Содержание к диссертации
Введение
3.Обзор литературных данных 13
3.1 Волосяной фолликул 13
3.2 Клетки дермальной папиллы в контексте дермы 20
3.3 Особенности клеток дермальной папиллы 26
3.4 Моделирование фолликулярных взаимодействий в культуре 32
4.Материалы и методы 36
4.1. Клеточные культуры 36
4.1.1 Первичные клеточные культуры человека 36
4.1.1.1 Выделение и культивирование клеток дермальной папиллы 36
4.1.1.2 Выделение и культивирование кератиноцитов 36
4.1.1.3 Выделение и культивирование дермальных фибробластов 37
4.1.1.4 Культивирование фибробластов легкого 37
4.1.2 Первичная культура клеток мыши 37
4.1.2.1Выделение и культивирование клеток дермальной папиллы вибрисс мыши 38
4.1.2.2Выделение и культивирование дермальных фибробластов мыши 38
4.1.3 Культивирование стабильных клеточных линий 38
4.1.3.1Культивирование Mcf7 38
4.1.3.2 Культивирование ИПСК 39
4.2. Лентивирусная трансфекция 39
4.3. Совместное культивирование 39
4.3.1 Кокультивирование клеток кератиноцитов с клетками дермальной папиллы или дермальными фибробластами на пластике 39
4.3.2 Кокультивирование кератиноцитов и клеток дермальной папиллы в системе TransWell 39
4.3.3 Получение агрегатов 40
4.3.4 Совместное культивирование клеток линии Mcf7 с клетками дермальной папиллы или дермальными фибробластами 40
4.4. Культивирование с добавлением факторов роста, цитокинов и специализированного матрикса 41
4.5. Культивирование в гелеобразных матриксах 42
4.5.1 Культивирование в коллагеновом геле 42
4.5.2 Культивирование в гиалуроновой кислоте 42
4.5.3 Культивирование в гидрогеле 42
4.6. Культивирование клеток в провоспалительных условиях 42
4.7. Дифференцировка плюрипотентных клеток в направлении дермальной папиллы 43
4.8. Определение активности щелочной фосфатазы 43
4.9. Иммунохимическое окрашивание 44
4.10. Выделение РНК, обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени 47
4.11. Обработка фотографий и статистика 49
5.Результаты и обсуждение 50
5.1 Совместное культивирование клеток дермальной папиллы и кератиноцитов в двумерных условиях 50
5.2 Совместное культивирование клеток дермальной папиллы и кератиноцитов в трехмерной системе 53
5.3 Миграция клеток дермальной папиллы в контексте взаимодействия с кератиноцитами 60
5.4 Совместное культивирование Mcf7 и клеток дермы 63
5.5 Экспрессия специфических маркеров в смешанных агрегатах 65
5.6 Влияние индуцирующих свойств клеток дермальной папиллы на формирование смешанных агрегатов 67
5.7 Сохранение индуцирующих свойств клеток дермальной папиллы 69
5.8 Культивирование смешанных агрегатов в гелеобразном субстрате 76
5.9 Определение способности клеток дермальной папиллы и дермальных фибробластов к активации в провоспалительных условиях 79
5.10 Получение клеток дермальной папиллы из плюрипотентных клеток 84
6. Заключение 88
7.Выводы 93
8.Список используемых сокращений 94
9. Список цитируемой литературы 95
- Особенности клеток дермальной папиллы
- Совместное культивирование клеток дермальной папиллы и кератиноцитов в трехмерной системе
- Сохранение индуцирующих свойств клеток дермальной папиллы
- Определение способности клеток дермальной папиллы и дермальных фибробластов к активации в провоспалительных условиях
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Реконструкция тканевых и органных эквивалентов имеет немаловажное
значение для изучения процессов дифференцировки, регенерации и
взаимодействия между разными клеточными типами. Кроме того, получение
гетеротипических органных моделей in vitro имеет большой потенциал в тканевой
инженерии, для заместительной терапии, в моделировании заболеваний,
токсикологических исследованиях, разработке лекарственных препаратов. В
контексте последних открытий современной науки и медицины этот подход
становится все более актуальным, однако он значительно ограничен в клеточных
источниках: большая часть модельных систем разработана для клеток с высоким
потенциалом дифференцировки - эмбриональных или фетальных. Для человека
доступ к данным клеточным источникам затруднен. Подобные проблемы
возникают при реконструкции зачатков эпителио-мезенхимных органов, таких как
волосяные фолликулы (ВФ), зубы, молочные железы и др. Реконструкция ВФ в
культуре является наиболее перспективным направлением для таких
исследований, поскольку ВФ обладает высоким регенеративным потенциалом
благодаря мезенхимному компоненту – дермальной папилле (ДП) – обладающему
малодифференцированным статусом и высокой паракринной активностью. ВФ
подвергается ступенчатому циклу физиологической регенерации, в ходе которого
теряет, а затем восстанавливает больше половины своей структуры. Основной
принцип реконструкции ВФ в культуре основан на комбинировании клеток ДП,
способных индуцировать новообразование ВФ, и пластичных эпидермальных
кератиноцитов (КЦ). Исследование морфогенетического потенциала
постнатальных клеток кожи и определение путей управления процессами регенерации в культуре предоставит знания об архитектуре и физиологии тканей человека, с одной стороны, и определит будущие подходы к развитию тканевой инженерии, с другой.
