Введение к работе
Актуальность темы. В последние десятилетия достигнуты значительные успехи в области экспериментальной эмбриологии млекопитающих. Стали возможными извлечение и пересадка доимплантационных зародышей, культивирование их вне организма, криокоисервация. а также другие манипуляции с эмбрионами. Эти достижения все шире используются для решения практических задач. Осуществление такого рода исследовательских и практических работ связано с тем. что доимплантационные эмбрионы подвергаются целому ряду экспериментальных воздействий. Поэтому изучение способности эмбрионов к дальнейшему развитию (жизнеспособности) после таких воздействий является важнейшей задачей, успешное решение которой позволит лучше понять закономерности нормального эмбриогенеза и особенности развития доимплантационных эмбрионов млекопитающих вне организма. Вместе с тем. полученные результаты будут способствовать повышению эффективности новых биотехнологий, применяемых при проведении практических работ с эмбрионами человека и домашних животных.
Для эмбриологических экспериментов на млекопитающих и разработки новых прогрессивных технологий основной модельной системой служат, как правило, эмбрионы лабораторных животных. Однако результаты исследований привели к важному выводу о существенных видовых отличиях реакциии зародышей млекопитающих на различные экспериментальные воздействия. Так, не все виды манипуляций, успешно проводимые на лабораторных животных, достаточно эффективно воспроизводятся на сельскохозяйственных и наоборот. В связи с этим необходимы новые сравнительные исследования влияния манипуляций in vitro на доимплантационные эмбрионы млекопитающих разных видов.
Целью настоящей работы было изучение влияния некоторых экспериментальных воздействий, таких как микрохирургическое разделение эмбрионов, хранение при положительных околонулевых температурах и криокоисервация сверхбыстрым методом на жизнеспособность доимплантационных эмбрионов мышей и крупного рогатого скота (к.р.с).
В связи с этим ставились следующие задачи:
-
изучить хронологию развития доимплантационных эмбрионов и выявить связь между изменением числа клеток и морфологическими преобразованиями у зародышей к.р.с, а также определить наиболее ранние возможные сроки нехирургического извлечения зародышей У к.р.с;
-
выяснить способность к развитию in vitro и in vivo половинок эмбрионов к.р.с.. полученных путем разделения доимплантационных зародышей;
-
исследовать влияние на жизнеспособность положительных околонулевых температур и возможность гипотермического хранения эмбрионов мышей и к.р.с;
-
изучить жизнеспособность эмбрионов мышей после замораживания путем прямого погружения в жидкий азот (сверхбыстрый метод) и определить оптимальные условия для такой криоконсервации: подбор наиболее эффективных криопротекторов. их оптимальных концентраций и времени эквилибрации. а также способа оттаивания;
-
сравнить выживаемость зародышей мышей различных аутбред-ных и инбредных линий после криоконсервации сверхбыстрым методом и выявить наличие или отсутствие генетических различий в криоре-зистентности эмбрионов.
-
изучить жизнеспособность эмбрионов мышей при последовательном воздействии гипотермии и глубокого замораживания сверхбыстрым методом;
Научная новизна работы. Впервые установлена отчетливая корреляция между изменением числа клеток у доимплантационных зародышах и прогрессивными морфологическими преобразованиями в ходе эмбрионального развития к.р.с, а также определены наиболее ранние сроки их нехирургического извлечения. Показано, что половинки, полученные при разделении эмбрионов к.р.с. на стадии компактної морулы-ранней бластоцисти сохраняют высокую жизнеспособность і) vivo без заключения их в zona pellucida. Выявлена зависимость выживаемости половинок в условиях in vitro от стадии развита исходного эмбриона. Получены гомозиготные телята-близнецы путеї разделения эмбрионов без использования микроманипулятора. Уста новлена высокая резистентность эмбрионов мышей и к.р.с. к гипотермическому воздействию и показана возможность их
- з -хранения при положительных околонулевых температурах без снижения жизнеспособности. Определены оптимальные условия для сверхбыстрого замораживания эмбрионов мышей без снижения жизнеспособности как в опытах in vitro, так и после пересадки реципиентам. Впервые показано сохранение жизнеспособности у эмбрионов, оттаянных на воздухе после сверхбыстрого замораживания. Впервые установлена возможность последовательного сочетания гипотермического хранения эмбрионов и криоконсервации сверхбыстрым методом. Впервые осуществлена криоконсервация сверхбыстрым методом эмбрионов мышей различных аутбредных и инбредных линий без снижения их выжива-мости.
Практическая значимость работы. Данные по развитию доимплантационных эмбрионов к.р. с. и связи изменения числа клеток в зародышах с морфологическими преобразованиями могут быть использованы в лекционных курсах биологических и сельскохозяйственных учебных заведений. Метод получения гомозиготных близнецов без использования сложной микроманипуляционной техники пригоден для практического использования при проведении производственных трансплантаций эмбрионов сельскохозяйственных животных. Этот метод также можно применять для взятия биопсии у поздних доимплантационных эмбрионов с целью проведения различного рода анализов. Гипотерми-ческое хранение эмбрионов млекопитающих и их криоконсервация сверхбыстрым методом могут найти примененние как при проведении исследований в области экспериментальной эмбриологии млекопитающих, так и в практической деятельности, особенно при работе с зародышами редких и исчезающих пород и видов млекопитающих с целью создания генетических банков и консервации генетических ресурсов.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на i'Q страницах машинописного текста и содержит 13 таблиц и S иллюстраций. Список литературы включает 193 работы.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Международной конференции "Биологические основы высокой продук-
_ 4 -тивности - (Боровск. 1990); I Республиканской конференции "Био-технологические исследования и перспективы их развития" (Львов. 1990); Научной конференции "Биотехнология и воспроизводство" (Горки. 1991): Рабочем совещании по консервации генетических ресурсов (Пущино. 1993); II Международной конференции "Актуальные проблемы биологии в животноводстве" (Боровск, 1995). а также на заседаниях отдела биотехнологии ВНИИФБиП и кафедры эмбриологии МГУ им. М.В.Ломоносова.