено оптимизацией ранней диагностики с последующей хирургической резекцией первичной опухоли (Perrot C.Y. et al., 2013). Вместе с тем, прогноз для жизни при метастатической меланоме крайне неутешителен, 5-летняя выживаемость таких пациентов составляет лишь менее 12%, а способы лечения диссеминированной формы меланомы крайне ограничены (Tas F., 2012).
До недавнего времени для лечения метастатической меланомы в составе стандартной химиотерапии применялся только дакарбазин, но благодаря новым экспериментальным данным в современной онкологической практике появилось два препарата, одобренных для клинического применения - вемурафениб и ипилимумаб (Kudchadkar R.R., 2013). Вемурафениб является препаратом выбора для лечения меланомы у пациентов, имеющих мутацию в гене BRAF, в то время как ипилимумаб является моноклональным антителом против антигена CTLA-4 цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессия которого на поверхности активированных Т-клеток связана с блокированием противоопухолевого иммунного ответа (Харкевич Г.Ю. и др., 2012).
Но, несмотря на ранний терапевтический эффект этих препаратов, характеризующийся развитием быстрой и эффективной регрессии опухоли, быстро наступает лекарственная устойчивость, в частности, к BRAF-ингибиторам. Иммунопрепараты, применяющиеся в терапии меланомы кожи, характеризуются серьезными побочными эффектами, а также не имеют маркеров для выбора пациентов, чувствительных к ним. Поэтому актуальным направлением в дерматоонкологии является выявление молекулярных механизмов опухолевой прогрессии с целью поиска новых молекулярных мишеней и использование полученных данных в качестве основ для создания новых молекулярно-нацеленных препаратов терапии диссеминированной меланомы.
Степень разработанности темы исследования. Меланома характеризуется высокой гетерогенностью, ее генетический и иммунологический «портрет» не является однозначным и статичным. Исследования, проводимые in vitro, показывают, что культивируемые клеточные линии меланомы производят повышенные уровни цитокинов и факторов роста с плейотропными биологическими функциями (Lazar-Molnar Е. et al., 2000), к которым относится TGF-P, являющийся прототипом молекулы многофункциональной сигнализации, то есть элементом нескольких систем сложных биологических сигналов, обеспечивающих основу для внутриклеточных и межклеточных связей клеток высших организмов, а также поддержания жизнедеятельности клетки (Verrecchia F. et al., 2002). В опухолевой ткани работа TGF-P-пути сигнальной трансдукции связана с реализацией важнейших клеточных процессов, включая рост опухоли, инвазию, уклонение от иммунного надзора, ангиогенез и метастазирование (Border W. et al, 1994).
Важную роль в биологии опухоли, начиная от инициации, васкуляризации, диссеминации до метастазирования и регуляции противоопухолевого иммунологического надзора играют также и матриксные металлопротеиназы (ММП) (Farina A.R. et al., 2014). Традиционно считалось, что ММП функционируют лишь в качестве протеолитических ферментов, воздействуя на основные компоненты экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ), но последние исследования показали, что ММП могут функционировать в качестве регуляторов путей сигнальной трансдукции, путем прямого протеолиза и косвенного регулирования других протеаз, через расщепление и инактивацию ингибиторов протеаз, и, таким образом, оказывать влияние на сигнальные молекулы, в том числе и TGF-P (Bhoopathi P. et al, 2008; Григорьева И.Н., 2010; Farina A.R. et al, 2014).
В этой связи является актуальным исследование взаимоотношение ряда модуляторов опухолевого роста и прогрессии и, в частности, функционирование ММП в качестве регуляторов активации TGF-P-пути сигнальной трансдукции на модели меланомы кожи in vivo, с целью разъяснения механизмов меланомагенеза, что может быть использовано в дальнейшем для выработки новых подходов в терапии меланомы кожи.
Цель исследования. Исследовать роль ингибирования матриксных металлопротеиназ-9/13 на экспрессию TGF-P и ассоциированных с ним особенностей опухолевой прогрессии на модели меланомы кожи in vivo.