Цели и задачи исследования
Целью исследования является определение потенциала постнатальных клеток человека к регенерации ВФ in vitro. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Определить условия, необходимые для инициации фолликулогенеза в культуре.
-
Охарактеризовать полученные органоиды в соответствии со стадией регенерации ВФ.
-
Определить влияние индуцирующих способностей клеток ДП на
фолликулогенез в культуре.
-
Исследовать влияние факторов паракринной регуляции и компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ) на формирование органоидов для определения путей регуляции морфогенеза ВФ in vitro.
-
Исследовать влияние провоспалительных факторов - TGF и гипоксии – на клетки ДП и дермальные фибробласты (ДФ) человека и мыши.
-
Определить возможность получения пациент-специфических клеток ДП методом дифференцировки из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК).
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые проведено исследование, доказывающее возможность инициации
фолликулогенеза в культуре постнатальных клеток человека. Было показано, что в
трехмерной совместной культуре клеток ДП и КЦ активировался характерный для
регенерации ВФ каскад WNT/катенин, повышалась экспрессия маркеров
фолликулярных КЦ: P кадгерина, цитокератинов 6, 75, 35, 32 и трихогиалина. По
специфическому паттерну экспрессии маркеров полученные органоиды
соответствовали зачатку ВФ. Впервые продемонстрировали ключевую роль клеток
ДП в самоорганизации зачатка ВФ в культуре. Снижение индуцирующих свойств
клеток ДП приводило к потере способности формировать агрегаты. Добавление
гиалуроновой кислоты стимулировало процессы самоорганизации, что
свидетельствовало об управляемости процессами морфогенеза зачатка ВФ in vitro. Провоспалительные агенты не оказывали значительного воздействия на постнатальные клетки ДП человека, но стимулировали дифференцировку в фибробласты клеток ДП мыши. Модифицировали протокол получения клеток ДП из ИПСК путем предотвращения нейральной дифференцировки, что позволило повысить воспроизводимость протокола.
Работа выполнена при поддержке Российского Научного Фонда, проект 16-14-00204.
Положения, выносимые на защиту
-
Постнатальные клетки ДП способны к инициации фолликулогенеза и формированию зачатка ВФ
-
Для инициации фолликулогенеза необходим непосредственный контакт между клетками ДП и КЦ, нарушение этого контакта препятствует регенерации ВФ в культуре.
-
Клетки ДП регулируют процессы самоорганизации зачатка ВФ в культуре. Снижение их индуцирующих свойств и старение именно этой популяции клеток препятствует дальнейшему развитию ВФ.
-
Альтернативным источником получения аутологичных клеток ДП является дифференцировка из ИПСК.
Личный вклад автора
Личным вкладом автора является тщательный анализ данных литературы, на основе которого было спроектировано исследование и подобраны подходящие методы. Автором были выделены все исследуемые культуры клеток кожи человека и мыши, разработаны методы совместного культивирования и получены результаты, которые были проанализированы автором и представлены на всероссийских и международных конференциях, а также опубликованы в рецензируемых журналах.
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность обеспечена использованием современных методов и
оборудования. Каждый эксперимент проводили со всеми надлежащими
техническими и биологическими повторами. Данные, полученные в
экспериментах, обрабатывали с использованием соответствующих статистических методов.
