Содержание к диссертации
Введение
2. Введение 5
2.1. Актуальность темы исследования 5
2.2. Степень разработанности темы .6
2.3. Цель и задачи работы .8
2.4. Научная новизна работы 9
2.5. Апробация результатов 10
3. Обзор литературы .10
3.1. Жасмоновая/жасминовая кислота 10
3.1.1. Жасмоновая кислота в клетках растений .10
3.1.2. Действие жасмоновой кислоты на клетки животных 14
3.2. Абсцизовая кислота .22
3.2.1. Абсцизовая кислота в клетках растений 22
3.2.2. Действие абсцизовой кислоты на клетки животных .26
3.3. Гиббереллиновая кислота .32
3.3.1. Гиббереллиновая кислота в клетках растений 32
3.3.2. Действие гиббереллиновой кислоты на клетки животных .33
4. Материалы и методы 36
4.1. Материалы .36
4.1.1. Оборудование 36
4.1.2. Расходные материалы .36
4.1.3. Биологический материал 37
4.1.4. Реагенты .37
4.2. Методы 40
4.1.1. Культивирование клеток 40
4.1.2. Оценка жизнеспособности клеток 40
4.1.3. Иммуноцитохимическое окрашивание 40
4.1.4. Цитохимическое окрашивание .41
4.1.5. Морфометрический анализ аппарата Гольджи .41
4.1.6. Трансмиссионная электронная микроскопия 41
4.1.7. Оценка интенсивности белкового синтеза .42
4.1.8. Белковый электрофорез с иммуноблоттингом 42
2 4.1.9. Компьютерная обработка изображений 43
4.1.10. Статистическая обработка результатов .44
5. Результаты 44
5.1. Оценка жизнеспособности клеток НаСаТ и А431 с помощью МТТ-теста..44
5.2. Анализ состояния митохондрий в клетках НаСаТ при действии ЖК, АБК и ГК .47
5.2.1. Цитохимическое выявление активных и неактивных митохондрий .47
5.3. Анализ состояния митохондрий в клетках А431 при действии ЖК, АБК и
ГК 49
5.3.1. Цитохимическое выявление активных и неактивных митохондрий .49
5.4. Характеристика состояния синтетической и секреторной системы (ЭПР и аппарата Гольджи) клеток НаСаТ при действии ЖК, АБК и ГК 51
5.4.1. Иммуноцитохимическое выявление эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и аппарата Гольджи 51
5.4.2. Морфометрический анализ аппарата Гольджи 53
5.4.3. Электронная микроскопия .54
5.5. Характеристика состояния синтетической и секреторной системы (ЭПР и
аппарата Гольджи) клеток А431 при действии ЖК, АБК и ГК 56
5.5.1. Иммуноцитохимическое выявление ЭПР и аппарата Гольджи 56
5.5.2. Морфометрический анализ аппарата Гольджи .58
5.5.3. Электронная микроскопия
5.6. Оценка интенсивности белкового синтеза в клетках НаСаТ при действии ЖК, АБК и ГК 61
5.7. Оценка интенсивности белкового синтеза в клетках А431 при действии ЖК, АБК и ГК 64
5.8. Характеристика органелл эндосомно-лизосомного компартмента в клетках НаСаТ при действии ЖК, АБК и ГК
5.8.1. Цитохимическое окрашивание .67
5.8.2. Электронная микроскопия 70
3 5.9. Характеристика органелл эндосомно-лизосомного компартмента в клетках А431 при действии ЖК, АБК и ГК 78
5.9.1. Цитохимическое окрашивание .78
5.9.2. Электронная микроскопия 80
5.10. Анализ уровня синтеза инволюкрина в клетках НаСаТ при действии ЖК,
АБК и ГК 87
5.10.1. Иммуноцитохимическое выявление инволюкрина .88
5.10.2. Иммуноблоттинг 90
5.11. Анализ уровня синтеза инволюкрина в клетках А431 при действии ЖК,
АБК и ГК 92
5.11.1. Иммуноцитохимическое выявление инволюкрина 92
5.11.2. Иммуноблоттинг 94
6. Обсуждение .96
6.1. Фитогормоны и барьерные ткани 96
6.2. Жизнеспособность кератиноцитов после «мягкого» воздействия фитогормонами 100
6.3. Фитогормоны и дифференцировка кератиноцитов .102
6.3.1. Корнификация 102
6.3.2. Роль эндосомно-лизосомного компартмента в дифференцировке кератиноцитов. Влияние фитогормонов 102
6.3.3. Влияние фитогормонов на синтез инволюкрина в нормальных и опухолевых кератиноцитах .106
6.4. Фитогормоны и стресс вакуолярной системы 109
7. Заключение .112
8. Выводы 115
9. Список сокращений 116
10. Список цитируемой литературы
- Цель и задачи работы
- Действие жасмоновой кислоты на клетки животных
- Биологический материал
- Цитохимическое выявление активных и неактивных митохондрий
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Растительные гормоны (фитогормоны) –
органические вещества различной химической природы, выделяемые клетками растений и действующие в низкой концентрации как регуляторы их роста и дифференцировки. По химическому строению и спектру действия эти вещества подразделяются на классы. Жасмоновая кислота (ЖК), член семейства жасмонатов, и абсцизовая кислота (АБК), относящаяся к семейству абсцизинов, являются гормонами стресса, выделяющимися в ответ на биотический и абиотический стресс (Wang and Wu, 2013; Lee and Luan, 2012). Синтез АБК сопровождается переходом растения в состояние покоя (Lee and Luan, 2012). Гиббереллиновая кислота (ГК3) относится к семейству гиббереллинов и является стимулятором роста растений. Биологически активные вещества растительного происхождения всегда привлекали большой интерес, в первую очередь, в связи с их возможным применением в медицине. Они входят в состав многих лекарственных препаратов, а некоторые являются самостоятельными лекарственными препаратами. Растительные гормоны также относятся