Задачи исследования:
-
Исследовать изменение экспрессии TGF-pi и Twistl при селективном ингибировании ММП-9 и сочетанном ингибировании ММП-9 и ММП-13, в динамике опухолевого роста в клетках меланомы кожи in vivo, а также в клетках нормальной кожи.
-
Оценить морфометрические показатели опухолевого роста, особенности показателей динамики опухолевого роста, пролиферации клеток и лимфоцитарной инфильтрации в очагах первичной меланомы при
селективном ингибировании ММП-9 и сочетанием ингибировании ММП-9 и ММП-13.
-
Определить характер экспрессии онко-микроРНК miR-21 и miR-let-7b в клетках меланомы при селективном ингибировании ММП-9 и сочетанном ингибировании ММП-9 и ММП-13 in vivo.
-
Выявить механизмы развития меланомы кожи, ассоциированные с изменениями функционирования ММП-9/13.
Научная новизна:
-
Впервые в клетках меланомы кожи in vivo проведена оценка влияния селективного ингибирования ММП-9 и сочетанного ингибирования ММП-9 и ММП-13 на уровни экспрессии TGF-pi, транскрипционного фактора Twistl, микроРНК miR-21 и miR-let7b, на лимфоцитарную инфильтрацию первичной опухоли, установлено, что селективное ингибирование ММП-9 в клетках меланомы кожи in vivo не оказывает влияния на экспрессию TGF-P и реализацию его эффектов в клетках меланомы, а сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 снижает экспрессию данного фактора роста, а также способствует снижению Twist 1-опосредованных процессов ЭМТ, повышению иммуногенности опухоли за счет увеличения лимфоцитарной инфильтрации первичных опухолевых узлов и снижению экспрессии онко-микроРНК miR-21.
-
Установлено, что при снижении экспрессии TGF-P, посредством сочетанного ингибирования ММП-9 и ММП-13 в клетках меланомы кожи in vivo, не происходит изменений опухолевого роста, клеточной пролиферации, однако снижается уровень экспрессии онкосупрессорной микроРНК miR-let-7b.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные об изменении экспрессии TGF-P и реализации его основных канцерогенных эффектов в клетках меланомы кожи in vivo при ингибировании активности ММП-9 и ММП-13 могут быть использованы для разъяснения патогенеза меланомы кожи, а также учитываться при разработке новых препаратов для лечения меланомы, основанных на нацеленном воздействии на определенные молекулярные мишени.
Положения, выносимые на защиту:
-
Селективное ингибирование ММП-9 в клетках меланомы кожи in vivo не оказывает влияния на экспрессию TGF-P и его эффекты - опухолевый рост первичных опухолевых узлов, клеточную пролиферацию меланомы, процессы ЭМТ, сопряженные с эффектами транскрипционного фактора Twistl, иммуноактивность опухолевых клеток, экспрессию микроРНК.
-
Сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 в клетках меланомы кожи in vivo снижает экспрессию TGF-pi и, таким образом, обусловливает противоопухолевые эффекты - снижение Twist 1-опосредованных процессов ЭМТ, модификацию иммуноактивности меланомы за счет увеличения лимфоцитарной инфильтрации первичных опухолевых узлов, снижение экспрессии онко-микроРНК miR-21, а также
имеет проопухолевый потенциал вследствие снижения экспрессии онкосупрессорной микроРНК miR-let-7b.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедре патологической физиологии им. проф. В.В. Иванова ГБОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого.
Апробация работы. Материалы и результаты исследований доложены и обсуждены на городском этапе «Конкурса научно-технического творчества молодежи», г. Красноярск, 2013г., «Конференции молодых ученых НИИ онкологии имени Н.Н. Петрова», г. Санкт-Петербург, 2014 г. Результаты исследований также представлены в материалах российской научно-практической конференции с международным участием «Новые методы в онкологической практике», г. Барнаул, 2013г., в материалах всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Научно-практические аспекты современной онкологии», г. Красноярск, 2013г., в материалах научно-практической конференции дерматовенерологов и косметологов Центрального федерального округа Российской Федерации «Актуальные вопросы дерматовенерологии, дерматоонкологии и косметологии», г. Москва, 2014 г.