Результаты исследования были апробированы на: Всероссийской
конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» в 2010г,
международной конференции «Ломоносов 2011», международной конференции
"Биология XXI века" в 2011г, международной конференции «Epigenetic control of
skin development and regeneration» в Брэдфорде, Великобритания, в 2011г,
международном форуме «ЛОМОНОСОВ-2013», международной конференции
«Cell Technology Week» в Киеве, Украина, в 2013г, конференции «Морфогенез в
индивидуальном и историческом развитии» в 2015г, международной конференции
«17th Meeting of the European Hair Research Society 2016» в Тбилиси, Грузия, на
конференции «Актуальные проблемы биологии развития» в 2016 и 2017гг.,
международной конференции «47th annual meeting of European Society for
Dermatological Research» в Зальцбурге, Австрия, в 2017г, «III национальном конгрессе по регенеративной медицине» в 2017г, а также школах молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН в 2010, 2012, 2013 и 2014 гг.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 23 печатных работы, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК - 4, статей в иностранных рецензируемых журналах - 1, тезисов докладов и материалов конференций - 18.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 115 страницах, содержит 32 рисунка, 4 таблицы и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературных данных, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список используемых сокращений и список литературы. Библиография включает 175 источников.
Особенности клеток дермальной папиллы
Клетки дермальной папиллы в культуре имеют типичную для фибробластов морфологию и поляризацию [Sutherland et al., 2005]. Тем не менее, в отличие от дермальных фибробластов, клетки дермальной папиллы не демонстрируют контактного торможения пролиферации при достижении конфлуэнтности [Heit et al., 2001; Wieser et al., 1990]. Отличительной особенностью культуры клеток дермальной папиллы является агрегирующее поведение и формирование псевдопапилл [Bratka-Robia et al., 2002, Jahoda, Oliver 1984, Schmidt-Ullrich, Paus 2005, Schneider et al., 2009]. Подобный феномен, вероятно, имитирует агрегацию клеток дермальной папиллы в коже при формировании волосяного фолликула. Агрегация клеток дермальной папиллы регулируется молекулами внеклеточного матрикса in vivo [Gao et al., 2008] и in vitro [Feng et al, 2011].
Клетки дермальной папиллы способны к реорганизации внеклеточного матрикса в культуре. Они контрактируют и растворяют коллагеновый гель. При этом энзиматическое расщепление геля является главным способом ремоделинга в отличие от фибробластов, которые более склонны к контракции [Almeida et al, 2005, Jahoda, Reynolds, 1993. Chermnykh et al., 2010]. Клетки дермальной папиллы экспрессируют спектр металлопротеиназ - белков, расщепляющих молекулы матрикса. Спектр экспрессии у них беднее в сравнении с дермальными фибробластами и клетками соединительнотканной оболочки волосяного фолликула [Almeida et al, 2005, Jahoda, Reynolds, 1993]. Вероятно, это объясняется тем, что клетки дермальной папиллы в организме находятся в покое, в отличие от клеток соединительнотканной оболочки, которая также подвержена циклическим изменениям, типичным для волосяного фолликула, и фибробластов, отвечающих за регенерацию кожи.
Клетки дермальной папиллы обладают уникальным набором специфических маркеров, по которым их можно охарактеризовать и отличить от других мезенхимных клеток [Inamatsu et al, 1998, Higgins et al, 2010, Ohyama, et al, 2012, Rendl et al, 2008, Aoi et al, 2012, Kishimoto et al, 2000, Driskell et all, 2009]. Общими специфическими маркерами клеток дермальной папиллы мыши и человека являются щелочная фосфатаза и версикан. Они экспрессируются в клетках дермальной папиллы как in vivo, так и in vitro [Kishimoto et al, 1999, Iida et al, 2007, Handjiski et al, 1994, Soma et al, 2005]. SOX2 является маркером дермальной папиллы первичных волосяных фолликулов мыши или дермальной папилле человека. Небольшой процент клеток в культуре и в волосяном фолликуле экспрессирует этот маркер, тем не менее, SOX2 положительные клетки обладают большими индуктивными способностями [Clavel et al, 2012, Driskell et al, 2009, 2012].Гладкомышечный актин является маркером культивированных клеток дермальной папиллы, он не экспрессируется in vivo [Jahoda et al, 1991]. Корин и CD133 являются специфическими только для клеток дермальной папиллы мыши. У человека наблюдается экспрессия данных маркеров, однако эти белки слабо детектируются методами иммуногистохимии [Enshell-Seijffers et al, 2008, Ito et al, 2007].