к биологически активным веществам, и в связи с этим вопрос о том, насколько их активность проявляется по отношению к клеткам других организмов, и, в первую очередь, человека, имеет большое теоретическое и практическое значение. Фитогормоны находят широкое применение в сельском хозяйстве в качестве стимуляторов цветения, ускорителей созревания и др. Продукты растительного происхождения, содержащие фитогормоны, включаются в пищевую цепь и, таким образом, животные и человек находятся под действием малых доз фитогормонов. Исследования последних лет демонстрируют, что фитогормоны не являются нейтральными по отношению к клеткам животного происхождения, и реакция на них может носить как положительный, так и отрицательный характер. Однако объективные критерии оценки этого влияния до сих пор отсутствуют. Это ставит вопрос о специфичности действия растительных гормонов по отношению к клеткам разного тканевого происхождения, а также нормальным и патологически измененным клеткам. Сопоставление реакции нормальных и опухолевых клеток на действие различных по структуре и функциям растительных гормонов является одним из путей обнаружения новых препаратов для лечения онкологических заболеваний. Следовательно, исследования, направленные на изучение реакции клеток на действие растительных гормонов, являются перспективными с точки зрения как фундаментальной, так и прикладной науки.
Степень разработанности темы. Проведенные ранее исследования показали, что
некоторые фитогормоны обладают цитотоксическим действием по отношению к определенным типам опухолевых клеток, и это дает основания рассматривать их как потенциальные
противоопухолевые агенты. К таким веществам относятся жасмонаты и АБК (Fingrut and Flescher, 2002; Li et al., 2011; Cesari et al, 2014). Для жасмонатов в некоторых типах клеток выявлены клеточные и молекулярные мишени действия (Flescher, 2007). Показано, что АБК синтезируется клетками млекопитающих и способна оказывать влияние на их секреторную активность (Bruzzone et al., 2012). ГК является наименее изученной с точки зрения влияния на клетки животных и человека, и данные немногочисленных исследований противоречивы.
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в исследовании влияния на секреторно-синтетическую систему (ЭПР и аппарат Гольджи) культивируемых клеток человека (нормальных иммортализованных кератиноцитов HaCaT и эпидермоидной карциномы A431) трех отличающихся по направленности действия на растения фитогормонов - ЖК, АБК и ГК.
Задачи: 1) Определить чувствительность нормальных кератиноцитов человека HaCaT и клеток эпидермоидной карциномы человека A431 к ЖК, АБК и ГК и установить субтоксические концентрации этих фитогормонов.
2) Установить, как органеллы секреторно-синтетической системы реагируют на
субтоксические концентрации ЖК, АБК и ГК, и есть ли характерные отличия в реакции
нормальных и опухолевых клеток.
3) Сравнить структурно-функциональные изменения, индуцируемые данными
растительными гормонами в нормальных и опухолевых клетках.
Научная новизна. В работе впервые продемонстрировано, что компоненты синтетической и секреторной системы нормальных и опухолевых клеток эпидермоидного происхождения являются общей мишенью для действия трех растительных гормонов. Показано, что морфологически сходный характер ответа клеток на фитогормоны, выражающийся в гипертрофии аппарата Гольджи, имеет разную функциональную основу. Установлено, что некоторые растительные гормоны могут повышать уровень белкового синтеза в нормальных и опухолевых клетках. Получены данные об усилении экспрессии маркера дифференцировки кератиноцитов инволюкрина под действием растительных гормонов в опухолевых клетках. Впервые показано, что в ответ на действие фитогормонов происходит изменение состояния везикул кислого компартмента, одним из проявлений которого является увеличение продукции аутофагосом и аутофагических вакуолей.
Теоретическая и практическая ценность работы. Данная работа позволяет получить важную новую информацию о процессах, вызываемых растительными гормонами в клетках человека. Полученные в ходе работы результаты актуальны и имеют не только теоретический
интерес, но и важное значение с биомедицинской точки зрения. Результаты работы могут быть использованы в дальнейших исследованиях, направленных на изучение влияния растительных гормонов на клетки животных, включая разработку подходов к противоопухолевой терапии, связанных с дифференцировкой опухолей эпидермоидного происхождения.
Методология и методы исследования. В работе применялись как классические, так и современные методы исследования: культивирование эукариотических клеток, МТТ-тест, иммуноцитохимическое и цитохимическое выявление клеточных органелл, морфометрический анализ, методы флуоресцентной, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и электронной микроскопии, метод Click-iT для оценки уровня общего белкового синтеза, электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле, иммуноблоттинг.