Данная диссертационная работа поддержана грантом российского фонда фундаментальных исследований «Посттранскрипционные механизмы регуляции метастазирования при меланоме кожи» № 13-04-01381, 2013 г., грантом российского научного фонда «Экспрессия и роль микроРНК при меланоме кожи» № 7-15-00074, 2013 г., грантом Красноярского краевого фонда поддержки научной и научно-технической деятельности «Конкурс научно-технического творчества студентов и аспирантов» №11/14, 2014 г., грантом частного благотворительного фонда Михаила Прохорова «Академическая мобильность» 2014 г., на средства которого была осуществлена научная стажировка в исследовательской лаборатории дерматологического отделения университетской клиники г. Хайдельберг, Германия, с целью получения необходимых теоретических и практических навыков овладения современными методами молекулярно-биологических исследований.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России для публикации результатов диссертационных исследований.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 242 работы, из них - 20 отечественных и 222 зарубежных, иллюстрирована 5 таблицами и 23 рисунками.
Сигнальные пути, отвечающие на ММП
ММП - это группа внеклеточных пептидаз, которые участвуют в расщеплении различных компонентов ЭЦМ [Вirkedal-Hansen Н. et al., 1993]. В активном центре данные энзимы содержат ион цинка, поэтому их относят к семейству цинковых металлопротеиназ.
Данная группа ферментов насчитывает около 30 видов ММП, которые, в зависимости от своей относительной субстратной специфичности, делятся на подгруппы, но все члены данного семейства обладают схожими функциями: в обычных условиях (в здоровом организме) содержатся в тканях в незначительных количествах; транскрипция ММП зависит от действия различных факторов, к которым относятся стероидные и тиреоидные гормоны, цитокины, факторы роста, химические агенты, микроРНК и др.; секретируются в виде проферментов, которые могут активироваться вне клетки или на ее поверхности некоторыми протеиназами, в частности и самими ММП; способны расщеплять один или несколько компонентов ЭЦМ, а также могут подвергаться ингибированию специфическими тканевыми ингибиторами [Nagase Н. et al., 2006].
Субстратами для ММП могут служить различные составляющие ЭЦМ, к которым относятся - коллагены, желатин, ламинин, протеогликаны, эластин, а также адгезивные и другие белки соединительной ткани. Благодаря субстратной специфичности, все ММП, субстраты которых определены, можно разделить на 5 больших групп, однако это разделение на группы является весьма произвольным, так как истинные физиологические субстраты для некоторых ММП до сих пор не установлены [Ярмолинская М.И. и др., 2012]. Вместе с тем, выделяют следующие группы ММП: 1) Коллагеназы. Коллагеназы являются наиболее изученной группой ММП. Коллагеназы гидролизуют преимущественно интерстициальные коллагены I, II и III типа. В эту группу входят ММП-1 (коллагеназа-1), ММП-8 (коллагеназа-2), ММП-13 (коллагеназа-3) и ММП-18 (коллагеназа-4), которые являются основными секретируемыми нейтральными пептидазами и играют главную роль в деградации коллагенов ЭЦМ при различных физиологических и патологических процессах. Совсем недавно выяснилось, что коллагеназы могут обладать более широким субстратным разнообразием, чем считалось ранее [Рогова Л.Н., 2011]; 2) Желатиназы. Желатиназы гидролизуют коллаген IV типа. Эта группа состоит из двух протеиназ: ММП-2 (желатиназа А) и ММП-9 (желатиназа В); 3) Стромелизины. Стромелизины гидролизуют протеогликаны. Основными представителями этой группы являются ММП-3 (стромелизин-1) и ММП-10 (стромелизин-2). Кроме этих представителей в эту группу входят несколько других ММП - транзины, протеогликаназа и активатор проколлагеназы. Стромелизины разрушают компоненты базальной мембраны, такие как коллаген IV типа, фибронектин, нидоген, матрилизин, а макрофагальная ММП способна также разрушать эластин; 4) Мембрано-связанные ММП. Ферменты данной группы гидролизуют коллагены, а также способны принимать участие в активации некоторых предшественников ММП. К ним относят 6 ММП мембранного типа: ММП-14, ММП-15, ММП-16, ММП-17, ММП-24, ММП-25, которые обладают свойством локализоваться на поверхности клетки и не секретироваться в среду; 5) Неклассифицируемые ММП. Истинные субстраты для представителей этой группы до конца не определены. К неклассифицируемым ММП относят - матрилизин (ММП-7), стромелизин-3 (ММП-11), металлоэластазу макрофагов (ММР-12) [Fanjul-Fernandez М. et al., 2010].
