Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Глобальная и фокальная ишемия головного мозга в клинике 15
1.2. Метаболические нарушения головного мозга, происходящие вследствие фокального ограничения гемодинамики. Ядро ишемии изона «ишемической полутени» 18
1.3. Молекулярные механизмы ишемического повреждения клеток головного мозга: немедленные и отсроченные 27
1.4. Основные морфофункциональные особенности клеток мозга 38
1.5. Реактивные изменения различныхтипов клеток головного мозга в ядре ишемии и в зоне «ишемической полутени» 47
1.6. Свойства антигипоксантов. Фармакологическая характеристика метапрота 54
1.7. Выбор отделов головного мозга для моделирования последствий выраженной и слабо выраженной глобальной ишемии 58
Глава 2. Материал и методы исследования 62
2.1. Моделирование глобальной ассиметричной ишемии головного мозга 63
2.2. Группы исследования 63
2.3. Морфологическое исследование головного мозга крыс 64
Глава 3. Результаты собственных исследований 70
3.1. Особенности строения и расположения разных типов клеток в некоторых отделах мезокортиколимбической дофаминергической системы у здоровых крыс 70
3.1.1. Особенности строения слоев V – VI переднего цингуцингулярного поля 71
3.1.2. Особенности строения прилежащего ядра переднего мозга 76
3.1.3. Особенности строения паранигрального ядра среднего мозга з
3.2. Реактивные изменения разных типов клеток некоторых отделов мезокортиколимбической дофаминергической системы после глобальной ишемии 90
3.2.1. Изменения клеточного строения в глубоких слоях передней цингулярной коры (область выраженной ишемии) 90
3.2.2. Изменения клеточного строения прилежащего ядра переднего мозга (область выраженной ишемии) 96
3.2.3. Изменения клеточного строения паранигрального ядра среднего мозга (область слабо выраженной ишемии) 103
3.3. Коррекция метапротом количественных и структурно-топографических изменений клеточных элементов в фокусе выраженной ишемии и за его пределами 111
3.3.1. Коррекция метапротом ишемических изменений клеточных элементов слоев V – VI переднего цингулярного поля (область выраженной ишемии) 111
3.3.2. Коррекция метапротом ишемических изменений клеточных элементов паранигрального ядра среднего мозга (область слабо выраженной ишемии) 118
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 127
4.1. Изменения клеток передней цингулярной коры и приле-жащего ядра, расположенных в области выраженной ишемии 129
4.2. Изменения клеток паранигрального ядра, расположенных в области слабо выраженной ишемии 135
4.3. Фармакологическая коррекция метапротом постишемичес-ких изменений клеток исследованных отделов мезокортико-лимбической дофаминергической системы 137
Выводы 140
Практические рекомендации 142
Список литературы .
- Метаболические нарушения головного мозга, происходящие вследствие фокального ограничения гемодинамики. Ядро ишемии изона «ишемической полутени»
- Группы исследования
- Особенности строения прилежащего ядра переднего мозга
- Фармакологическая коррекция метапротом постишемичес-ких изменений клеток исследованных отделов мезокортико-лимбической дофаминергической системы
Введение к работе
Актуальность исследования
Проблема ишемического повреждения мозга в последние годы приобретает все большую значимость, поскольку в структуре инвалидизации и смертности оно выходит на первое место, вытесняя ишемическую болезнь сердца (Гусев Е. И. и Скворцова В. И., 2013).
В связи с этим создание адекватных экспериментальных моделей и изучение в них данной патологии остается актуальной проблемой современной науки.
Для оценки эффективности коррекции постишемических нарушений
фармакологическими препаратами широко используется модель глобальной
ишемии мозга, которая устанавливается после перевязки обеих общих сонных
артерий (Пошивалов В. П., 1978; Шабанов П. Д., Зарубина И. В. и Soultanov Vagif
S., 2011). Эффективность терапии в этой модели обычно оценивают по результатам
неврологического и биохимического тестирований крыс. Нарушение
кровоснабжения мозга при данном способе моделирования ишемии более выражено в переднем мозге и менее – в стволовой его части, где циркуляция крови поддерживается из русла позвоночных артерий (Paxinos G., 2004). Животные переживают 2 недели после операции, если их не подвергать стрессу. Информативность существующей методики могла бы стать значительно большей благодаря установлению постишемических изменений клеток мозга, относящихся к различным линиям дифференцировки – нейронов, макро- и микроглиоцитов, эндотелиоцитов капилляров в тех формациях мозга, которые расположены в условиях выраженного и слабо выраженного ограничения гемодинамики, при которых изменения данных типов клеток остаются неизученными.
Степень разработанности темы исследования
Морфологические исследования глобальной ишемии головного мозга не привязаны к определенному его отделу и посвящены только визуальному описанию общих признаков изменений нейроцитов и развитию защитной реакции макроглии – сателлитозу. В исследованиях последствий фокальной ишемии авторы раскрывают изменения разных типов клеток, как в зоне ишемического инфаркта, так и во внутренней части прилегающей области (zona penumbra), где начинается формирование капсулы как результат реакции на фокальную циркуляторную гипоксию (Васильев Ю.Г. и Берестов Д.С., 2011; Szpak G.M. et al., 1999). Совсем не попадаются исследования, отражающие специфику патологических изменений нейронов, макро- и микроглиоцитов, сосудистого эндотелия, обусловленных расстоянием клеток от ядра инфаркта и временем, проходящим от начала ишемического воздействия.