Личное участие автора. Вся работа диссертанта была выполнена самостоятельно и включала в себя анализ научной литературы, разработку экспериментальной части, получение и обработку результатов, статистический анализ данных.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов подтверждается анализом современного состояния вопроса, адекватностью использованных методических подходов, статистическим анализом полученных данных. Материалы работы были представлены на 4 всероссийских и 1 международной конференции: XVII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010» (Москва, 12-15 апреля 2010 г.); VIII Всероссийская конференция по патологии клетки (Москва, 11-12 ноября 2010 г.); I Всероссийская конференция «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет» (Санкт-Петербург, 11-13 октября 2011 г.); VIII конференция молодых ученых института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (29-30 ноября 2012 г.); II Всероссийская конференция «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет» (Санкт-Петербург, 20-22 октября 2015 г.).
Структура диссертации. Работа изложена на 128 листах машинописного текста и дополнена иллюстративным материалом в количестве 40 рисунков и 3 таблиц. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, их обсуждения, заключения, выводов, списка сокращений и библиографического списка (содержит 135 источников).
Цель и задачи работы
Проведенные ранее исследования показали, что некоторые фитогормоны обладают цитотоксическим действием по отношению к опухолевым клеткам, и это дает основания расценивать их как потенциальные противоопухолевые агенты. К таким веществам относятся салициловая кислота, производные жасмонатов, АБК, брассиностероиды и цитокинины (Лазарева и др., 2007; Havlicek et al., 1997; Schwenger et al., 1997; Fingrut and Flescher, 2002; Flescher, 2007; Li et al., 2011; Cesari et al, 2014). Среди растений, содержащих относительно высокие уровни жасмонатов, называют пять, которые обладают доказанной противоопухолевой активностью in vivo и in vitro: олива (Olea), жасмин (Jasminum), имбирь (Zngiber); жимолость японская (Lonicera japonica) и розмарин лекарственный или обыкновенный (Rosmarinus officinalis L.) (Cohen и Flescher, 2009). Экстракты этих растений использовались в противоопухолевой терапии задолго до того, как было получено объяснение их действия; содержание ЖК в этих растениях на четыре порядка выше, чем в поврежденных листьях томата или табака (Wasternack and Hause, 2013). Однако пока еще неясно, насколько специфическим является влияние фитогормонов на опухолевые клетки, на какие мишени направлено их влияние и каковы возможные молекулярные механизмы их действия.
При изучении действия растительных гормонов на клетки млекопитающих было установлено, что некоторые гормоны оказывают влияние на секреторную активность клеток. В частности, АБК значительно уменьшает отложение коллагена в фибробластах, взятых у больных системным склерозом; при этом увеличивается активность матриксной металлопротеиназы 1, и уменьшается уровень экспрессии тканевого ингибитора металлопротеиназы ТГМР-1 (Bruzzone et al., 2012). Эти данные указывают на то, что АБК может подавлять синтетическую активность клеток с признаками патологии. Однако ранее этой же группой авторов было показано, что АБК усиливает секрецию инсулина в -клетках поджелудочной железы человека в ответ на стимуляцию глюкозой (Bruzzone et al., 2008). Таким образом, характер влияния АБК на разные клетки млекопитающих может быть антагонистическим, и в связи с этим возникает вопрос о направленности действия АБК на нормальные клетки и клетки с признаками патологии, а также об особенностях и специфичности реакции на АБК клеток разного происхождения. Как известно, патологии секреции лежат в основе многих заболеваний, таких как диабет I и II типа, а также многих иммунных и нейродегенеративых заболеваний, поэтому возможности коррекции этих патологий с помощью природных низкомолекулярных соединений требуют детального изучения.
Такое вещество как АБК представляет особый интерес еще и потому, что ее синтез происходит не только у растений, водорослей, цианобактерий и грибов, но и у животных и человека. АБК может вырабатываться клетками иммунной и сердечно-сосудистой системы, мезенхимальными стволовыми клетками, клетками поджелудочной железы, причем как в физиологических условиях, так и при патологии (Bruzzone et al., 2012). В гранулоцитах и кератиноциах человека внутриклеточная концентрация АБК возрастает при УФ облучении, а затем происходит ее освобождение из клеток, что, в свою очередь, может запускать воспалительные реакции в коже в ответ на облучение (Bruzzone et al., 2012). В нормальных условиях, синтезированная клетками животных АБК, регулирует рост и развитие клеток, а иммунный ответ на различные стимулы при участии АБК контролируется с помощью сигнальных механизмов, сходных с теми, которые найдены у растений (Scarf et al., 2008).
В то же время, мало известно о влиянии ГК на клетки животных и человека. Есть фрагментарные данные о том, что однократное применение ГК усиливает дегрануляцию тучных клеток в коже, на основании чего было сделано предположение о том, что растительные регуляторы роста могут вносить вклад в развитие аллергических реакций у человека (Erin et al., 2008). Кроме этого, ГК может оказывать токсическое действие на клетки млекопитающих, включая индукцию аденокарцином (el-Mofty et al., 1994), оксидативного стресса (Celik et al., 2007), воспалительных процессов в коже и мочевом пузыре (Erin et al., 2008).