Регуляция экспрессии ММП возможна на различных уровнях. На транскрипционном уровне, как упоминалось ранее, воздействие на экспрессию ММП могут оказывать факторы роста (эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов, трансформирующие факторы роста), цитокины (фактор некроза опухолей, интерлейкины -1, -6,), нейропептиды, гормоны (мелатонин, глюкокортикоиды, половые гормоны), гепарин [Turco L., 2006]. На посттранскрипционном уровне экспрессию ММП могут регулировать микроРНК [Loffek S. et al, 2011].
ММП синтезируются в виде неактивных проферментов (про-ММП), а затем происходит секреция ММП во внеклеточную среду. Активация ММП вне клетки или на ее поверхности происходит путем протеолитической обработки пре-ММП с высвобождением (формированием) активного центра. Протеолитическую обработку некоторых пре-ММП могут осуществлять активные ММП, а также плазмин и другие протеиназы [Hadler-Olsen Е et al., 2011]. Активацию ММП может индуцировать также и ряд непротеазных воздействий - например, высокая концентрация протонов водорода в окружающей среде, продукты перекисного окисления липидов, высокая температура [SolovievaN.L, 2000].
Также на посттранскрипционном уровне деятельность активированных ММП строго регулируются тканевыми ингибиторами ММП - ТИММП [Murphy G., 2011]. Существует четыре представителя семейства ТИММП: ТИММП-1, -2, -3 и -4, которые способны ингибировать различные ММП с различной эффективностью [Brew К. et al, 2010]. Нормальное функционирование физиологических реакций в ЭКМ обеспечивается строгим равновесием между активностью ММП и их ингибиторов. При нарушении этого равновесия возникают изменения функциональной жизнедеятельности ЭЦМ, ведущие к различным патологиям [Nagase Н. et al., 2006]. ММП, в результате своей деятельности, могут оказывать влияние на высвобождение и активацию хемокинов, цитокинов, факторов роста, антибиотических пептидов и других биологически активных молекул, тем самым участвуя в физиологических процессах, таких как эмбриогенез, морфогенез, ремоделирование тканей, ангиогенез, клеточная миграция и адгезия, рост нейритов, а также могут принимать участие в реализации процессов врожденного и адаптивного иммунитета [Van Lint P. et al., 2007].
При развитии патологии, ММП играют важную роль в процессах, связанных с нарушением регуляции деградации и ремоделирования ЭЦМ, что наблюдается при воспалении, фиброзе, аутоиммунных заболеваниях, язвенной болезни, гипертонической болезни, хронической обструктивной болезни легких, периодонтите [Coussens L.M. et al, 2002; Рогова Л.Н., 2011]. И, несомненно, особо важная роль ММП отведена в канцерогенезе, особенно при развитии опухолевой инвазии и метастазирования [Coussens L.M. et al., 2002; LoffekS. etal, 2011].
Экспериментальные модели для идентификации мишеней ММП
Исследование выполняли на базе ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого».
Эксперимент проводили на лабораторных мышах линии С57В16, полученных из вивария ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук». Перед проведением экспериментальной работы с животными было получено разрешение локального этического комитета и биоэтической комиссии ГБОУ ВПО Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого (№ 44/2012 от 15.11.12). Все исследования проводили в соответствии с требованиями и условиями, изложенными в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» и приказом Минздрава РФ № 708н от 23.08.10 «Об утверждении правил лабораторной практики».
В эксперименте использовали мышей - половозрелых самок линии С57В16 в возрасте 8-10 недель, массой от 19 до 26 г. Животных содержали при естественном режиме освещения со свободным доступом к воде и пище. С57В16 - это инбредная линия мышей, имеющая черный окрас и являющаяся стандартной линией для создания модели меланомы кожи in vivo.