В тех немногочисленных работах, посвященных выявлению реактивных изменений клеток в фокусе ишемии и ближайшей к ней зоне, все же, содержатся мало сведений о количестве фенотипических форм патологически измененных нейронов и клеток других типов, слабо представлены количественные и морфометрические данные пространственной пластичности макроглиальных клеток и самих нейроцитов, (считающихся, в отличие от микроглиальных, оседлыми) по отношению к телам нейроцитов и стенке капилляров. Между тем защитно-приспособительное перемещение тел олигодендроцитов и астроцитов, выявленное при наркотической гипоксии (Богомолов Д.В., 2001; Должанский О.В., 2001; Дробленков А.В., Карелина Н.Р. и Шабанов П.Д., 2009), алкогольной
абстиненции и хронической алкогольной интоксикации (Дробленков А.В., 2011), инфекционном процессе (Voskuhl R.R. et al., 2009), введении суспензии астроцитов, мигрирующих в направлении сосудистой стенки (Okoye G.S. et al., 1995) может развиваться также и вследствие ишемии. Имеющиеся сведения о пространственной пластичности нейронов головного мозга при ишемии, полученные при электронной микроскопии (Гелеранская О.А. и соавт., 2016) позволяют убедиться в необходимости более детального изучения таких приспособительных реакций, как объединения поврежденных нейронов как между собой, так и со стенкой кровеносных сосудов.
Объектом для изучения особенностей реактивности клеток головного мозга, расположенных в различных условиях глобальной ишемии мозга, могут быть ос-новные отделы мезокортиколимбической дофаминергической системы (МДС). Интерес к структурно-функциональным особенностям этой системы обычно вызван ее ключевой ролью в формировании зависимости от употреблени психоактивных веществ. В основе зависимости заложен устойчивый дефицит дофамина в синапсах между аксонами дофаминергических нейронов среднего мозга и нейронами проекционных отделов МДС – прилежащего ядра, миндалевидного тела, ядер ложа конечной полоски, передней цингулрной и префронтальной коры (Анохина И.П. и соавт., 2001; McBride W.J. et al.; 1990; Bergstorm H.C. at al., 2008). Большая протя-женность компонентов МДС (от среднего мозга, где расположены дофаминергиче-ские ядра до конечного мозга, содержащего основные проекционные центры), а также наличие обширных связей с любым из отделов мозга (способных повлиять на процесс ишемического повреждения ее клеток механизмами электрохимической и макромолекулрной передачи) делают систему пригодной для установления градиента ишемических изменений. Как правило, МДС также является структурной мишенью действия нейропротекторных средств. В качестве последних интересен препарат метапрот (от слов «МЕТАболический ПРОТектор»), в течение длительного времени входивший в арсенал медицинского обеспечения Вооруженных сил России в качестве табельного средства, повышающего работоспособность. В основе действия метапрота лежит его способность стимулировать энергетические и пластические процессы в головном мозге, миокарде, печени, почках (Шабанов П.Д., 2011).
Разработаны методические основы количественного и морфометрического изучения тел нейронов, тел и отростков астроцитов, нейроно-глиальных взаимоотношений в различных отделах МДС у самок крыс разного возраста, которые могут быть использованы в ходе настощего исследования (Дробленков А.В., 2010; Дроб-ленков А.В. и Шабанов П.Д., 2014).
Цель и задачи исследования
Цель исследования – установление структурных, пространственных и
количественных изменений основных типов клеток некоторых отделов МДС,
расположенных в различных условиях циркуляторной гипоксии, а также
эффективности метаболического протектора как средства коррекции
постишемических нарушений.
Задачи исследования:
1. Определить основные структурные, пространственные и количественные характеристики различных типов клеток передней цингулярной коры и прилежащего ядра конечного мозга (ПЯ и ПЦК), паранигрального ядра среднего мозга (ПНЯ) у здоровых молодых самцов крыс.
-
Установить реактивные изменения основных типов клеток ПЦК и ПЯ конечного мозга, расположенных в области выраженного ограничения кровотока через 7 суток экспериментальной ишемии.
-
Установить особенности реактивных изменений основных типов клеток ПНЯ среднего мозга, расположенных в области слабо выраженного ограничения кровотока через 7 суток экспериментальной ишемии.
4. Выявить морфологические признаки церебропротекторного действия
ме-тапрота на головной мозг по показателям реактивности основных типов клеток
ПКЦ конечного мозга и ПНЯ среднего мозга через 7 суток после глобальной ише
мии мозга.
Научная новизна исследования
Впервые установлен комплекс морфометрических параметров для верификации реактивных изменений различных типов клеток, расположенных в центре частичной ишемии и во внешней части зоны пенумбры при моделирования ассиметричной глобальной ишемии головного мозга. Этими параметрами являются: долевое соотношение различных типов патологически измененных нейронов – клеток-«теней» (погибших), набухших, сморщенных-гиперхромных и малоизмененных; площадь тел малоизмененных и набухших нейронов; доля тел нейронов, объединенных в пары; число и площадь тел астроцитов; глиоцито-нейрональный индекс; расстояние между телами нейронов, астроцитов и стенкой капилляров; число микроглиоцитов и площадь их тел; число эндотелиоцитов капилляров.