Таким образом, характер влияния растительных гормонов на клетки животных и человека может быть достаточно широким. Такие растительные гормоны, как АБК, не только вырабатываются клетками животных, но и выделяются ими во внеклеточную среду, распознаются другими клетками организма и запускают в этих клетках воспалительные реакции. Кроме этого, в одних типах клеток синтетическая и секреторная активность в ответ на действие АБК усиливается, а в других – падает. В связи с этим возникает вопрос о том, какие изменения при этом происходят в клетках-мишенях, и зависит ли характер реакции от типа клеток и/или их патологического состояния. Следует отметить, что действие других растительных гормонов на синтетическую и секреторную активность клеток не изучено.
Цель нашей работы состояла в том, чтобы исследовать влияние на секреторно-синтетическую систему (ЭПР и аппарат Гольджи) культивируемых клеток человека трех отличающихся по направленности действия на растения фитогормонов - ЖК, АБК и ГК, два из которых (АБК и ГК) являются условными антагонистами, и два (ЖК и АБК) – гормонами, вырабатывающимися у растений в условиях стресса.
В качестве объектов исследования были выбраны нормальные и опухолевые клетки эпителиального происхождения – иммортализованные кератиноциты человека HaCaT и линия эпидермоидной карциномы человека А431. Выбор объектов был обусловлен тем, что эпителий (кожный, кишечный, дыхательный) является естественным барьером между внешними факторами и организмом человека. Также известно, что кератиноциты могут вырабатывать АБК в качестве провоспалительного цитокина (Bruzzone et al., 2012). Таким образом, кератиноциты являются уникальным объектом исследования, потому что они не только вырабатывают АБК, но на нее же и реагируют, то есть относятся к категории АБК-чувствительных клеток (ABA-sensing/sensitive cells) (Tossi et al., 2012). Задачи исследования: 1) Определить чувствительность нормальных кератиноцитов человека HaCaT и клеток эпидермоидной карциномы человека A431 к ЖК, АБК и ГК и установить субтоксические концентрации этих фитогормонов. 2) Установить, как органеллы секреторно-синтетической системы реагируют на субтоксические концентрации ЖК, АБК и ГК, и есть ли характерные отличия в реакции нормальных и опухолевых клеток. 3) Сравнить структурно-функциональные изменения, индуцируемые данными растительными гормонами в нормальных и опухолевых клетках.
Действие жасмоновой кислоты на клетки животных
Многие гены растений, которые участвуют в ответе на изменения условий окружающей среды, регулируются ЖК. Процесс высвобождения линоленовой кислоты из мембраны хлоропластов и дальнейшего ее превращения в ЖК аналогичен сигнальным путям в клетках млекопитающих, где выход арахидоновой кислоты из мембраны приводит к синтезу эйкозаноидов, таких как простагландины (Needleman et al., 1986). Простагландины А и J, основу структуры которых, как и для жасмонатов, составляет циклопентановое кольцо, являются потенциальными ингибиторами пролиферации клеток in vitro и способны к подавлению новообразований in vivo (Gorospe et al., 1996). Как и многие простагландины, искусственные аналоги жасмонатов вызывают значительный противовоспалительный эффект, ингибируя синтез провоспалительных факторов – окиси азота (NO), интерлейкина 6 (IL-6) и фактора некроза опухолей TNF- (Dang et al., 2008). Поэтому возможно, что показанная в ряде случаев противоопухолевая активность жасмонатов объясняется сходством с простагландинами. Исследование влияния разных концентраций ЖК (0.5–3 мМ) на культивируемые трансформированные клетки человека различного тканевого происхождения (клетки Molt-4Т лимфобластической лейкемии, SK-28 меланомы, LNCaP андроген-чувствительной аденокарциномы простаты, MCF7 карциномы молочной железы) показало, что наиболее чувствительными к действию ЖК оказались клетки Molt-4, а наименее чувствительными – клетки MCF7 (Fingrut and Flescher, 2002). Кроме этого, характер действия зависел от концентрации ЖК: при максимальной концентрации (3 мМ) погибали 90 % клеток в популяции Molt-4, более 50 % клеток SK-28, более 30 % клеток LNCaP и 20 % клеток MCF7. Исследование механизмов клеточной гибели показало, что ЖК индуцировала апоптотическую и некротическую гибель в клетках Molt-4, но при этом не оказывала влияния на нормальные лимфоциты человека (Fingrut and Flescher, 2002). Эти данные подтверждаются и другими авторами (Rotem et al., 2005), которые показали, что ЖК вызывает деполяризацию митохондриальных мембран в клетках Molt-4 и проявляет цитотоксичность по отношению к лимфоцитам из периферической крови больных хронической лимфобластической лейкемией (CLL). При этом, ЖК, обладая цитотоксическим эффектом на клетки лимфобластической лейкемии, не оказывала влияния на нормальные лимфоциты человека даже ex vivo в смешанной популяции лейкемических и нормальных периферических одноядерных клеток крови (peripheral blood mononuclear cells - PBMCs) пациентов с хронической лимфобластической лейкемией (Fingrut and Flescher, 2002; Cohen and Flescher, 2009). На основании полученных 14 данных было сделано заключение, что ЖК может оказывать цитотоксический эффект на определенные типы опухолевых клеток.