Для создания сингенной модели меланомы использовали клеточную культура меланомы-В16. Культура была любезно предоставлена ФГБНУ «НИИ фундаментальной и клинической иммунологии».
Меланома-В16 является высокометастатической линией, широко используемой для изучения механизмов метастазирования и тестирования различных терапевтических агентов [Аксененко М. Б. и др., 2012]. Использование меланомы-В16 in vivo на мышах линии С57В16 является общепризнанной и широко используемой моделью для оценки эффективности различных методов лечения меланомы кожи [Overwijk W.W. etal.,2001].
Клеточную культуру меланомы-В16 сохраняли методом криоконсервации в жидком азоте.
Для осуществления имплантации, культура была разморожена на водяной бане при t 37С в течение 1 минуты, далее проводили подсчет жизнеспособных опухолевых клеток в камере Горяева. Для этого к 20 мкл взвеси опухолевых клеток добавляли 20 мкл метиленового синего, полученной смесью заполняли камеру Горяева, под микроскопом на увеличении х400 подсчитывали количество жизнеспособных клеток (не окрашенных в синий цвет), затем проводили подсчет жизнеспособных клеток на 1 мл взвеси.
Двум самкам была проведена имплантация опухолевых клеток путем подкожного введения в боковую поверхность живота 0,5 мл взвеси, содержащей 60 000 жизнеспособных клеток, что соответствует минимальной туморогенной дозе на одно животное. На 22-е сутки после имплантации опухоли у мышей при пальпации достигли около 20 мм в диаметре (рис. 3.).
Далее животных подвергли эвтаназии методом цервикальной дислокации под хлороформным наркозом. Проводили вскрытие, выделение опухолевого узла в стерильных условиях, промывание опухоли стерильным раствором питательной среды-199 Medium 199 Modificatum Fluidum (ГНЦ ВБ «Вектор», Россия), освобождение от капсулы, некротических участков. После этого опухолевую ткань гомогенизировали и готовили 10% опухолевую взвесь, путем добавления рассчитанного ранее количества среды 199 (на 1 г опухолевой ткани - 1 мл питательной среды). Трансплантацию опухолевой взвеси лабораторным животным (п=39) проводили путем инъекционного подкожного введения в боковую поверхность туловища приготовленной опухолевой взвеси в количестве 1 мл.
Животным, в количестве п=8, трансплантацию меланомы-В16 не осуществляли, из этих животных была сформирована контрольная группа здоровых животных.
Перевиваемая меланома дала положительный опухолевый рост у 37 животных. Этих животных случайным образом поделили на четыре группы -контрольная группа, не получающая воздействие ингибитором (п=11), подопытная группа №1, животным из которой проводили селективное ингибирование ММП-9 (п=8), подопытная группа №2 (п=8), животным из которой проводили сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13, подопытная группа №3 (п=10), необходимая для оценки исследуемых параметров в динамике опухолевого роста, не получающая терапию ингибитором, но выведенная из эксперимента на 10 суток позднее, чем животные в группе «контроль» и подопытных группах №1, №2.
Исследование морфометрических показателей
Анализ инфильтрации опухолевой ткани лимфоцитами показал статистически значимое увеличение выраженности лимфоцитарной инфильтрации первичных опухолевых узлов, заключающееся в увеличении количества интраопухолевых лимфоцитов, у мышей с сочетанным ингибированием ММП-9 и ММП-13 по сравнению с контрольной группой, р=0,001, а также с группой, животные которой получили воздействие ингибитором в концентрации селективного ингибирования ММП-9, р=0,005 (Рис. 14., Рис. 15.). В группе сочетанного ингибирования ММП-9 и ММП-13 количество интраопухолевых лимфоцитов в 10,0 раз больше, чем в контрольной группе и группе животных, получивших селективное ингибирование ММП-9.
У животных с селективным ингибированием ММП-9 интенсивность лимфоцитарной инфильтрации не имела статистически значимых различий с лимфоцитарной инфильтрацией первичных опухолевых узлов животных из контрольной группы (Рис. 14.).