Использование данных параметров позволило впервые выявить целый
спектр выраженных патологических изменений клеток различного типа, в том
числе малоизвестных свойств пространственной пластичности тел нейронов и
макроглии. В центре частичной ишемии нейроны склонны к гибели: завершенной
(образование клеток-«теней») и пролонгированной (тип сморщивания-
гиперхромии), причем тела наименее поврежденных нейроцитов способны к объединению между собой и клетками макроглии. Образование нейроно-макроглиальных кластеров, располагающихся, главным образом, вблизи стенки разрастающихся капилляров, может являться для клеток компенсаторно-приспособительным механизмом и условием их выживания на территории выраженной частичной ишемии мозга. Белок промежуточных филаментов астроцитов в периферических частях отростков и перивазальных глиальных мембранах подвергается выраженной деградации. Между тем, клетки макроглии в фокусе частичной ишемии более устойчивы к повреждению, чем нейроциты, поскольку погибшие формы этих клеток в условиях эксперимента отсутствовали.
На периферии области ишемии нейроны склонны к переживанию дистрофических изменений по типу острого набухания и объединению с клетками макроглии. Образование нейроно-глио-васкулярных кластеров не характерно. GFAP в телах, отростках и перикапиллярных глиальных астроцитарных мембранах повергается изменениям гипертрофического типа.
Впервые установлено, что в данной ассиметричной модели глобальной ишемии мозга параметры изменений микроглиоцитов в исследуемых структурах переднего и среднего мозга значительно не различаются и выражаются признаками трансформации в клетки амебоидной формы глии.
Определены морфологические признаки выраженного нейроно(гисто)- протекторного эффекта актопротектора и антигипоксанта метапрота. Они направлены на активацию нейроно-глиальных взаимоотношений, протекцию атроцитов и их промежуточных филаментов, в том числе в периваскулрных глиальных мембранах и сохранение структурных особенностей нейронов, присущих малоизмененным клеткам.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Переживание условий выраженной и слабо выраженной циркуляторной ги-поксии в модели глобальной ассиметричной ишемии мозга индуцирует развитие у различных типов клеток головного мозга целого спектра выраженных патологических изменений. Нейроны находятся в процессе сморщивания-гиперхромии, лизиса и превращения в «клетки-тени». Нейроциты, расположенные в центре частичной ишемии, склонны к гибели или сморщиванию-гиперхромии. Нейроны, расположенные на периферии области ишемии и испытывающие, главным образом, дистантное воздействие реакций глютамат-кальциевого каскада, склонны к острому набуханию.
-
Астроциты, переживающие ишемию в ядерной зоне, отличаются признаками отека-набухания, деструкции промежуточных филаментов в части площади их тел, периферических отделах отростков и периваскулярных глиальных мембранах. На периферии области ишемии происходят изменения астроцитов гипертрофического типа. Реакция микроглиоцитов в виде слабо выраженного увеличения их числа и признаков активации является ранним диффузным проявлением ассимет-ричной глобальной ишемии мозга. Пролиферация эндотелиоцитов на ранних сроках ишемического воздействия происходит лишь в фокусе ишемии.
-
Расположение тел жизнеспособных нейронов и астроцитов вблизи стенки кровеносных капилляров, сближение тел нейронов с образованием между собой пар и небольших групп, а также рост числа сателлитных форм глии является адаптационными механизмами и условием выживания клеток при различных условиях ишемического воздействия на головной мозг.
-
Применение метапрота значительно усиливает компенсаторно-приспособительные реакции клеток мозга. Она способствует сдвигу удельного количества субпопуляций нейронов в сторону преобладания неизмененных (нормо-хромных) и существенному сокращению теневидных и гипохромных форм, не подавляя при этом процесс активации нейроно-глиальных взаимоотношений, индуцированный ишемией. Препарат препятствует формированию контактов клеток со стенкой капилляров. Усиление защитных реакций клеток мозга, переживающих циркуляторную гипоксию в сочетании с терапией метапротом, может быть обусловлено его известными механизмами нейропротекции.
Теоретическая и практическая значимость исследования
Теоретические значение выполненного диссертационного исследования состоит в том, что установлен целый ряд морфологических параметров строения и пространственных взаимоотношений основных типов клеток в главных отделах МДС. Величины этих параметров представлют собой эталон нормы для здоровых самцов крыс молодого возраста и эталон ишемических изменений, происходщих в условиях выраженного и слабо выраженного ограничения кровотока при повторном использовании популярной модели глобальной ишемии мозга с целью установления эффективности применения различных фармакологических препаратов.
Выявленные параметры пространственной пластичности тел клеток макро-глии, нейронов по отношению друг к другу и к сосудистой стенке представлют собой слабо изученное звено защитно-приспособительного механизма выживания комплекса клеток головного мозга, которые могут быть учтены в последующих исследованиях генеза различных патологических процессов, а также в качестве ранних диагностических признаков ишемии.