Постнатальные клетки дермальной папиллы способны индуцировать неофолликулогенез – формирование новых волосяных фолликулов при трансплантации под эпидермис. В течение длительного культивирования индуцирующие свойства снижаются, что сопряжено с потерей агрегирующей способности и экспрессии специфических маркеров [Horne et al., 1986; Lichti et al., 1993; Weinberg et al., 1993]. Эти изменения возникают в результате извлечения клеток дермальной папиллы из их стволовой ниши и старения культуры.
Изменения при долговременном культивировании повторяют процессы, происходящие при старении организма [Waldera Lupa et al, 2015]. Клетки теряют свой потенциал к дифференцировке, миграции и синтезу паракринных факторов регуляции. Происходит изменение фенотипа клетки, уменьшается ядерно-цитоплазматическое соотношение, защелачивается цитоплазма [Turinetto et al, 2016]. Значительные изменения происходят в энергетическом обмене клеток: нарушаются функции митохондрий, что приводит к апоптозу [Mammone et al, 2006]. Возрастные изменения кожи затрагивают в первую очередь процессы самообновления и ранозаживления. Структурно происходят значительные изменения в строении и составе внеклеточного матрикса. Плотная упорядоченная сеть коллагеновых волокон молодой кожи деструктуризируется и фрагментируется [Quan, Fisher, 2015]. Проблемы ранозаживления возникают вследствие ослабления реакции дермальных фибробластов на провоспалительные агенты. Клетки молодого организма активируются, продуцируя факторы регенерации и трансформируясь в миофибробласты, в то же время фибробласты возрастных доноров не способны к адекватному ответу [Simpson et al, 2010, Shiraha et al, 2000].
Ремоделирование ниши в культуре позволяет продлить время культивирования клеток дермальной папиллы с сохранением их особых свойств или же их восстановить. Основные проблемы культивирования клеток дермальной папиллы связаны с переносом клеток из трехмерных условий шарообразной структуры папиллы в двумерное пространство монослойного культивирования. При помещении клеток в культуру значительно возрастает пролиферация: в волосяном фолликуле пролиферирует примерно 2% клеток дермальной папиллы, в то время как в среднем время удвоения культуры клеток составляет от 3х до 5 суток. Повышается экспрессия гладкомышечного актина, который не экспрессируется in vivo [Higgins et al, 2010]. Клетки теряют свое «стволовое» состояние. Получение агрегатов из клеток дермальной папиллы частично возвращает потерянные при монослойном культивировании свойства. Возобновляется экспрессия специфических маркеров и уровень пролиферации. Исследования показали, что суспензия культивированных клеток дермальной папиллы не способна индуцировать формирование фолликула после субэпидермальной трансплантации. Однако после формирования сфероида из этой клеточной суспензии образуются волосяные фолликулы, продуцирующие стержень волоса [Higgins et al, 2010, Ohyama, et al, 2012].
Другие подходы основаны на добавлении компонентов ниши клеток дермальной папиллы в культуру. К компонентам ниши относят молекулы паракринного сигналлинга (факторы роста, цитокины, гормоны), регулирующие цикл волосяного фолликула, и компоненты внеклеточного матрикса.
Из членов семейства WNT лучше всего зарекомендовал себя WNT3a. Он стимулирует клетки дермальной папиллы мыши и поддерживает их индуцирующие свойства посредством канонического WNT сигналлинга [Kishimoto et al, 2000]. Известно несколько высокоэффективных низкомолекуярных веществ, активирующих катенин, и зарекомендовавших свое применение: CHIR, BIO и др. [Ohyama et al, 2012]. Аналогом активаторов неканонического WNT сигналлинга является вальпроевая кислота, которая активирует MAPK и оказывает поддерживающий эффект на культуру волосяного фолликула [Jo et al, 2013, Lee et al, 2012].
BMP6 поддерживает культуру клеток дермальной папиллы мыши с сохранением индуцирующих свойств [Rendl et al, 2008]. ВМР4, характерный для цикла волосяного фолликула, также оказывает стимулирующее воздействие, однако в меньшей степени. Другим немаловажным членом суперсемейства TGF является TGF2, падение экспрессии которого негативно сказывается на клетках дермальной папиллы. Его экспрессию можно поддержать, используя кальцитриол, метаболит витамина D3 [Aoi et al, 2012].