При оценке лимфоцитарной инфильтрации у животных, не получивших воздействие ингибитором ММП в динамике опухолевого процесса - на 17 сутки и 28 сутки с момента трансплантации опухолевых клеток меланомы, получены следующие результаты: выраженность лимфоцитарной инфильтрации первичных опухолевых узлов была статистически значимо выше у животных, которые были выведены из эксперимента спустя 28 суток после трансплантации меланомы, по сравнению с контрольной группой, животные из которой были выведены из эксперимента через 17 суток после трансплантации опухолевых клеток, р=0,047 (Рис. 16.). -0,5 сут. сут.
За 10 суток опухолевого роста, с 17-х по 28-е сутки с момента трансплантации опухолевых клеток, количество интраопухолевых лимфоцитов статистически значимо увеличилось в 2,8 раза.
Анализируя лимфоцитарную инфильтрацию первичных опухолевых узлов, нами получено, что селективное ингибирование ММП-9 не оказывает влияния на степень выраженности лимфоцитарной инфильтрации первичного опухолевого узла, а сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 эффективно увеличивает инфильтрацию опухолевых узлов лимфоцитами.
Кроме того, нами получено, что в динамике опухолевого процесса лимфоцитарная инфильтрация первичных опухолевых узлов также увеличивается. 3.7. Оценка уровней экспрессии микроРНК miR-21 и miR-let-7b
При сравнении уровней экспрессии микроРНК miR-21 в исследуемых группах выявлено, что у животных, получивших воздействие ингибитором в концентрации, оказывающей сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13, статистически значимо снижается экспрессия данной микроРНК по сравнению с контрольной группой, р=0,005. Кроме того, экспрессия miR-21 в группе сочетанного ингибирования значимо ниже экспрессии данной микроРНК в группе животных с селективным ингибированием ММП-9, р=0,015 (Рис.17.). При этом значимых различий в уровнях экспрессии miR-21 в группе с селективно ингибированной ММП-9 по сравнению с контрольной группой не получено (Рис.17.).
Уровень экспрессии другой исследуемой микроРНК - miR-let-7b также статистически значимо снижается у животных, получивших воздействие ингибитором в концентрации сочетанного ингибирования ММП-9 и ММП-13, по сравнению с контрольной группой, р=0,041, но не имеет статистически значимых различий с уровнем экспрессии данной микроРНК в группе животных, получивших воздействие ингибитором в концентрации селективного ингибирования ММП-9. В свою очередь, уровень экспрессии miR-let-7b в группе селективного ингибирования ММП-9 не имеет статистически значимых различий с уровнем экспрессии данной микроРНК в контрольной группе, но на графике видна тенденция к снижению уровня экспрессии miR-let-7b в группе селективного ингибирования ММП-9 по сравнению с контрольной группой, а значение р приближено к 0,05 и составляет 0,089 (Рис. 18.).
Анализируя экспрессию данных микроРНК в экспериментальных группах, нами получено, что селективное ингибирование ММП-9 не оказывает влияния на экспрессию miR-21 и miR-let-7b. Сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 статистически значимо снижает экспрессию микроРНК miR-21 в 19,3 раз по сравнению с контрольной группой и в 7,3 раз по сравнению с группой селективного ингибирования ММП-9. Сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 также статистически значимо снижает экспрессию микроРНК miR-let-7b в 26,1 раз по сравнению с контрольной группой.
Анализ уровней экспрессии транскрипционного фактора Twistl в клетках меланомы первичных опухолевых узлов у животных в экспериментальных группах показал статистически значимое снижение данного фактора транскрипции в группе с сочетанным ингибированием ММП-9 и ММП-13 по сравнению с контрольной группой, р=0,032, но значимых различий в экспрессии данного фактора транскрипции в группе сочетанного ингибирования ММП-9 и ММП-13 с группой селективного ингибирования ММП-9 не получили (Рис. 19.). Кроме того, не получено статистически значимых различий в экспрессии Twistl у животных, получивших воздействие ингибитором в концентрации селективного ингибирования ММП-9, по сравнению с экспрессией Twistl в клетках меланомы у животных контрольной группы, но имеется отчетливая тенденция к снижению данного фактора транскрипции в клетках меланомы первичных опухолевых узлов группы селективного ингибирования ММП-9 (Рис. 19.).