Практическое значение работы определяется выявлением морфологических признаков нейропротекторных/нейрореставрационных изменений после курсового назначения актопротектора метапрота. Полученные данные являются важным доказательством вовлечения разных типов клеток головного мозга в осуществление системных глиально-клеточных реакций, вовлекаемых в действие метаболических протекторов.
Методология исследования
Методология исследования состояла в изучении последствий перевязки обеих сонных артерий у молодых самцов крыс методами морфологического анализа: описательного, иммуноцитохимического, морфометрического при помощи световой микроскопии гситологических срезов в проходщем свете. Фармакологическую коррекцию возникающих вследствие перевязки ишемических нарушений проводили с помощью метапрота – метаболического протектора, стимулируюещего энергетический обмен, синтез РНК и аминокислот. Исследования выполнены с соблюдением всех принципов доказательной биологии и медицины и одобрены локальным комитетом по этике при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Институт экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург).
Степень достоверности и апробация материалов исследования. Статистическая обработка результатов
Выборка для каждой группы животных состояла не менее чем из 15-ти подсчетов в каждой группе животных (состоящей из 4-х крыс). Математико-статистические методы: было использовано программное обеспечение класса электронных таблиц Microsoft Excel 7.0. Математико-статистическое описание объектов исследования осуществлялось с помощью традиционных и давно утвердившихся в медицинских исследованиях методов (Айвазян С.А., Енюков И.С. и Ме-шалкин Л.Д., 1983; Лакин Г.Ф., 1990; Григорьев С.Г. и соавт., 1992; Юнкеров В.И. и Григорьев С.Г., 2005). Устанавливали средние значения (среднего арифметического значения показателей, моды, медианы), характеристики колеблемости признаков (дисперсию, среднее квадратическое отклонение, размах значений), стандартные ошибки средних значений и их доверительных интервалов. Результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента на персональном компьютере.
Реализация результатов работы
Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ отдела нейрофармакологии им. С.В.Аничкова ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург). Полученные результаты используются в учебном процессе кафедр морфологии человека и специализированной терапии Института медицинского образования ФГБОУ ВПО «Новгородский государственный университет имени Ярослава Мудрого» Минобрнауки РФ, кафедре фармакологии ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» Мин. обороны РФ.
Апробация и публикация материалов исследования
Результаты и основные положения диссертации доложены и обсуждены на
Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы морфологии, адап-
тогенеза и репаративных гистогенезов», посвященной памяти чл.-корр. АМН
СССР проф. Ф.М.Лазаренко (Оренбург, 2013); Всероссийской молодежной
конференции «Нейробиология интегративных функций мозга» (Санкт-Петербург,
2013), научной конференции молодых ученых «Перспективы развития
медицинской науки и прак-тики» (Санкт-Петербург, 2014), научной конференции,
посвященной 100-летию со дня рожд. чл.-корр. АМН СССР проф. А.Г.Кнорре
«Актуальные проблемы морфо-логии, эмбриональный и репаративный гистогенез,
филогистогенез» (Санкт-Петербург, 2014), Всероссийской научно-практической
конференции с междуна-родным участием «Экологические аспекты морфогенеза»
(Воронеж, 2015), XIII конгрессе международной ассоциации морфологов
(Петрозаводск, 2016), Всероссийской конференции молодых ученых
«Нейробиология интегративных функций мозга» (Санкт-Петербург, 2016).
Апробация работы прошла на расширенном научном заседании отдела нейрофармакологии им. С.В.Аничкова ФГБНУ «ИЭМ» (Санкт-Петербург).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 6 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 1 статья в иностранном журнале, 2 статьи в сборниках научных трудов. 6 публикаций (тезисов) размещены в материалах Международных и Российских конференций.
Личный вклад автора
Личный вклад автора осуществлялся на всех этапах работы и состоял в планировании экспериментов (90%), их непосредственном выполнении (95%), обработке полученных результатов (100%), обсуждении результатов, написании статей и тезисов (80%), написании диссертации и автореферата (95%).
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, научно-практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация изложена на 163 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы и список литературы, содержащий источников (60 отечественных и 125 иностранных). Диссертация иллюстрирована 25 рисунками и 13 таблицами.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1 представляет собой обзор литературы, в котором основное внимание уделено современному представлению механизма ишемических повреждений головного мозга и возможностях их фармакологической коррекции (С.15 – 61). Глава 2 включает описание методики, котора была использована при выполнении диссертации (С. 62 – 69). Глава 3 описывает результаты собственных исследований (С. 70 – 126). Глава 4 содержит общее обсуждение полученных результатов и данные о перспективах исследования (С.127 – 139). В заключении приведены выводы (С.140–141), практические рекомендации (С. 142) и список использованных литературных источников (С.143 – 163).
