Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Данные литературы 11
1.1. Концепции морфогенеза 11
1.1.2. Роль молекулярно-генетических взаимодействий в морфогенезе 36
1.1.3. Роль иммуноцитов в физиологической и репаративной регенерации 42
1.2. Современные представления о механизмах морфогенеза глаза человека 51
1.2.1. Апоптоз в сетчатке 51
1.2.2. Механизмы нарушений морфогенеза в глазу человека 57
Глава 2. Материалы и методы исследования 81
2.1. Клиническая характеристика материала 81
2.2. Морфологические методы исследования
2.2.1. Метод окрашивания гематоксилин-эозином 83
2.2.2. Метод Ван-Гизона .84
2.3. Импрегнационные методики:
2.3.1. Импрегнация серебром по Кахалю 84
2.3.2. Импрегнация осмием по Гольджи 86
2.4. Иммунная гистохимия 86
2.5. Морфометрия .93
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 94
3.1 I этап закладки структур мозга и глаза, начиная с 3-х недель
эмбрионального развития .94
3.1.1. Эктомезенхима 94
3. 1.2. Нервная трубка 99
3. 1.3. Глазной пузырк 101
3.2 II этап миграции клеток, дифференцировки, формирование структур глазного бокала .103
3. 2.1. Прозрачные среды глаза 103
3.2.2. Роговица 106
3.2.3. Хрусталик, сосудистая капсула .114
3.2.4. Стекловидное тело мезенхимное и сосудистое 123
3.2.5. Фиброзная (склера и роговица) и сосудистая оболочки 124
3.2.6. Сетчатка 128
3.3 III этап обособление и специализация структур 130
3.3.1. Структуризация роговицы и склеры 130
3.3.2. Формирование хориоидеи, цилиарного тела и радужки 132
3.3.3. Инволюция сосудистого стекловидного тела 136
3.3.4. Инволюция капсулы хрусталика 139
3.3.5. Формирование слов сетчатки 139
Заключение .142
Список сокращений 154
Список литературы
- Роль молекулярно-генетических взаимодействий в морфогенезе
- Метод окрашивания гематоксилин-эозином
- Нервная трубка
- Формирование хориоидеи, цилиарного тела и радужки
Роль молекулярно-генетических взаимодействий в морфогенезе
Молекулярно-генетическая гипотеза развития глаза, базирующаяся на том, что PDZ домен-содержащие белки являются критическими факторами в регуляции роста и дифференцировки клеток хрусталиковых волокон, обосновывается тем, что Dlg-1, Scrib, и многочисленные другие PDZ белки экспрессируются по всему глазному пузырьку (Nguyen et al., 2003). Dlg-1 и Scrib солокализуются друг с другом и белками клеточной адгезии E-cadherin, N-cadherin и апикальным белком ZO-1 (Nguyen et al., 2005). Dlg-1 концентрируется на высоком уровне в апикальной области клеток хрусталиковых волокон, как и N-cadherin (Nguyen et al., 2005), где располагаются zonula adherens (Lo et al., 2000; Zampighi et al., 2000) и на базальных кончиках клеток хрусталиковых волокон (Nguyen et al., 2005), где обнаруживается базальный мембранный комплекс (Bassnett et al., 1999). Однако, искусственное выращивание хрусталика из материала плакоды в присутствии только гуморальных влияний, оказалось невозможным. Детальный анализ достижений молекулярно-клеточной биологии в развитии органа зрения и его отдельных структур показал, как далеко шагнула молекулярная генетика, а также то, что все результаты касаются преимущественно либо выделенных клеточных культур, либо получены в экспериментах на низших позвоночных [279]. Выяснение и расшифровка участия различных генов, их репрессии и экспрессии, влияющие на развитие структур глаза, далеко не способны объяснить все индуцированные и ингибированные клеточные взаимодействия в развивающемся глазу, не решают вопроса источников развития хрусталика, многообразия клинических форм и патогенеза врожднных и приобретенных катаракт. Гениальный постулат К. Бэра о том, что только на самых ранних этапах онтогенеза человек в свом развитии подобен развивающимся представителям низших ступенек эволюции, ещ раз проявляется на примере развития глаза человека [95]. Таким образом, в геноме организмов содержится информация о развитии особи определенного вида и, кроме того, присутствуют гены, экспрессия которых может привести к формированию конкретных зародышевых листков, органов, тканей. В генотипе зиготы содержатся также аллели родителей, обладающие возможностью реализоваться в определенные признаки. Однако известно, что разно уровневая регуляция экспрессии генов приводит к тому, что результатом активности даже одних и тех же генов могут быть совершенно разные наборы конечных продуктов и, как следствие, множественность возможных путей развития [121].