Во многих исследованиях, наряду с ЖК, изучали влияние ее производных - МЖ и цис-жасмона. Было показано, что эти вещества избирательно воздействуют на опухолевые клетки и не оказывают влияния на нормальные клетки. Согласно результатам многочисленных экспериментов, МЖ превосходит цис-жасмон и ЖК по цитотоксическому действию (Cesari et al, 2014). Так, при сравнении активности ЖК и МЖ было установлено, что у линии макрофагов DH82, полученных от собак со злокачественной гистиоцитомой, ЖК в концентрации 3 мМ вызывает гибель 36 % клеточной популяции, а МЖ в той же концентрации вызывает гибель 82.2 % клеток (Hernandes et al., 2012). Механизм действия МЖ связан с выходом цитохрома с из митохондрий и открытием порового комплекса PTPC (permeability transition pore complex) (Rotem et al., 2005), что вызывает индукцию апоптотической гибели клеток. Кроме того, было установлено, что ЖК и МЖ в диапазоне концентраций 1—3 мМ цитотоксичны для клеток В-лимфомы, экспрессирующих белок р53 дикого типа (клон 29М6.2) и клеток В-лимфомы с нарушенной экспрессией этого гена (клон 29М6.10), устойчивых к радиомиметическим агентам (Fingrut et al., 2005). В клетках, экспрессирующих р53, не наблюдали повышения содержания соответствующего белка при воздействии МЖ, и гибель проходила, в основном, по апоптотическому типу; в опухолях с нарушенной экспрессией р53 не обнаружили признаков раннего апоптоза, следовательно, гибель клеток объясняется другим механизмом (Fingrut et al., 2005). В обоих типах клеток гибель под действием МЖ сопровождалась быстрым уменьшением количества АТФ за счёт блокирования окислительного фосфорилирования в митохондриях (Fingrut et al., 2005). В клеточных линиях рака простаты, не экспрессирующих p53 и имеющих высокий уровень противоапоптотических белков семейства Bcl2, МЖ и цис-жасмон индуцировали апоптоз, перекрывая эффект противоапоптотических белков (Ezekwudo et al., 2007; Yeruva et al., 2008; Cohen and Flescher, 2009).
Также было показано, что ЖК, МЖ и цис-жасмон индуцировали снижение уровня клеточной пролиферации в клетках нейробластомы линии SH-SY5Y, но не оказывали влияния на пролиферативную активность нормальных клеток линии HEK293 (эмбриональных клеток почек человека) (Tong et al., 2008). Клеточный цикл клеток нейробластомы SH-SY5Y при воздействии жасмонатов останавливался на границе фаз цикла G2/M (Tong et al., 2008). Авторы указывают на то, что противоопухолевое действие жасмонатов на клетки нейробластомы связано со снижением активности PCNA (proliferating cell nuclear antigen) и протоонкогена N-myc (экспрессирующегося примерно в 25—30 % нейробластом и ассоциированного с тяжелой
Члены семейств AKR1 и AKR7 суперсемейства альдо-кеторедуктаз (AKR), катализирующих восстановление многих ароматических и алифатических альдегидов и кетонов, являются веществами, опосредующими опухолевую патологию (Cesari et al, 2014). Показано, что они вовлечены в развитие некоторых опухолей у человека и грызунов, таких как первичные злокачественные опухоли печени, легких, толстой кишки, простаты и молочной железы (Davies et al., 2009). Оказалось, что ЖК и МЖ способны ингибировать четыре изоформы AKR1C человека (Davies et al., 2009).