Метаболические нарушения головного мозга, происходящие вследствие фокального ограничения гемодинамики. Ядро ишемии изона «ишемической полутени»
Другим механизмом немедленной гибели или обратимого повреждения нейроцитов, развивающимся в зоне пенумбры, является «распространяющаяся депрессия», или «периинфарктная деполяризация» (Nedergaard M. and Hansen A.J., 1993). Этот хорошо известный феномен преходящего нарушения ионного градиента мембран, волна которого медленно движется по связям между нейроцитами и астроцитами головного мозга (Somjen G.G., Aitken P.G. and Czeh C.L., 1992). Морфологически при проходжении на периферию волны депрессии описано сжатие внеклеточного пространства на 50% за счет набухания астроцитов и дендритов нейроцитов. В момент распространения волны было определено временное увеличение концентрации ионов K+ во внеклеточном пространстве, а ионов Na+ и Са2+ – внутри клеток, что ведет к открытию анионных каналов для молекул бикарбоната и воды. Бикарбонатный сдвиг, в свою очередь, ведет к формированию ацидоза в нейроцитах и внеклеточном пространстве, В астроцитах, напротив, развивается алкалоз. Данные изменения клеток, по мнению авторов, являются обратимыми.
Роль «периинфарктной деполяризации» в расширении области инфаркта головного мозга подтверждается корреляцией между объемом зоны некроза и числом волн депрессии (Mies G.F., Iljima T. and Hossmann K., 1993). Каждая волна увеличивает объем ядра церебрального инфаркта примерно на 23%. Было также определено, что механизмы немедленной нейроцитальной ишемии в дополнение к Са2+ участвуют и другие катионы. Анализ селективной гибели нейроцитов в эксперименте с транзиторной глобальной ишемией, доказал существование цинк-опосредованной «эксайтотоксич-ности» (см. прил., рис. 5). Ранее была установлена роль внутриклеточного цинка как компонента многих металлозависимых энзимов и транскрипционных факторов, нейротрансмиттера и нейромодулятора голвоного мозга (Frederickson C.J., 1989). Значительное увеличение количества Zn2+ выявлено сразу после стимуляции нейроцитов в пресинаптических везикулах и синаптической щели; наряду с этим выявлена способность ионов Zn2+ ингибировать активность NMDA рецепторов (Choi D.W. and Koh J.Y., 1998). Цинк-опосредованная нейротоксичность была впервые сформулирована N. Tonder и соавт. (1990). С временной глобальной ишемии внутри аксонов нейроцитов СА-3 гиппокампа было выявлено истощение ионов Zi2+ ионы, тогда как концентрации этого иона в аномально высоких значениях были зарегистрированы в телах нейроцитов этой области мозга, являющейся наиболее восприимчивой к ишемии. Такое перемещение ионов Zn2+ и нейроцитальная дегенерация тормозились при гипотермии головного мозга (Johansen F.F. et al., 1993). Нейротоксическая роль ионов Zn2+ подтверждается тем, что их перемещение из пресинаптических терминалей в постсинаптические нейроциты непосредственно предшествует явлениям их дегенерации (Choi D.W. and Koh J.Y., 1998). В работах S.L. Sensi и соавт. (1997) было показано, что, подобно кальцию, цинк, проникая в избытке внутрь клеток, может вызывать их некроз или апоптоз, в зависимости от длительности и интенсивности экспозиции. Проникновение ионов Zn2+ в клетки происходит через любые кальциевые потенциал-зависимые каналы (в обмен на внутриклеточные ионы Na+; агонист-зависимые, сопряженные с NMDA-рецепторами).
Избыток внутриклеточного цинка ведет к снижению уровня внутриклеточной АТФ, поэтому он может существенно нарушать процессы гликолиза, опосредуя накопление промежуточных его продуктов и дигидроксиацетонфосфата (Lee J.M., Zipfel G.J. and Choi D.W., 1999). Темпы цинк-опосредованной гибели клеток сокращаются при введении пирувата, который в норме образуется в результате метаболических реакций, угнетающих избыток цинка.
Стадия экспрессии обеспечивается необратимыми механизмами активации клеточных энзимов, окислительным стрессом и чрезмерным синтезом оксида азота, накопления других низкомолекулярных цитотоксических соединений,превращими клетки к некротической смерти.
Избыточное внутриклеточное накопление ионов Ca2+ и переход кальция в активную форму путем связывания с рецептором кальмодулина и активацией кальмодулин-зависимых внутриклеточных энзимов (Berridge MJ and Triangi S., 1985) приводит к диссоциации окислительного фосфорилирования в митохондриях и усиление катаболизма, вызывающих апоптоз (Orrenius S., 1992). "Запуск" каскада ферментативных реакций ведет к множественным повреждениям биомакромолекул и, в конечном счете, к гибели клеток (Olney J.W.E., 1994). Особо опасен распад фосфолипидов плазматической мембраны и мембранах органелл. Через несколько минут после начала ишемии, уничтожается около 16% мембраного фосфатидилэтаноламина и высвобождается около 37% свободной арахидоновой кислоты (Yoshida S. еt al., 1980). Между тем, ишемическое расщепление мембранных фосфолипидов, таких как арахидоновая кислота, приводит к высвобождению ее в цитозоль. Метаболизм арахидоновой кислоты сопряжен с образованием простагланди-нов, тромбоксанов, гидрокси- и гидроперокси жирных кислот, лейкотриенов, липоперекисей и реактивных свободных радикалов, таким образом значительно интенсифицируя процессы свободнорадикального окисления и перекисного окисления липидов (Дамбинова С.А. и Каменская М.А., 1996; Packer L.L. еt al., 1992; Ugidos I.F., Santos-Galdiano M., Prez-Rodrguez D. et al., 2017).