В филогенезе хрусталик проходит сложный путь развития и совершенствования, от полного отсутствия в глазах некоторых представителей низших ступеней эволюции, до сложной морфофункциональной системы клеток у позвоночных. В большинстве случаев источником развития хрусталика является эктодерма, но у некоторых представителей филогенетической лестницы в формировании хрусталика участвуют клетки стекловидного тела, представляющие собой видоизменение хитинородного покрова [54]. Между зачатками глаза, пространственно связанными между собой, возникают морфогенетические корреляции, основанные либо на феномене эмбриональной индукции, либо на общности закладок структур глаза. Так, глазной бокал, являющийся выростом переднего мозга, обеспечивает формирование хрусталика при морфогенезе глаза [128].
Каким же образом активность отдельных генов, генных комплексов и генных каскадов может определить из каких именно клеток, в каком месте и в какой конкретной форме разовьется тот или иной орган? Этот вопрос становится еще более интригующим, если учесть такое наблюдаемое в онтогенезе явление, как перекрывание программ развития [105]. Оно подразумевает, что в самую начальную фазу клеточной дифференцировки включается с разной степенью эффективности несколько разных программ развития, еще не дающих однозначного решения конечной клеточной судьбы. Например, в дифференцирующемся в катехоламин-эргическом направлении нейробласте происходит не только синтез мРНК для образования компонентов катехоламинэргической системы, но и существенно более слабый синтез и(м)РНК для компонентов холинэргической системы. Если в определенный момент развития сменить иннервируемую данной клеткой катехоламинэргическую мишень на холинэргическую, то активируется синтез «холинэргических» РНК, а продукция «катехоламинэргических» начнет тормозиться. В результате произойдет изменение пути развития клетки – трансдетерминация [127]. Несмотря на возможность изменений, в ходе эмбриогенеза реализуются строго упорядоченные морфогенетические процессы, и с очень высокой пространственной точностью формируется организм конкретного вида, обладающий определенной структурой и значительно более богатой информацией, чем генетическая информация зиготы. Очевидно, что реализация морфогенеза не определяется только функционированием генетического материала [55].
Метод окрашивания гематоксилин-эозином
Ко второй группе относятся СПИД, болезнь Альцгеймера и Паркинсона, синдром Дауна, анемия, инфаркты и инсульты, лучевая болезнь [27, 68, 73, 82 ]. Koeva Y.A., Sivkov S.T., Grozlekova L.S. (2015) относят шизофрению к группе заболеваний мозга, в патогенезе которых одно из ключевых мест занимает апоптоз [244]. Также известно, что диабет у матери и прим противосудорожных препаратов во время беременности приводят к гипоплазии зрительного нерва. Патогенез заключается в растяжении сетчатки и разрежении пигментного эпителия в области кольца склеры в месте е соединения с рештчатой пластинкой [137]. Развивающиеся ганглионарные клетки сетчатки могут быть подвергнуты ретроградной дегенерации в плодный период, происходит остановка дифференцировки клеток, отсутствие формирующихся отростков [137]. Имеются предположения о ретроградной дегенерации аксонов при дисплазии хиазмы в определнные сроки развития, в связи с чем, образуется значительно меньшее количество ткани зрительного нерва, чем может вместить склеральное кольцо. Несмотря на данную аномалию, глаз в целом имеет нормальное строение [239]. С помощью электронной микроскопии установлены сочетанные пороки развития ЦНС с аплазией зрительного нерва и хиазмы [38, 72]. Отмечено наличие недифференцированных ганглионаров без признаков образования выростов, формирующих аксоны, при этом отмечено уменьшение межклеточных пространств, что имеет важное значение для формирования путей роста аксонов [74]. Пигментная макулодистрофия также является результатом нарушения механизмов апоптоза в сетчатке [337]. К этой группе патологий апоптоза можно отнести нарушение морфогенеза хрусталика, развития сосудистого стекловидного тела, обратное развитие зрачковой мембраны, сосудистой капсулы хрусталика, а также формирования дренажной зоны угла глаза [157]. В целом можно представить огромный перечень заболеваний зрительной системы, связанных с нарушением программы гибели клеток, ещ большее количество представляет патология, связанная с нарушением механизмов апоптоза в нервной ткани [321].