Молекулой-мишенью для МЖ в митохондриях опухолевых клеток является гексокиназа -инициирующий фермент гликолитического пути (Cohen и Flescher, 2009). Ее изоферменты – гексокиназа I и гексокиназа II – путем гидрофобного взаимодействия могут связываться с митохондриальными потенциал зависимыми анионными каналами VDAC (voltage-dependent anion channel) (один из компонентов РТРС) на наружной мембране митохондрий (Cohen и Flescher, 2009; Cesari et al, 2014). В опухолевых клетках, связанные с митохондриями гексокиназа и VDAC гиперэкспрессированы; эта гиперэкспрессия, как предполагается, является фундаментальным аспектом метаболизма аэробного гликолиза опухолевых клеток и вносит существенный вклад в скорость их роста и выживания (Cohen и Flescher, 2009; Cesari et al, 2014). Связь гексокиназы с VDAC защищает опухолевые клетки от пермеабилизации наружной митохондриальной мембраны, которая является точкой невозврата, ведущей к клеточной гибели (Cesari et al, 2014). Было показано, что МЖ специфически связывается с гексокиназой млекопитающих и разрывает ее взаимодействие с VDAC, что приводит к отделению гексокиназы от митохондрий и ведет к нарушению вклада гликолиза в окислительное фосфорилирование (Cohen и Flescher, 2009). Это, в свою очередь, вызывает значительные биоэнергетические нарушения в опухолевых клетках: высвобождение цитохрома с, блокирование окислительного фосфорилирования, ингибирование синтеза АТФ, падение уровня внутриклеточного АТФ, остановку АТФ-зависимых мембранных помп (Cohen и Flescher, 2009; Cesari et al, 2014). Индуцированное МЖ отделение гексокиназы от митохондрий нарушает проницаемость митохондриальной мембраны и энергетический баланс клетки в целом, что ведет к набуханию и разрыву митохондрий и клеточной гибели апоптозом или некрозом (Cohen и Flescher, 2009; Raviv et al, 2013; Cesari et al, 2014). Так, например, МЖ
Биологический материал
Механизм действия АБК на АБК-чувствительные клетки изучался на разных клеточных моделях, в том числе и гранулоцитах человека. Показано, что на начальной стадии, АБК взаимодействует с трансмембранным участком и активирует G-белок, чувствительный к пертуссиновому токсину (Bruzzone et al., 2007). Это активирует фосфолипазу С и приводит к быстрому увеличению диацилглицерина и инозитолтрифосфата (Bruzzone et al., 2007). Диацилглицерин активирует протеинкиназу С, которая стимулирует аденилатциклазу, а та, в свою очередь, увеличивает внутриклеточную концентрацию cAMP; увеличение уровня cAMP активирует протеинкиназу A, что приводит к фосфорилированию ADPRC и быстрому усилению ее активности; увеличение концентрации ADPRC, в свою очередь, приводит к повышению уровня cADPR, а это индуцирует приток Са2+ с помощью одного или двух механизмов – высвобождения Са2+ из депо через рианодиновые рецепторы или открытия Са2+ каналов на плазматической мембране (Bruzzone et al., 2007). Паракринная сигнализация между -клетками поджелудочной железы и клетками воспаления признана патогенетическим механизмом, лежащим в основе метаболического синдрома и сахарного диабета II типа (Li et al., 2011). Как было сказано ранее, АБК усиливает секрецию инсулина в -клетках поджелудочной железы мыши (клетки линии RIN-m) и человека (клетки линии INS-1) в ответ на стимуляцию глюкозой. В этих случаях секреция инсулина подавляется пертуссиновым токсином, а также ингибиторами системы ADPRC/cADPR и специфическим ингибитором протеинкиназы А, что подтверждает участие cADPR и cAMP в АБК-опосредованной сигнализации (Bruzzone et al., 2008).
Таким образом, у млекопитающих АБК является эндогенным фактором, который стимулирует активацию воспалительной реакции у гранулоцитов и кератиноцитов, и освобождение инсулина из -клеток поджелудочной железы. Кроме этого, у АБК-чувствительных клеток аутокринная АБК повышает функциональную активность, специфическую для каждого клеточного типа, путем сигнального механизма, опосредованного связыванием с рецептором (Bruzzone et al., 2007).
В связи с тем, что АБК синтезируется клетками животных, и клетки реагируют на нее как на про-воспалительный фактор, закономерно встает вопрос о механизме выведения АБК из клеток и АБК-опосредованной сигнализации. Было показано, что АБК связывается с плазматической мембраной многих клеток животных (гранулоцитами человека, моноцитами, кератиноцитами, гладкомышечными клетками аорты человека и другими). В этих клетках не было обнаружено гомолога растительного рецептора PYR/PYL/RCAR и не было выявлено цитозольных рецепторов АБК (Tossi et al., 2012). Однако, было показано, что АБК проявляет
зо свою активность путем взаимодействия с комплексом «пертуссин-токсин чувствительный рецептор G-белок», который связан с плазматической мембраной. Каскадная реакция передачи сигнала включает в себя связывание АБК с этим рецепторным комплексом, активацию cAMP, cADPR и освобождение депонированного Са2+ в цитозоль; следует отметить, что такой же механизм сигнализации осуществляется и в клетках растений (Tossi et al., 2012).
Далее было показано, что для восприятия сигнала от АБК в гранулоцитах и кератиноцитах человека, а также в клетках инсулиномы крысы RIN-m и INS-1, требуется лантионинсинтетаза С-подобный белок 2 (lanthionine synthetase C-like protein 2, LANCL2, NP061167) (Sturla et al., 2009; Li et al., 2011; Bruzzone et al., 2012). Этот белок имеет N-терминальный участок, связанный с плазматической мембраной, и внутриклеточный С-терминальный домен, предположительно связанный с G-белком (Bruzzone et al., 2012). Было показано, что сайленсинг LANCL2 отменяет ответ, индуцированный АБК, в то время как гиперэкспрессия LANCL2 значительно усиливает такой ответ; кроме этого, сайленсинг LANCL2 в кератиноцитах человека ингибирует индуцированную УФ-облучением воспалительную реакцию – образование АФК и NO, освобождение простагландина Е2 и TNF- (Bruzzone et al., 2012). Эти данные указывают на то, что LANCL2 требуется для связывания АБК и активации внутриклеточного каскада, запускающего специфические клеточные реакции. Следовательно, LANCL2 может рассматриваться как рецептор для АБК (Bruzzone et al., 2012). Топология рецептора LANCL2 в мембране, а также возможность участия белков-посредников в АБК-опосредованной сигнализации, в настоящее время является предметом изучения (Bruzzone et al., 2012). Известно, что С-терминальный участок рецептора находится внутри клетки, а сайт связывания с АБК находится вне клетки; большинство исследователей склоняется к тому, что сайт связывания АБК находится на поверхности LANCL2 (Li et al., 2011; Sturla et al., 2011; Bruzzone et al., 2012). Следует отметить, что между рецептором АБК GCR2 у Arabidopsis и LANCL2 человека есть гомология в первичной последовательности (Bruzzone et al., 2012).