Группы исследования
При воспроизведении кратковременной эфирной анестезии у крыс, их фиксировали на станке, препарировали обе общие сонные артерии которые затем плотно лигировали. Рану обработали антисептиком и слоистым. Отключение обеих общих сонных артерий связано с глубокой гипоксией переднего мозга. Расположенные в нем ПЦинК и ПЯ подвергаются выраженной ишемии, так как они могут восполнить дефицит крови только через коллатеральные сосуды большого артериального круга (Willisii) от активных позвоночных и основной артерии. ПНигЯ, которые входят в ядера вентральной области покрышки среднего мозга, испытывает ишемию,выражается гораздо меньше, чем структура переднего мозга, потому что он расположен в непосредственной близости от активной основной артерии. В то же время небольшой диаметр просвета и большое количество ветвей срединных средних мозговых артерий вносят вклад в формирование значительно большей устойчивости к кровотоку, чем в широком просвете основной артерии.
Это означает, что условия гемодинамики формируемые в модели двусторонней окклюзии обеих общих сонных артерий Пошивалов В. П. (1978), являются способом моделирования асимметричной глобальной ишемии головного мозга. Области тяжелой ишемии содержит ПЦинК и ПЯ переднего мозга, в области легкой ишемии (которая может соответствовать внешней границе зоны полутени) содержит паранигральное ядро - среднего мозга. Эти условия моделируются в настоящем эксперименте для выявления реактивных изменений в разных видов клеток отделов МДОФС, расположенных в полярных условиях ограничения кровотока.
Головной мозг был исследован у четырех групп крыс. Первая группа (5 интактных крыс) представляла собой основной контроль (контроль 1). У крыс экспериментальной группы (5 особей) воспроизводили глобальную ассиметричную ишемию головного мозга. Контролем для животных с ишемией служили ложнооперированные животные, у которых воспроизводили все этапы операции без перевязки сонных артерий (5 особей, контроль 2). Животным второй контрольной группы ежедневно внутрь брюшины вводили 1,0 мл физиологического раствора. У крыс 4-й группы (5 животных) устанавливали эффективность медикаментозной коррекции ишемии мозга препаратом метапрот, стимулирующим энергетический обмен и биосинтетические процессы во многих органах (Шабанов П. Д. и соавт., 2011). Препарат, приготовленный на основе 25%-го масляного раствора, в дозе 12,5 мг/кг и объеме 1,0 мл вводили внутрибрюшинно ежедневно 1 раз в сутки в утренние часы в виде курса в течение 7 дней. Экспериментальных и ложнооперированных животных умерщвляли через 7 суток опыта.
Морфологическое исследование головного мозга крыс Через 3 мин после декапитации крыс, осуществлявшейся в соответствии с "Правилами лабораторной практики в Российской Федерации" (приказ МЗ РФ от 2003 г. № 267"), мозг извлекали из полости черепа и фиксировали в 9% растворе нейтрального формалина, обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации и заливали в парафин. Фронтальные серийные срезы из отделов мезокортиколимбической дофаминергической системы (МДофС) для последующей окраски по Нисслю готовили толщиной 3 мкм, с целью выявления глиального фибриллярного кислого протеина (GFAP) в телах, главных отростках и перивазальных глиальных мембранах астроцитов – 7 мкм.
Формации МДофС, подлежащие исследованию, вначале идентифицировали ориентировочно при микроскопии неокрашенных парафиновых срезов, используя стереотаксический атлас головного мозга крыс (Paxinos G. and Watson C., 1998). Прицельному исследованию подвергали глубокие слои ПЦинК (слои V–VI, с которыми устанавливают синаптический контакт аксоны нейроцитов ПНигЯ), расположенные в области средней части колена мозолистого тела (рис. 2). Вентромедиальную часть ПЯ – наиболее широкую (также являющуюся частью МДофС), определяли между передней спайкой вблизи основания стриапаллидарного комплекса и обонятельными ядрами, расположенными вблизи поверхности полушария (рис. 3). Переднюю медиальную часть ПНИГЯ устанавливали впереди сосцевидных ядер между черной субстанцией и ножкой мозга латерально, сводом снизу, медиальной петлей сверху, надсосцевидным ядром и эпендимой 3 желудочка медиально (рис. 4).
Срезы окрашивали крезиловым фиолетовым по методу Ниссля, выявляли GFAP астроцитов (с использованием мышиных антител, клон GA-5, Biocare medical, США, разведение 1:250) и Iba1-антиген мембран клеток амебоидной формы глии (при помощи козьих поликлональных антител к Iba1, AbCam, Великобритания, разведение 1:200). Вторичные биотинилированные антитела применяли из набора VECTASTAIN ABC, США. После проявления антигенов, связанных диаминобензидином, срезы докрашивали гематоксилином Карацци.
Визуальную и морфометрическую оценку клеточных элементов исследованных структур мозга осуществляли в трех последовательных квадратах S 0,01 мм2 у каждого животного в группе (n=15). Для установления морфометрических параметров клеток в ПЯ, содержавшем две нечетко разграниченные части – ядерную и скорлуповую (Paxinos G. and Watson C., 1998), был выбран наиболее широкий вентромедиальный подотдел. В последнем плотность расположения клеток этих двух частей визуально различалась в наименьшей степени. Клетки в вентромедиальном подотделе ПЯ исследовали на площади 0,01 мм2 в семи последовательных квадратах.