Существует мнение, что роль апоптоза в эволюции заключается в регуляции численности клеток и установлению определнных взаимоотношений между отдельными клетками в целостном организме [145, 174]. Апоптоз может быть включн множеством внутренних и внешних факторов, или сигналов и направлен на освобождение от старых или наработанных в избытке клеток, а также от клеток с нарушениями дифференцировки и повреждением генетического вещества, в том числе и при вирусном заражении. Апоптоз - активная само деструкция (а не дистрофия, как перед некрозом) клеток без характерной для некроза воспалительной реакции [9].
Морфологические признаки апоптоза достаточно изучены, заключаются в сморщивании клеток, конденсации и фрагментации ядра, разрушении цитоскелета, и буллзном выпячивании клеточной мембраны [216]. Отмечена особенность апоптоза: умирающая клетка сохраняет целостность своей мембраны до полного завершения процесса, и только после этого разрушение е оболочки является пусковым сигналом для расположенных вблизи фагоцитов к поглощению оставшихся фрагментов и завершению процессов клеточной деградации [304]. Окончание процесса характеризуется тем, что разрушающиеся клетки, не подвергшиеся немедленному фагоцитозу, превращаются в мелкие, связанные с мембраной фрагменты, называемые апоптическими телами [202]. Также для апоптоза характерно то, что фагоцитоз апоптозирующих клеток происходит без развития воспалительной реакции и замещения утраченных клеток соединительной тканью [115]. Апоптоз не только по морфологическим признакам существенно отличается от некроза, но и имеет ряд специфических особенностей [2, 16, 54]. Факторами, инициирующими апоптоз, являются возрастание экспрессии генов - индукторов апоптоза (или угнетение генов-ингибиторов) либо повышенное поступление кальция внутрь клетки [75]. Клеточная мембрана при этом остается сохранной. Несмотря на внешнюю сохранность мембраны митохондрий, нарушаются окислительно восстановительные процессы в основном за счет блокирования 1 митохондриального комплекса [26]. Результатом описанных выше процессов является возрастание синтеза протеаз, которые начинают постепенно расщеплять внутриклеточные структуры. От мембраны клетки отщепляются небольшие везикулы, наполненные содержимым цитоплазмы (митохондрий, рибосомы и др.), окруженные мембранным липидным бислоем. Клетка, соответственно, уменьшается в объеме и сморщивается. Отщепившиеся везикулы поглощаются соседними клетками. Ядро сморщивается на завершающих стадиях процесса, хроматин частично конденсируется, что говорит о сохранной активности ряда участков ДНК. Оставшиеся от клетки элементы фагоцитируются тканевыми макрофагами без развития воспалительной реакции и формирования соединительной ткани [57]. Конечное дифференцирование, по мнению ряда авторов, является, по-видимому, одной из форм апоптоза [220].