Кроме LANCL2, есть еще один рецептор PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor ), который также является ключевым регулятором метаболизма и транскрипционным фактором (Guri et al., 2008). Оказалось, что АБК активирует гены PPAR в преадипоцитах линии 3Т3-L1 in vitro (Guri et al., 2008), а в макрофагах активация PPAR, обусловленная действием АБК, зависит от экспрессии LANCL2 (Bassaganya-Riera et al., 2011).
Гиббереллиновая кислота (ГК3) (рисунок 1) – член семейства гиббереллинов, структурно схожих тетрациклических дитерепеноидных кислот, которые вырабатываются в зеленых растениях и некоторых микроорганизмах (Meleigy and Khalaf, 2009). Гиббереллины стимулируют рост растения путем активации клеточных делений и растяжения, выход почек и семян из состояния покоя, цветение и развитие плода. Помимо этого, гиббереллины вовлечены в широкий спектр реакций, запускаемых в ответ на абиотический стресс (Colebrook et al., 2014). Однако лишь немногие гиббереллины обладают биологической активностью: среди них ГК1, ГК3, ГК4, ГК7, имеющие в основе дитерпеноидную карбоновую кислоту и С3-гидроксильную группу; остальные существуют в виде неактивных форм или деактивированных метаболитов (Davire and Achard, 2013). Считается, что место действия и место синтеза ГК не разобщены, т.е. ГК является аутокринной сигнальной молекулой (Gupta and Chakrabarty, 2013). ГК образуется в пластидах, ЭПР и цитозоле по терпеноидному пути, из геранилгеранил дифосфата (GGDP) (Gupta and Chakrabarty, 2013) (рисунок 6). Две терпеновые синтазы, CPS (ent-Copalyl diphosphate Synthase) и KS (ent-Kaurene Synthase), локализованные в пластидах, обеспечивают конверсию GGDP в тетрациклический гидрокарбоновый промежуточный энт-каурен; энт-Каурен затем конвертируется в ГК12 при участии двух P450s (Gupta and Chakrabarty, 2013).. Первый фермент KO (ent-Kaurene Oxidase) находится во внешней мембране пластид и катализирует последовательное окисление для образования энт-кауреновой кислоты; второй фермент KAO (ent-Kaurenoic Acid Oxidase) находится в ЭПР. Биологически активная ГК4 образуется из ГК12 путем окисления на C-20 и C-3 с помощью GA20ox (GA 20-oxidase) и GA3ox (GA 3-oxidase) соответственно и деактивируется путем эпоксидирования или метилирования (Gupta and Chakrabarty, 2013).
Цитохимическое выявление активных и неактивных митохондрий
Окрашивание клеток А431 флуоресцентными маркерами митохондрий показало, что как в контрольных клетках, так и в клетках после действия растительных гормонов, также есть две суб-популяции митохондрий – активные (рисунок 9, б, д, з, л) и неактивные (зеленые на рисунок 9, в, е, и, м). Для клеток А431 более характерна зональность распределения активных и неактивных митохондрий, чем для клеток HaCaT – неактивные митохондрии формируют скопления в околоядерной области, а активные митохондрии располагаются дистально по отношению к таким скоплениям. Также как в клетках HaCaT, изменения соотношения между активными и неактивными митохондриями ни при одном из воздействий замечено не было. Это позволяет сделать заключение, что субтоксические концентрации ЖК, АБК и ГК не оказывают заметного влияния на снижение синтетической активности митохондрий.
Для того чтобы убедиться в том, что субтоксические концентрации растительных гормонов не вызывают запуска клеточной гибели путем апоптоза с участием митохондрий, мы проанализировали локализацию цитохрома с после действия ЖК, которая оказывает самое большое влияние на жизнеспособность клеток HaCaT и А431. Как показано на рисунке 10, цитохром с локализуется в митохондриях и не выходит в цитозоль. Следовательно, в субпопуляции клеток, которые сохраняют жизнеспособность при действии ЖК, не происходит активации апоптоза по митохондриальному механизму.
Митохондрии в клетках линии А431 до и после инкубации с растительными гормонами. а, б, в- контроль, г, д, е – инкубация с ЖК, ж, з, и – инкубация с АБК, к, л, м – инкубация с ГК. а, г, ж, к – окрашивание всех митохондрий митотрекером зеленым, б, д, з, л -окрашивание активных митохондрий митотрекером оранжевым, в, е, и, м – совмещение изображений. Масштабный отрезок – 10 мкм.
Следует отметить, что это не исключает возможности запуска апоптоза по другому пути, например, через стресс ЭПР, или активации других вариантов клеточной гибели, например, аутофагической гибели. Поэтому изучение состояния секреторно-синтетической системы клеток, а также везикул кислого компартмента, которые участвуют в аутофагии, может дать ответ на вопрос не только о направленном действии растительных гормонов на биосинтетическую систему, но и о механизмах клеточной гибели нормальных и опухолевых кератиноцитов человека.