Особенности строения прилежащего ядра переднего мозга
Деформированный контур поверхности этих темных нейронов в ряде участков был нечетким; в цитоплазме многих клеток этого вида слабо выделялись грубые темные базофильные комочки. В теле этих клеток также слабо выделялся деформированный контур поверхности ядра и ядрышко. Многие темные сморщенные нейроны были объединены в пары с другими нейронами, были окружены клетками-сателлитами и часто располагались вблизи стенки кровеносного капилляра.
Доля темных сморщенных клеток после ишемии увеличилась 9,1–13,4 раза по сравнению с их долей в контролях (до величины 36,3±2,4; р 0,05) и, таким образом, клетки данного типа в ПЦинК при ишемии стали преобладающей формой потенциально жизнеспособных нейронов (см. табл. 6).
Наружный контур тела клетки-«тени» обычно был нечетким, «размытым», деформированным по типу набухания или сморщивания, у части клеток не определялся. Теневидные нейроны часто имели вид деформированных фрагментов ядра, содержащих просветленные остатки нуклеоплазмы. Иногда клетки-«тени», находясь в начале гибели, содержали набухшие ядра, отличались от ядер набухших гипохромных клеток размытыми контурами ядерной оболочки, повышенной прозрачностью ядер и участками отсутствия эухроматина. Клетки-«тени» могли входить в состав пар и групп нейронов наряду с жизнеспособными клетками, располагаться вблизи стенки капилляров, однако визуально чаще на значительно большем расстоянии от стенки капилляров, чем остальные формы поврежденных нейронов. Последние могли располагаться между ними и стенкой сосуда. Вблизи теневидных нейронов клетки-сателлиты обычно отсутствовали, однако нередко располагались микроглиоциты, что подтверждается при выявлении их Iba-1 антигена (рис. 15). Доля теневидных клеток ПЦинК при ишемии возросла в 5,8–6,6 раза по сравнению с их долей в группах контроля (р 0,05), достигнув величины, почти равной половине потенциально жизнеспособных и жизнеспособных клеток (48,5±2,0). Клетки-сателлиты в ПЦинК после ишемии располагались вблизи тел малоизмененных, большинства гипохромных, сморщенных гиперхромных нейронов и их групп. Среди последних были различимы светлые и темные разновидности тел олигодендроцитов, так и тела астроцитов, выявленные в том числе при окрашивании GFAP (см. рис. 14б).
Расстояние между телами маломодифицированных, набухших нейронов и стенкой капилляра после ишемии сократилось, по сравнению с параметром в группах контроля, в 3,3–4,1 раза (р 0,05; см. табл. 7). Доля нейронов разных фенотипов, объединенных в пары, при ишемии, а также глиоцито-нейрональный индекс, по сравнению с этими величинами в контрольных группах значительно возросли (р 0,05).
При окрашивании по Нисслю были различимы тела астроцитов, обычно обладавшие звездчатой формой, содержавшие округлое или овальное ядро и светлый ободок цитоплазмы, переходящий на периферии в основание главных отростков. Тела астроцитов визуально были в 1,5–4 раза мельче тел нейронов. Ядро астроцитов было светлее, чем у клеток в группах контроля, обычно почти прозрачным и однородным, поскольку эухроматин не обнаруживался. Контуры ядерной оболочки были четкими и ровными, ядрышко располагалось вблизи внутренней поверхности кариотеки.
Многие астроциты являлись клетками-сателлитами для набухших, темных сморщенных и маломодифицированных клеток. Большинство астроцитов одновременно являлись также клетками перивазальной формы глии, поскольку располагались вблизи стенки кровеносных капилляров, ориентируясь вдоль этой стенки. Друг с другом тела астроцитов обычно пары не образовывали.
В срезах ПЦинК, окрашенных для выявления промежуточного филамента астроцитов, тела последних также характеризовались отеком цитоплазмы и ядра, разреженностью, фрагментацией и смещением GFAP+ материала к одной из сторон клеточного тела (см. рис. 14б). Протеин во многих главных отростках выглядел более грубым, чем в группах контроля, комковатым и прерывистым, смещенным к телу клетки. Вследствие этого отростки, оказавшиеся в плоскости среза, выглядели более короткими. Участки разрыхленности или тонкопетлистого строения протеина в отростках астроцитов, характерные клеткам в группах контроля, отсутствовали. Уровень экспрессии GFAP в концевой части отростков астроцитов и периваскулярных глиальных мембранах был снижен, протеин в этих частях клеток выглядел истонченным, прерывистым и в наибольшей части данных сруктур отсутствовал. GFAP многих отростков клеток, был вытянут в направлении стенки ближайшего капилляра или прилежал к ней, формируя перикапиллярную глиальную мембрану. Тела астроцитов, расположенные вблизи сосудов, также были ориентированы параллельно их стенке.
Количество астроцитов в ПЦинК при ишемии не различалось с их числом в группах контроля (табл. 8). Площадь тел астроцитов, по сравнению с контролями, возросла в 1,4–1,5 раза (р 0,05). Расстояние между телами астроцитов и стенкой капилляра, установленное как при обзорном окрашивании клеток, так и при выявлении их GFAP, сократилось в 4,1–14,6 раза (р 0,05).