Нервная трубка
Парафиновые срезы толщиной 5 мкм монтировали на стекла, предварительно обработанные в течение 5 минут 0,01% раствором поли-л лизина (Poly-l-Lizine solution 0/01%, Sigma USA) и высушенные в термостате при 56 С в течение часа. После стандартной процедуры депарафинирования в толуолах и спиртах, срезы для восстановления антигенной структуры, подвергали термической обработке в специальном растворе (Target Retrieval Solution, DAKO, Denmark) на водяной бане при температуре 95-97С в течение 30 минут. Затем стекла охлаждали до комнатной температуры, промывали 5 минут 3% раствором перекиси водорода для подавления эндогенной пероксидазы, после чего промывали в 3-х сменах 0,02 М фосфатного буфера рН 7,5 по 5 минут в каждой. После этого наносили первичные антитела к белку Ki-67 (DAKO, Denmark), инкубировали в течение 30 минут во влажной камере в термостате при 37Со, промывали в 3 х сменах 0,02 М фосфатного буфера рН 7,5 по 5 минут в каждой. Наносили стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена (Streptavidin Peroxidase Conjugated, DAKO, Denmark). Интенсивность окрашивания контролировали под микроскопом (инкубировали с ДАБом в течение 3-5 минут). После появления коричневого окрашивания ядер срезы промывали в дистиллированной воде 5 минут, докрашивали гематоксилином, заключали в бальзам. В результате обработки препаратов выявляются ядра пролиферирующих клеток, находящихся в S-периоде, когда наблюдается максимум синтеза белка гена Ki-67, коррелирующего с концентрацией ДНК.
Все статистические данные получены с помощью компьютерного программного обеспечения микроскопа Olympus BX51и цифровой камеры CD25 фирмы Olympus. На препаратах определяли соотношение фибробластов и фиброцитов в соединительнотканных элементах угла глаза, их количество. Определяли размеры и высоту эндотелия ШК. Также оценивалось качественное состояние соединительной ткани и те изменения, которые развиваются в ней при глаукоме. Количественные данные обрабатывали методом вариационной статистики по Катинас. Определяли среднюю арифметическую (Х), стандартную ошибку среднего арифметического (Sx), среднеквадратическое отклонение q и уровень значимости по Стьюденту. Замеры параметров производили с помощью компьютерной морфометрической программы фирмы Olympus при увеличении объектива 40. Значение каждого показателя вычисляли не менее чем в 20 полях зрения. Все данные обрабатывали на компьютере IBM ПС 486 в операционных средах Windows 95 с помощью приложения Exell 7,0 и программы Statistica for Windows. ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. I этап закладки структур мозга и глаза, начиная с 3-х недель эмбрионального развития. 1.1. Особенности эктомезенхимы на головном конце эмбриона человека в период закладки глазного пузырька. Глазные ямки в виде двух углублений на дорсальной поверхности медуллярной пластинки появляются на 2-й неделе эмбриональной жизни, когда мозговая трубка еще не замкнута. На вентральной стороне им соответствует выпячивание. В процессе замыкания мозговой трубки ямки перемещаются, постепенно принимают боковое направление. Эта стадия носит название первичного глазного пузырька (рис. 1, 2).
Эмбрион человека 3-х недель пренатального онтогенеза на стадии 10 сомитов. Стенка глазного пузырька в составе переднего мозгового пузыря. 1-эктодерма; 2-эктомезенхима, 3 – нервная трубка, 4 – иммуноцит. Иммунная гистохимия. Локализация иммуноцитов CD68. Микрофото. Ув.х100. На 3-й неделе эмбрионального развития, когда весь зародыш представляет собой скопление еще недифференцированных клеток, окруженных одним, а затем двумя слоями наружной эктодермы, на поверхности эктодермы и в области между головным концом нервной трубки и эктодермой идентифицируются CD68 и CD163 клетки (рис. 3).
Эмбрион человека 3-х недель пренатального онтогенеза (длина 3,5мм; головной конец-2,5 мм). Передняя стенка первичного глазного пузырька. Иммунная гистохимия на выявление локализации CD68 (а, б) и CD163 (в, г). Микрофото. Ув. х400. 1 – эктодерма, 2 – эктомезенхима, 3 – нервная трубка, 4 – CD68, 5 – CD163.
Нами отмечено, что на этом этапе в составе стенки нервной трубки идентифицируются клетки, содержащие в цитоплазме мембранные структуры с рецепторами на маркер CD68, но на этом этапе на всм протяжении нервной трубки клетки, маркирующиеся CD163, не выявляются, хотя иммуногистохимическая метка с локализацией в эктомезенхиме уже идентифицируется (рис. 4).