Таким образом, при субтоксических концентрациях ЖК, АБК и ГК не происходит повреждения сети митохондрий и активации клеточной гибели путем запуска апоптоза при участии митохондрий. В ходе дальнейших исследований мы также обращали внимание на состояние митохондрий при анализе ультраструктуры клеток с помощью электронной микроскопии и не выявили нарушений, указывающих на их патологическое состояние.
ЭПР в клетках HaCaT выявляется в виде тонкой сети, которая концентрируется в околоядерной области (рисунок 11, а). После действия 2 мМ ЖК, АБК и ГК, мы наблюдали увеличение плотности сети ЭПР во всей цитоплазме и в околоядерной зоне (рисунок 11, б-г). Кроме этого, при действии ЖК и АБК (рисунок 11, б, в) сеть ЭПР не была структурно однородной, и включала в себя гетерогенные по размеру расширения, что, возможно, указывает на набухание отдельных участков цистерн. Этот эффект четко проявлялся во всей клеточной популяции, хотя был по-разному выражен в разных клетках. ЭПР и комплекс Гольджи до и после инкубации клеток НаСаТ с растительными гормонами. а, д – контроль, б, е – инкубация с ЖК, в, ж – инкубация с АБК, г, з – инкубация с ГК; а-г – иммуноцитохимическое окрашивание клеток антителами к резидентной последовательности белков ЭПР KDEL; д-з - иммуноцитохимическое окрашивание клеток антителами к белку аппарата Гольджи 58К. Масштабный отрезок – 10 мкм. Аппарат Гольджи в клетках HaCaT имеет вид ленты, расположенной в околоядерной области (рисунок 11, д). Известно, что аппарат Гольджи является динамичной структурой, лентовидный комплекс Гольджи сворачивается и разворачивается, и эти преобразования находятся в зависимости от стадии клеточного цикла (Colanzi and Corda, 2007; Rabouille and Kondylis, 2007). Из этого следует, что состояние комплекса Гольджи (компактная или растянутая «лента») в анализируемых клетках по этому параметру будет отличаться даже в контрольных образцах. Однако, после инкубации клеток с растительными гормонами ЖК, АБК и ГК, мы наблюдали нехарактерное для контрольных клеток морфологическое состояние аппарата Гольджи - набухание, утолщение отдельных участков, а также растягивание и распространение аппарата Гольджи вокруг ядра (рисунок 11, е-з).
Следовательно, в иммортализованных нормальных кератиноцитах человека HaCaT растительные гормоны ЖК, АБК и ГК вызывают увеличение плотности и локальные расширения сети ЭПР и морфологические изменения аппарата Гольджи, которые могут быть связаны с гипертрофическими изменениями, как всего комплекса, так и его отдельных компартментов. Поэтому мы провели морфометрический анализ комплекса Гольджи и оценили его среднюю площадь в двумерной проекции.
Аппарат Гольджи в клетках HaCaT представляет собой трехмерную структуру в виде ленты, и изображения, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, позволяют анализировать площадь аппарата Гольджи в разных двумерных проекциях. Мы анализировали площадь аппарата Гольджи в околоядерной проекции, то есть в той зоне, где площадь ядра была максимальной. Морфометрический анализ показал, что в клетках HaCaT после действия ЖК, АБК и ГК площадь аппарата Гольджи по сравнению с контролем достоверно возрастала в 1,2 раза, 1,3 раза и 1,2 раза соответственно (рисунок 12).
Для того чтобы установить, 1) действительно ли изменения состояния аппарата Гольджи связаны с его гипертрофией, и 2) какие компартменты аппарата Гольджи реагируют на воздействие растительных гормонов, мы исследовали ультраструктуру клеток с помощью электронной микроскопии. Сложная трехмерная организация лентовидного комплекса Гольджи не прослеживается на единичных ультратонких срезах, однако с помощью электронной микроскопии можно детально проанализировать морфологию основных структурно-функциональных единиц комплекса Гольджи – стопок/диктиосом - скоплений уплощенных и уложенных друг над другом замкнутых мембранных цистерн, окруженных трубочками и везикулами.
Цистерны в стопке различаются между собой как по молекулярному составу и морфологии, так и выполняемым функциям (Mironov and Beznoussenko, 2011). В стопках выделяют следующие компартменты: 1) промежуточные везикуло-тубулярные структуры (Endoplasmic Reticulum Golgi Intermediate Compartment, ERGIC), или цис-Гольджи сеть; 2) цис-цистерны; 3) срединные (медиальные) цистерны; 4) транс-цистерны; 5) TGN – транс-Гольджи сеть, которая ассоциирована с транс-частью стопок и сортирует секретируемые продукты, направляя их в следующие пост-Гольджи компартменты. В компартменте TGN происходит множество важных процессов, целью которых является обработка и сортировка карго, конечная модификация гликозилированных белков, сортировка и концентрирование белков и липидов в составе везикулярных переносчиков, которые затем транспортируют карго к плазматической мембране или к эндосомно-лизосомному компартменту (Wilson et al., 2011).