Микроглиоциты в ПЦинК при переживании ишемии обладали признаками трансформации в клетки амебоидной формы. Их тела были увеличены в размерах и изменены в форме. Клетки приобрели округлую, овальную, веретеновидную, звездчатую, треугольную формы (см. рис. 14а и 15). При окраске их Iba-1 антигена маркер был выявлен в составе их утолщенных главных отростках, расположенных вдоль оси миграции клеток. Многие из этих клеток были удалены от стенки кровеносных капилляров и окружали тела измененных нейронов (теневидных, гипохромных и пикноморфных).
Фармакологическая коррекция метапротом постишемичес-ких изменений клеток исследованных отделов мезокортико-лимбической дофаминергической системы
Вблизи тел малоизмененных, гипохромных, сморщенных гиперхромных нейронов и их групп в ПЦинК после ишемии и лечении метапротом часто располагались клетки-сателлиты. Среди последних были различимы как светлые и темные формы тел олигодендроцитов, так и тела астроцитов, выявленные в том числе и при окрашивании GFAP (см. рис. 23 а,б,в; табл.11).
Глиоцито-нейрональный индекс после ишемии и терапии метапротом был в 1,3 раза меньше, чем после ишемии (р 0,05), но в 2,5 раза выше, чем в группах контроля (р 0,05).
В срезах ПЦинК, окрашенных методом Ниссля, обнаруживались тела астроцитов звездчатой формы, которые выглядели в 1,5–2,5 раза мельче, чем тела нейронов. Светлое ядро астроцитов обладало чаще правильной округлой или овальной формой, четкими контурами ядерной оболочки; в нем был различим хроматин, преимущественно в виде тонкой сеточки, а также одно, реже два отчетливых ядрышка, расположенных как эксцентрично, так и в центральной части. Цитоплазма имела вид светлого ободка, расширяющегося вблизи основания главных отростков.
Тела некоторых астроцитов располагались попарно, причем между наружной поверхностью оболочки ядер этой пары клеток цитоплазма различима не была. При окрашивании на GFAP между ядрами многих объединенных клеток промежуточный филамент также не определялся.
Экспрессия GFAP в срезах ПЦинК была интенсивной и непрерывной в перинуклеарной части цитоплазмы астроцитов, основании главных отростков и перикапиллярой глиальной мембране. В областях основания главных отростков и прилежащей части клеточного тела астроцитов наблюдались разрастание, сгущение и слияние GFAP этих частей клеток, в результате которых они выглядели более крупными, чем в контролях, и деформированными.
Главные отростки астроцитов, срезанные продольно и косо, содержали интенсивно окрашенную непрерывную сеть промежуточного филамента и были ориентированы в направлении тел нейронов и стенки капилляра.
Вблизи тел нейронов многие отростки астроцитов разветвлялись и охватывали поверхность перикариона. GFAP-материал, составляющий пери-капиллярную глиальную мембрану, был визуально утолщен; в концевой части отростков клеток волокна филамента образовывали участки сгущений.
Число астроцитов в ПЦинК после ишемии и терапии метапротом было незначительно увеличено, по сравнению с контролями (табл. 12). Расстояние между стенкой капилляра и телами астроцитов, установленное как при окраске по Нисслю, так и при выявлении GFAP, по сравнению с этой величиной при ишемии, было увеличено в 5–6,4 раза и значительно не различалось с этой величиной у крыс в группах контроля (р 0,05). Площадь тел астроцитов после ишемии и терапии была в 1,4 больше, чем площадь клеток у крыс в контроле (р 0,05), но значительно не различалась с этим параметром у крыс после ишемии.
Микроглиоциты ПЦинК, выявляемые в этой части эксперимента при окрашивании по Нисслю, располагались преимущественно вблизи тел патологически измененных нейронов, главным образом теневидных и, следовательно, являлись нейронофагами. Визуально они обладали более крупными размерами, чем в контроле, содержали гиперхромное округлое или бобовидное ядро, были окружены ободком просветленной цитоплазмы, часто образующей выступы в направлении поврежденных клеток.
Эндотелиоциты капилляров ПЦинК после ишемии и терапии метапротом по своему количеству и строению ядра визуально не различались с клетками в контролях. Их ядро было мелким и гиперхромным, в нем часто были различимы тонкий темный контур ядерной оболочки и ядрышко. Число эндотелиоцитов после ишемии и лечения, по сравнению с их количеством при ишемии без лечения, было уменьшено в 1,4 раза (р 0,05; табл. 13). Вместе с тем, относительно контролей эта величина значительно изменена не была (р 0,05). Площадь ядер этих клеток после ишемии и лечения также была значительно уменьшена по сравнению с параметром при ишемии (в 2,3 раза; р 0,05) и была близка параметрам клеток в группах контроля (р 0,05).
Через 7 суток после лигирования обеих сонных артерий и ежедневного внутрибрюшинного введения метапрота в ядерных центрах вентральной части среднего мозга, расположенной за пределами области выраженного ограничения кровотока, тела большинства нейронов, цитоплазма которых интенсивно базофильно окрашивалась методом Ниссля (рис. 24), визуально были малоизмененными.