Внеклеточный матрикс дермальной папиллы включает в себя 3 основные группы: протеогликаны, интерстициальные коллагены и компоненты базальной мембраны [Tsang et al., 2010]. Матрикс играет ключевую роль в коже. Исследование показало, что децеллюларизированный матрикс молодой кожи оказывает омолаживающий эффект на фибробласты зрелой постнатальной кожи. Интересно, что кожа трансгенных мышей, склонных к формированию эктопических волосяных фолликулов, оказывает аналогичное воздействие [Lichtenberger et al, 2016]. Важнейшую роль матрикс играет в процессах агрегации клеток дермальной папиллы. Нокаутирование специфического протеогликана версикана препятствует формированию псевдопапилл в культуре клеток дермальной папиллы [Feng et al, 2011]. Исследователи оценили влияние различных компонентов внеклеточного матрикса на скорость агрегации клеток на поверхности неадгезивного субстрата. Фибронектин ускорял агрегацию в значительной степени по сравнению с коллагенами I и IV типов и ламинином. При этом все исследованные компоненты матрикса оказывали положительный эффект на пролиферацию [Young et al., 2009]. Поддержание пролиферации необходимо для развивающейся папиллы. Этому способствует гиалуроновый матрикс, позволяющий вырастить сфероиды из единственной клетки [Driskell et al, 2012]. Гиалуроновый матрикс снижает экспрессию маркера двумерного культивирования гладкомышечного актина [Miao et al, 2016].
Совместное культивирование клеток дермальной папиллы и кератиноцитов в трехмерной системе
С целью увеличить взаимодействие между клетками дермальной папиллы и кератиноцитами перенесли совместное культивирование в систему «висячая капля». В данной системе культивирования клетки адгезируют друг на друга под воздействием гравитации. Были разработаны 2 модели совместных культур: смешанные и покрытые агрегаты (Рис. 7). Для получения смешанных агрегатов суспензии клеток дермальной папиллы и кератиноцитов в равных пропорциях культивировали в висячих каплях до формирования агрегатов. Для получения покрытых агрегатов предварительно подготовленные сфероиды клеток дермальной папиллы переносили в суспензию кератиноцитов и далее культивировали в висячей капле. Покрытые агрегаты ближе по своей структуре к строению волосяной луковицы, в которой дермальная папилла окружена слоями кератиноцитов. Клетки дермальной папиллы были предварительно помечены RFP.
В смешанных агрегатах клетки дермальной папиллы имели тенденцию формировать сферические структуры, в то же время кератиноциты формировали протяженные трабекулы (Рис. 8, а,б). Трабекулы кератиноцитов были погружены в сфероиды клеток дермальной папиллы. В один сфероид могло быть погружено до двух трабекул, иногда клетки дермальной папиллы формировали опоясывающие кольцевые структуры вокруг них. При этом не наблюдалось миграции клеток папиллы в толщу кератиноцитов, редкие кератиноциты могли быть обнаружены в сфероидах дермальной папиллы.
В покрытых агрегатах кератиноциты окружали плотное ядро из клеток дермальной папиллы. Клетки дермальной папиллы проникали в толщу кератиноцитов, вследствие чего граница сфероида становилась размытой (Рис. 8, а,в).
Сравнили экспрессию специфических маркеров фолликулогенеза в агрегатах методом количественного ПЦР анализа в реальном времени (Рис.9). В смешанных агрегатах по сравнению с покрытыми возрастает экспрессия цитокератинов и трихогиалина (TCHH), типичных для волосяного фолликула. Кератин 75 специфичен для наружного корневого влагалища, в то время как кератины 32 и 35 характерны для кутикулы волосяного стержня [Langbein et al, 2010], следовательно, в смешанных агрегатах возникали процессы стратификации эпителиальной части. Отмечалось повышение синтеза специфических белков, связанных с морфогенезом волосяного фолликула: P-кадгерина, EpCAM и EDAR. Также возрастала экспрессия членов каскада WNT: WNT5a и LEF1. Экспрессия катенина и маркера клеток дермальной папиллы версикана снижалась. катенин, как и версикан, является маркером клеток дермальной папиллы. Известно, что при сферическом культивировании клетки дермальной папиллы восстанавливают свои трихогенные свойства, что сопряжено с повышением экспрессии специфических маркеров [Higgins et al, 2010, Ohyama, et al, 2012]. В покрытых агрегатах сфероиды подготавливали заранее, следовательно, клетки находились в активирующих условиях дольше по сравнению со смешанными агрегатами. Вероятно, этим объясняется повышение экспрессии некоторых маркеров дермальной папиллы в покрытых агрегатах.