Эмбрион человека 3-х недель пренатального онтогенеза (длина- 3,5мм; головной конец-2,5 мм). Передняя стенка первичного глазного пузырька. Иммунная гистохимия на выявление локализации CD68 (а, б, в) и CD163 (г, д, е – маркер выявляется только в эктомезенхиме, в нервной трубке отсутствуют клетки с маркером CD163). Микрофото. Ув. х400. 1- эктодерма, 2 –идентифицируются мегалобласты, располагающиеся вблизи нервная трубка, 3 – эктомезенхима, 4 – CD68, 5 – CD163. Уже не только в составе эктодермального пласта, но и в нервном гребне формирующихся капилляров. В эктодерме и нервном гребне идентифицируются клетки, несущие маркеры CD68, что свидетельствует о функциональной неоднородности клеток эктодермы и нервного гребня и доказывает реализацию клеточного иммунитета на самых ранних этапах развития человека. Слабая интенсивность проявления маркера наблюдается и в нервной ткани, что связано с дифференцировкой клеток, обладающих фагоцитарной активностью.
В эктомезенхиме, прилежащей к нервной трубке, появляются кровеносные сосуды, в которых располагаются мегалобласты, с различной степенью базофилии ядер, с оксифильной цитоплазмой, круглой формы. В некоторых мегалобластах идентифицируются ядрышки, в количестве от 4-х до 7 (рис.
Эмбрион человека конца 3-й недели пренатального онтогенеза (длина- 3,5мм; головной конец-3,0 мм). Передняя стенка первичного глазного пузыря. Иммунная гистохимия на выявление локализации CD68 (а, б) и CD163 (в, г). Выявляются за пределами кровеносных сосудов. Идентифицируется кровеносный сосуд, заполненный мегалобластами. Микрофото. Ув. х400. 1- нервная трубка, 2 - кровеносный сосуд, 3 -мегалобласт, 4 - эктомезенхима, 5 - CD68, 6 - CD163. На поверхности и в цитоплазме мегалобластов локализация CD68, CD163 не наблюдается, метки локализуются исключительно в эктомезенхимоцитах. (рис. 5 б, в, г). Таким образом, отмечаются отличия в локализации клеток CD68, CD163, выявляющихся в эктомезенхиме, но в составе нервной трубки на этапе закладки глазного пузырька присутствуют только CD68. Маркирующиеся клетки в эктомезенхиме и в нервной трубке не являются производными мегалобластов, так как выявляются в дососудистый период. По мере формирования кровеносных сосудов в эктомезенхиме, иммуногистохимическое фенотипирование показало, что фенотипы клеток CD68 и CD163 отличаются от мегалобластов, не несущих на этом этапе рецепторов к этим маркерам. Анализ динамики содержания фенотипов клеток CD68 и CD163 в эктомезенхиме головного конца эмбриона показал, что в зоне формирования глазного пузырька их содержание выше по сравнению с граничащими с пузырьком отделами, особенно в зоне, граничащей с нейральной пластинкой переднего мозга (табл. 6, диаграмма 1).
Формирование хориоидеи, цилиарного тела и радужки
В каскаде индукций, приводящих к образованию глаза, хорда индуцирует возникновение нервной трубки, а затем вызывает е выпячивание, под влиянием клеток фенотипов CD68 и CD163 совместно инициируют формирование глазного пузыря – и позже в результате контакта с эктодермой инструктируют ее клетки к превращению в капсулярный хрусталиковый эпителий. В свою очередь хрусталик инструктирует образование переднего эпителия роговицы из эктодермы, которая располагается непосредственно над ним. Экспрессия и репрессия генов в клетках происходит под воздействием сигнальных молекул макрофагов, что ранее было показано только на клеточных моделях в пробирке с демонстрацией дифференцировки клеток только в присутствии макрофагов.