Резюмируя полученные данные, можно сделать вывод, что селективное ингибирование ММП-9 на модели меланомы кожи in vivo не оказывает статистически значимого влияния на экспрессию транскрипционного фактора Twistl в клетках меланомы кожи, а сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 статистически значимо эффективно снижает экспрессию данного фактора транскрипции в 12,9 раз по сравнению с уровнем экспрессии Twistl в клетках меланомы у животных контрольной группы.
В динамике опухолевого роста, на 28-е сутки после трансплантации опухолевых клеток по сравнению с 17-ми, уровень экспрессии транскрипционного фактора Twistl значимо не меняется. В коже здоровых мышей уровень экспрессии данного фактора транскрипции статистически значимо выше в 451,3 раза, чем в опухолевых клетках меланомы В-16.
Оценка морфометрических показателей первичных опухолевых узлов при вскрытии
Есть исследования о TGF-P, как о медиаторе ЭМТ, которая играет важную роль в инициации метастазирования, в том числе и при меланоме кожи [Bottinger Е. P. et al, 2002; Fang R. et al, 2013].
Например, в работе, посвященной исследованию нефросклероза на культуре тубулярных клеток, показано, что TGF-P способен вызывать трансформацию этих клеток в миофибробласты, а нейтрализующие антитела к TGF-P предотвращают этот процесс [Fan J.M. et al, 1999]. Также, в работе по исследованию триггерного эффекта на процессы ЭМТ различных цитокинов in vitro, показано, что экспрессия мезенхимальных маркеров, изменение клеточной подвижности, синтез ММП усиливались под влиянием некоторых других цитокинов, однако наиболее выраженный эффект в активации процесса ЭМТ оказывал TGF-P [OkadaH. et al, 1997].
ЭМТ, как нами уже упоминалось ранее, это сложный процесс изменения клетками эпителиального фенотипа на мезенхимальный, происходящий при эмбриональном развитии, заживлении ран, а также при патологических процессах - например, при фиброзе, опухолевой прогрессии [Guarino M., 2007]. Важная роль отведена процессам ЭМТ в инициации метастазирования [Brabletz Т., 2012]. TGF-P способен стимулировать морфогенетические изменения, которые осуществляются в качестве трансдифференциации, или ЭМТ [Dumont N. et al, 2003; Miyazono К., 2009]. Во время этих процессов происходит снижение экспрессии гена белка Е-кадгерина, участвующего в образовании плотных контактов между клетками, а также увеличение экспрессии генов, ответственных за мезенхимальный фенотип клеток, усиление клеточной подвижности вследствие активации сигнальных путей, приводящих к реорганизации цитоскелета, повышение экспрессии генов, кодирующих ММП [Valcourt U. et al, 2005]. Несмотря на то, что клетки меланомы кожи не имеют эпителиального происхождения, они экспрессируют эпителиальный Е-кадгерин, необходимый для их корректных взаимодействий с базальными слоями эпидермиса [Robert G. et al., 2006]. При меланоме кожи утрата экспрессии Е-кадгерина является также важным изменением, необходимым для начала инвазивных процессов в опухолевой ткани [Herlyn М. et al, 2000].
Таким образом, вновь наблюдается способность ММП вступать в аутокринную петлю регуляции экспрессии и реализации эффектов TGF-P в отношении процессов ЭМТ при меланоме кожи (Рис. 23.)