Иммуногистохимическое исследование смешанных агрегатов выявило, что в области контакта клеток дермальной папиллы и трабекул находятся пролиферирующие и LEF1 положительные кератиноциты (Рис. 10, а). Подобный паттерн наблюдается в эпителиальной плакоде [Gay et al, 2015]. Пролиферирующие и LEF1 положительные клетки дермальной папиллы детектировали по всему сфероиду. Кератиноциты экспрессировали специфические маркеры волосяного фолликула: P-кадгерин и EpCAM. В покрытых агрегатах экспрессия LEF1 не была обнаружена, пролиферация была выявлена только среди клеток дермальной папиллы, которые мигрировали в толщу кератиноцитов. Кератиноциты были положительны по EpCAM, однако экспрессии Р-кадгерина не наблюдалось (Рис. 10, б).
Проверили специфичность формирования фолликулоподобных структур, используя фибробласты легкого взамен клеток дермальной папиллы. Данные агрегаты были не структурированы, не детектировалось специфических паттернов пролиферации, экспрессии LEF1 и Р-кадгерина. Кератиноциты были EpCAM положительны (Рис. 10, в). EpCAM рядом исследователей считается одним из маркеров фолликулогенеза. Чтобы выяснить причину его экспрессии в агрегатах с легочными фибробластами, провели иммуногистохимическое окрашивание культуры пассированых кератиноцитов в монослое (Рис. 11). Выявили, что кератиноциты экспрессируют EpCAM, в то время как синтез P-кадгерина отсутствовал. Следовательно, экспрессия EpCAM в покрытых агрегатах и смешанных агрегатах, полученных из легочных фибробластов, является артефактом и вызвана условиями культивирования кератиноцитов, а процессы фолликулогенеза наблюдаются только в смешанных агрегатах, приготовленных с использованием клеток дермальной папиллы.
Отсутствие структуры в агрегатах, полученных с использованием легочных фибробластов, означает, что клетки дермальной папиллы регулируют морфогенетические процессы формирования трабекул кератиноцитов.
Образование в эпителиальной части смешанных агрегатов структур, подобных плакоде, означает, что кератиноциты получили сигнал к инициации морфогенеза волосяного фолликула от клеток дермальной папиллы.
In vivo пролиферирующему эпителию плакоды должна подлежать пролиферирующая и экспрессирующая LEF1 область конденсации фибробластов – дермальный конденсат. То, что в смешанных агрегатах такая область не выявляется, указывает на нарушение реципрокных взаимодействий между эпителиальной и мезенхимной частями смешанных агрегатов. Вероятно, клетками, неспособными поддержать эти взаимодействия, являются клетки дермальной папиллы, поскольку с подобными проблемами сталкивались исследователи, пытавшиеся реконструировать волосяной фолликул в искусственных эквивалентах кожи [Qi et al, 2008].
Сохранение индуцирующих свойств клеток дермальной папиллы
Существует несколько подходов к продлению срока культивирования клеток дермальной папиллы с сохранением их идентичности. Добавление факторов роста, цитокинов, специфических матриксов позволяет продлить время культивирования без потери экспрессии специфических маркеров, с сохранением агрегирующих способностей и индуцирующих свойств.
На основании данных научной литературы были выбраны для анализа следующие факторы: BMP6, витамин D3, FGF20, вальпроевая кислота, WNT3a, WNT5a и DKK1. WNT каскад является ключевым в морфогенезе и регенерации волосяного фолликула. WNT3a показал положительный результат на клетках дермальной папиллы [Kishimoto et al, 2000] за счет активации канонического каскада WNT/катенин. WNT5a и вальпроевая кислота показывали положительную динамику в подобных исследованиях за счет инициации неканонического WNT каскада [Kishimoto et al, 2000, Jo et al, 2013, Lee et al, 2012]. DKK1 использовали в качестве ингибитора пути WNT.