Идентификация в составе нервной пластинки части клеток с принадлежностью к фенотипу CD68 может говорить о локализации маркеров в эктомезенхимоцитах, в большинстве дифференцирующихся в спонгиобласты, и впоследствии получающих программу развития в направлении нейроглии и нейронов. При этом нами отмечено, что гемоцитобласты на данном этапе не несут маркеров CD68 и CD163. Это свидетельствует не только о неоднородности эктомезенхимы на 3-й неделе эмбриогенеза, но и о том, что первые клетки с CD68 функцией появляются раньше мезенхимоцитов мезодермального происхождения, также обладающих этими особенностями. Являясь производными эктодермы, они, по нашему мнению, на этапе интенсивной пролиферации необходимы, как источник сигнальных молекул, индуцирующих определнные морфогенетические процессы, что находится в рамках современных концепций морфогенеза.
Клетки-предшественники нервных складок мультипотентны и способны формировать разнообразные производные эктодермы, включая клетки эктодермы, нервного гребня и нервной трубки. Поведение этих клеток определяется взаимодействием нервной пластинки и эпидермиса в присутствии цитокинов макрофагов. Клетки нервного гребня играют важную роль в развитии глаза, поскольку являются предшественниками основных его структур, включая строму роговицы и радужки, ресничную мышцу, хориоидею, склеру, костную и хрящевую ткань орбиты. Известно, что эти звздчатые клетки мигрируют под поверхностной эктодермой в пределах всего эмбриона, окружая также область развивающихся зрительных ямок. В области будущего мозга и зачатков глаз мезодерма отсутствует, но, некоторые авторы, руководствуясь данными по морфогенезу в онтогенезе животных, считают наличие в головном конце мезодермы доказанным и проксимальные мезодермальные сегменты называют сомитомерами, а расположенные каудально - сомитами. По этим данным, сомитомеры дают начало миобластам экстраокулярных мышц, сосудистому эндотелию внутри и вокруг глаза. Но, в отличие от туловища и конечностей, современными методами исследования доказано, что кости орбиты и соединительная ткань глазного яблока происходят из клеток нервного гребня, а не мезодермы.
В процессе эмбрионального развития человека зачатки глаз в виде пузырьков появляются в конце 3-й недели у плода, размерами 1,5-3,5 мм, при этом уже в этом периоде в закладках структур глаза выявляются CD позитивные клетки, производные эктомезенхимы. В гемоцитобластах позитивность отсутствует, что свидетельствует не только об их различных функциях на этом этапе, но и происхождении эффекторных клеток иммунофагоцитарного звена клеточного иммунитета. Функции обеспечения клеточного иммунитета и антигенпрезентации на этом этапе выполняют эктомезенхимные клетки, происходящие из нервного гребня.
Учитывая свойства CD68, как кластера дифференцировки 68, макросиалина, и гликопротеина из семейства LAMP, экспрессированного на поверхности моноцитов и макрофагов и используемого в качестве маркра макрофагов, можно предположить, что клетки эктомезенхимы на этом этапе развития эмбриона обладают свойствами макрофагов, способны мигрировать для выполнения контроля за пролиферацией и миграцией клеток структур развивающегося глаза, а также быть источником сигнальных молекул для экспрессии и репрессии геномных перестроек в окружающих тканях.
Следует отметить, что в участках с высокой пролиферативной активностью клеток клетки с фенотипами CD68 и CD163 отсутствуют, что косвенно подтверждает их главную роль на этом этапе в подаче сигнальных молекул именно для дифференцирующихся клеток, для появления различных свойств в клетках закладывающихся тканей.
На этом этапе происходит миграция прекурсорных стволовых клеток нейроглии, выселяющихся в направлении закладки прозрачных структур глаза человека: роговицы, заднего сектора хрусталика и стекловидного тела. Миграция, по нашему мнению, также происходит под влиянием клеток фенотипов CD, что наблюдается и в клеточных культурах. По данным литературы, в роговице, хрусталике, стекловидном теле, сетчатке и ткани мозга присутствуют клетки, способные вырабатывать кристаллины, обеспечивающие физиологическую прозрачность структур, а, возможно, участвующие в физиологических процессах и зрительных функциях, проведением возбуждения, что на современном этапе пока не имеет объяснения, но предполагается некоторыми авторами.