ЭМТ, под воздействием фактора роста TGF-pi, опосредуется как через SMAD-зависимые так и через SMAD-независимые пути передачи сигнала: через МАПК р38, ERK и JNK [Bakin A.V. et al, 2000; Barcellos-Hoff М.Н. et al, 2009; Biswas S. et al, 2007]. Результатом активации перечисленных сигнальных путей является индукция факторов транскрипции семейства ZEB1, ZEB2, Snail, Slug, Twist, которые связываются с промоторами генов, ответственных за экспрессию Е-кадгерина, а также других белков мезенхимального фенотипа клеток, что приводит к процессам ЭМТ [Kondo М. et al., 2004; Shirakihara Т. et al., 2007]. В качестве основного регулятора ЭМТ выступает транскрипционный фактор Twist 1 [Xiu-lan Z. et al., 2011]. Поэтому, для оценки эффектов снижения активации TGF-P-пути сигнальной трансдукции на процессы ЭМТ в экспериментальных группах, нами анализировались уровни экспрессии транскрипционного фактора Twist 1. Нами получено, что в группе селективного ингибирования ММП-9 уровень экспрессии Twist 1 в клетках меланомы не имеет значимых различий с экспрессией Twist 1 в контрольной группе, однако в группе сочетанного ингибирования ММП-9 и ММП-13 экспрессия данного фактора транскрипции значимо ниже, чем в контрольной группе в 12,9 раз. В нашем эксперименте изменения экспрессии Twist 1 в исследуемых группах ведут себя сходно с изменениями экспрессии TGF-pi. Таким образом, отсутствие изменения экспрессии Twist 1 в группе селективного ингибирования ММП-9 мы связываем с отсутствием снижения активации TGF-P-пути, а в группе сочетанного ингибирования ММП-9 и ММП-13 снижение экспрессии Twist 1 объясняется снижением активации TGF-P-пути сигнальной трансдукции. Показано, что при гепатоцеллюлярной карциноме активация TGF-P-пути сигнальной трансдукции в опухолевой ткани строго взаимосвязана с экспрессией транскрипционного фактора Twistl [Chanmee Т. et al., 2014]. Однако при проверке корреляций между данными параметрами при меланоме в нашем исследовании, оказалось, что данные параметры не имеют статистически значимой корреляционной взаимосвязи. Уровень экспрессии Twistl, как и уровень экспрессии TGF-pi, был также проанализирован нами в динамике опухолевого роста меланомы у мышей, не получивших воздействие ингибитором ММП, на 17-е и 28-е сутки с момента трансплантации опухолевых клеток соответственно. Экспрессия Twistl за этот период статистически значимо не изменилась, что также указывает не только на устойчивость работы TGF-P-пути сигнальной трансдукции, но и устойчивость реализации эффектов активации данного пути в отношении процессов ЭМТ в динамике опухолевого роста.
Прогрессии меланомы могут способствовать также паракринные механизмы, обеспечивающие регуляцию опухолевого микроокружения продуцируемыми опухолевыми клетками и иммуноцитами воспалительного инфильтрата стромы цитокинами, в том числе TGF-pi. В основе иммуносупрессорного действия TGF-pi лежит способность индуцировать регуляторные Т-клетки, ингибировать антиген-индуцированную пролиферацию покоящихся Т-клеток и эффекторные функции активированных антиген-специфичных Т-клеток [Bollard СМ. et al., 2002].
В дополнение к своим действиям на Т-клетки, TGF-P способен ингибировать эффекторные функции макрофагов, В-клеток, нейтрофилов, натуральных киллеров, противодействуя эффектам других активирующих факторов [Jakowlew S.B., 2008].
Источником TGF-P в опухоли могут быть не только опухолевые клетки. Например, при лимфоме Ходжкина значительная часть стромальных клеток, включая Т-лимфоциты, секретируют TGF-P [Lopez М. et al., 2006]. Показано, что TGF-P, продуцируемый как опухолевыми клетками, так и стромальными элементами, принимает участие в регуляции функционирования Т-эффекторных клеток через различные механизмы. Например, ингибируя экзоцитоз литических гранул и экспрессию гамма-интерферона и перфорина [Ahmadzadeh М. et al, 2005; Mempel T.R. et al., 2006], снижая продукцию гамма-интерферона натуральными киллерами, которая необходима для стимуляции противоопухолевого иммунного ответа Т-хелперами [Castriconi R. et al, 2003], а также, воздействуя на дендритные клетки, TGF-P ингибирует экспрессию молекул гистосовместимости второго класса, молекул CD80, CD86, CD40, продукцию интерлейкинов, фактора некроза опухоли-альфа, что приводит к нарушению процессов дифференцировки и активации Т-лимфоцитов [LarmonierN. et al., 2007].