Цикл регенерации волосяного фолликула регулируется не только членами суперсемейства WNT, но и TGF. Среди них наилучшие результаты были получены при использовании BMP6 [Rendl et al, 2008] и витамина D3, который активирует сигналлинг TGF2 [Aoi et al, 2012]. FGF20 в эмбриогенезе стимулирует конденсацию фибробластов и формирование дермальной папиллы [Huh et al, 2013], его влияние на постнатальные клетки не изучено.
При монослойном культивировании клеток дермальной папиллы было отмечено повышение экспрессии щелочной фосфатазы и версикана под воздействием BMP6, витамина D3 и вальпроевой кислоты (Рис.19).
Исследовали влияние компонентов внеклеточного матрикса дермальной папиллы на экспрессию специфических маркеров. Были выбраны компоненты, присутствующие в волосяном фолликуле in vivo. Использовали несколько протеогликанов: агрекан, бигликан, фибронектин, и хондроитин сульфат.
Также оценивали влияние гиалуроновой кислоты и коллагена I, присутствующих в коже повсеместно. В качестве компонентов базальной мембраны использовали матригель. Ни один из исследуемых компонентов матрикса в значительной степени не увеличивал экспрессию специфических маркеров (Рис.20).
Поскольку поддержание необходимого уровня пролиферации клеток дермальной папиллы было важно для формирования полноценных агрегатов, анализировали влияние факторов паракринного сигналлинга и компонентов внеклеточного матрикса на пролиферацию (Рис. 21). Несмотря на то, что BMP6, витамин D3 и вальпроевая кислота сохраняли фенотип клеток дермальной папиллы в течение долгого времени, ни один из исследуемых факторов не повышал уровень пролиферации. Более того, вальпроевая кислота значительно подавляла этот процесс. В то же время компоненты ВКМ агрекан, бигликан, фибронектин и гиалуронан в значительной степени стимулировали пролиферацию.
Исследовали влияние факторов паракринного сигналлинга и компонентов матрикса на формирование агрегатов (Рис. 22). Их действие на агрегаты отличалось от такового на монослойной культуре. Факторы паракринного сигналлинга не оказывали влияния на размеры агрегатов. Вальпроевая кислота, FGF20 и DKK1 значительно подавляли пролиферацию, и для остальных факторов наблюдалась подобная тенденция. Таким образом, в результате эпителио-мезенхимных взаимодействий агрегат отвечает на воздействие внешнего сигналлинга комплексно. Большинство факторов, поддерживающих клетки дермальной папиллы в культуре, в цикле волосяного фолликула продуцируются на стадии деградации или покоя. Вероятно, с этим было сопряжено торможение развития агрегатов (Рис. 22,а). Добавление большей части исследуемых компонентов внеклеточного матрикса препятствовало формированию полноценных агрегатов. Хондроитин сульфат не блокировал этот процесс, но не оказывал стимулирующего воздействия на формирование агрегатов. Гиалуронан оказывал значительное стимулирующее влияние, под его воздействием наблюдалось повышение пролиферации и увеличение размеров агрегатов более чем в 3 раза (Рис. 22,б). Субстрат играет значительную роль в процессах самоорганизации органоидов. Важны его физические качества, такие как плотность и вязкость, и возможность рецепторного взаимодействия и адгезии к такому субстрату [Cerchiari et al, 2015, Lou, Leung, 2017]. Учитывая, что гиалуроновая кислота не оказывала влияние на индуцирующие свойства клеток дермальной папиллы, вероятно, значительный положительный эффект опосредован стимуляцией процессов самосборки агрегатов.
Определение способности клеток дермальной папиллы и дермальных фибробластов к активации в провоспалительных условиях
Снижение морфогенетического потенциала клеток дермальной папиллы может быть сопряжено с возрастом доноров кожи. Органоиды, продуцирующие волосяной стержень, успешно формируются из эмбриональных клеток [Qiao et al, 2008, Ihara et al, 1991, Kageyama et al, 2017], следовательно, одной из причин задержки развития агрегатов на стадии зачатка волосяного фолликула может быть утрата способности клеток дермальной папиллы поддерживать необходимый пролиферативный уровень или отвечать на внешние стимулы. Одним из характерных признаков физиологической активности клеток дермы является их активация в провоспалительных условиях [Simpson et al, 2009, 2010, Midgley et al, 2014]. Активация фибробластов – процесс, приводящий к формированию миофибробластов, клеток, отвечающих за контракцию раны и синтез интерстициальных коллагенов, необходимых для формирования рубца. Интересно, что снижение способностей к активации у фибробластов от возрастных доноров связано со снижением сигналлинга и продукции гиалуронана [Simpson et al, 2009, 2010, Midgley et al, 2014]. Поскольку исследования поведения клеток дермальной папиллы в гипоксии ранее не проводились, в качестве дополнительной исследуемой группы взяли дермальные фибробласты для нормализации результатов. Исследовали поведение клеток дермальной папиллы и дермальных фибробластов в провоспалительных условиях: в гипоксии (1% кислорода) и под воздействием TGF1. Иммуногистохимический анализ не выявил увеличения экспрессии маркеров миофибробластов, гладкомышечного актина (SMA) и SM22 (Рис.25).
Далее был исследован ответ клеток на экспериментальные условия на экспрессию факторов, индуцируемых гипоксией (HIF1, HIF2), коллагена I типа и гладкомышечного актина методом количественного ПЦР анализа. Отличий между экспериментальными группами обнаружено не было (Рис. 26).
Из данных литературы известно, что клетки дермальной папиллы мыши обладают большим морфогенетическим потенциалом в сравнении с клетками человека [Qi et al, 2008, Sriwiriyanont et al, 2012, 2013]. Поместили клетки дермальной папиллы и дермальные фибробласты мыши в аналогичные условия. TGF стимулировал распластывание клеток и формирование фибрилл гладкомышечного актина и SM22. Гипоксия в значительной степени усиливала этот процесс. Ответ дермальных фибробластов на провоспалительное воздействие был значительно более выраженным по сравнению с клетками дермальной папиллы (Рис. 27).
В результате количественного ПЦР анализа (Рис.28) было показано возрастание экспрессии обоих факторов, индуцируемых гипоксией, в дермальных фибробластах. Для клеток дермальной папиллы было характерно повышение экспрессии HIF2, в то время как синтез HIF1 снижался. Вероятно, преобладание HIF2 в гипоксии объясняется происхождением клеток дермальной папиллы из нервного гребня: для большинства дериватов этой структуры специфична регуляция этим фактором. TGF стимулировал экспрессию HIF1 в нормоксии у дермальных фибробластов, что соотносится с данными литературы [McMahon et al, 2006], однако подавлял синтез HIF1 и HIF2 при низком содержании кислорода. В сочетании с растущей экспрессией коллагена и гладкомышечного актина можно предположить, что TGF стимулирует их дифференцировку в миофибробласты. Падение экспрессии специфического маркера монослойной культуры клеток дермальной папиллы, гладкомышечного актина, в сочетании с повышением синтеза коллагена свидетельствует о дифференцировке в направлении дермальных фибробластов под воздействием TGF нормальных условиях. Гипоксия, вероятно, также индуцирует аналогичную дифференцировку, поскольку под воздействием TGF клетки дермальной папиллы демонстрируют поведение, типичное для фибробластов.
Таким образом, клетки кожи мыши отвечали на провоспалительное воздействие дифференцировкой в миофибробласты в отличие от клеток человека. Активация фибробластов регулируется транскрипционными факторами HIF1 и HIF2, активность которых значительно снижена у дермальных клеток человека. Недавние исследования показали, что фибробласты дермы юных доноров (средний возраст 25 лет) способны реагировать на провоспалительное воздействие повышением синтеза HIF1 [Zhao et al, 2017]. Следовательно, снижение синтеза этих факторов у клеток человека является именно возрастным изменением. Данные транскрипционные факторы регулируют морфогенетические, регенеративные и многие другие важнейшие процессы. Отсутствие их экспрессии может являться причиной остановки развития зачатка волосяного развития в культуре.
Прослеживается корреляция между высоким морфогенетическим потенциалом клеток мыши [Qi et al, 2008, Sriwiriyanont et al, 2012, 2013] и их ответом на условия воспаления. Отсутствие способности к активации у клеток человека в сочетании с остановкой развития зачатка волосяного фолликула свидетельствует о значительных изменениях в физиологической активности клеток. Вероятно, клетки дермальной папиллы не способны реагировать не только на провоспалительные агенты, но и на остальные морфогенетические факторы, которые потенциально исходят от кератиноцитов при формировании агрегата. Стоит отметить, что подобные нарушения влияют на развитие агрегатов, но не на ранние процессы инициации фолликулогенеза, которыми управляют клетки дермальной папиллы в смешанных агрегатах.