Разработка и применение ген-активированного остеопластического материала для замещения костных дефектов Бозо Илья Ядигерович

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 22

1.1. Актуальность 22

1.2. Особенности репаративного остеогенеза при использовании ординарных и активированных остеопластических материалов

1.2.1. Тканеинженерные остеопластические материалы и их влияние на репаративный остеогенез 35

1.2.2. Остеопластические материалы с факторами роста и их влияние на репаративный остеогенез .47

1.2.3. Ген-активированные остеопластические материалы и их влияние на репаративный остеогенез 50

1.3. Заключение 59

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования .60

2.1. Дизайн исследования 60

2.2. Создание прототипов ген-активированных остеопластических материалов .60

2.2.1. Характеристика генной конструкции .60

2.2.2. Характеристика матриксов-носителей 61

2.2.3. Совмещение матриксов-носителей и генных конструкций 62

2.3. Методы оценки цитотоксичности, пролиферативной активности, экспрессии мРНК гена VEGFA, продукции белка VEGF ММСК in vitro под влиянием разработанных ген-активированных остеопластических материалов .64

2.3.1. Получение культур ММСК человека .64

2.3.2. Оценка цитотоксичности ген-активированных остеопластических материалов 65

2.3.3. Оценка пролиферативной активности клеток под влиянием ген-активированных остеопластических материалов 67

2.3.4. Определение продукции мРНК гена VEGFA культурами ММСК 67

2.3.5. Определение продукции белка VEGF-A165 культурами ММСК .70

2.4. Анализ ген-активированных остеопластических материалов in vivo .72

2.4.1. Имплантация ген-активрованных остеопластических материалов в краниальные дефекты кроликам 72

2.4.2. Конусно-лучевая компьютерная томография .74

2.4.3. Гистологическое и гистоморфометрическое исследования .75

2.5. Статистический анализ 78

ГЛАВА 3. Результаты лабораторного этапа исследования и их обсуждение 82

3.1. Выбор матриксов-носителей для создания ген-активированных остеопластических материалов .82

3.2. Цитотоксичность и влияние ген-активированных остеопластических материалов на пролиферативную активность клеток 84

3.3. Специфическая активность разработанных ген-активированных остеопластических материалов in vitro 91

3.4. Обсуждение результатов лабораторного этапа исследований 99

ГЛАВА 4. Результаты экспериментального исследования in vivo и их обсуждение 102

4.1. Специфическая активность плазмидной ДНК с геном VEGFA при ортотопической имплантации ген-активированных остеопластических материалов .102

4.2. Особенности влияния ген-активированных остеопластических материалов на репаративный остеогенез и их эффективность в замещении костных дефектов..

4.2.1. Результаты конусно-лучевой компьютерной томографии 109

4.2.2. Результаты гистологического анализа

4.3. Рекомендации к проведению клинических исследований ген-активированных остеопластических материалов .136

4.4. Обсуждение результатов экспериментальных исследований in vivo .138

Заключение 147

Выводы .153

Практические рекомендации .154

Приложения №1-4 .156

Список литературы

• Тканеинженерные остеопластические материалы и их влияние на репаративный остеогенез
• Оценка цитотоксичности ген-активированных остеопластических материалов
• Цитотоксичность и влияние ген-активированных остеопластических материалов на пролиферативную активность клеток
• Рекомендации к проведению клинических исследований ген-активированных остеопластических материалов

Введение к работе

Актуальность темы. Исследования репаративной регенерации костной ткани и возможностей оптимизации восстановительного процесса являются актуальными задачами как фундаментальных медицинских наук, так и различных клинических областей медицины.

В изучение репаративной регенерации и, в частности, репаративного остеогенеза внесли весомый вклад отечественные ученые, заложившие основы для понимания этого процесса. Это, прежде всего, труды А.А. Максимова и его теория «мезенхимального резерва» (Maximow A.A., 1927), А.А. Заварзина – основателя эволюционной гистологии (теория параллельных рядов тканевой эволюции) (Заварзин А.А., 1945), Н.Г. Хлопина, разработавшего концепцию дивергентного развития тканей (Данилов Р.К., 2009), которая с определенными оговорками может быть применена к учению о дивергентной дифференцировке клеток в ходе онтогенеза, профессоров А.А. Клишова (1984), Р.К. Данилова (2009, 2012), И.А. Одинцовой (2004) о репаративном гистогенезе вообще и остеогенезе, в частности, детально описанным В.Г. Гололобовым (1997, 2011). Существенный прогресс в понимании закономерностей репаративного остеогенеза был достигнут после выявления клеток, находящихся в начальной части остеобластического дифферона, в качестве которых ранее рассматривались различные клеточные элементы, что подробно описано в обзоре В.Г. Гололобова и Р.В. Деева (2003).

Систематизация и анализ накопленных к настоящему времени данных привели к становлению концепции «остеогенной недостаточности» (Гололобов В.Г., 2011), объясняющей, почему стандартные методы лечения пациентов с повреждениями костей скелета далеко не всегда эффективны, а результаты костной пластики, зачастую, трудно прогнозируемы. В целом, фундаментальные труды отечественных ученых-гистологов создали предпосылки для разработки материалов и методов для индукции репаративных процессов в костной ткани, создали условия для формирования современной системы реконструктивно-восстановительного лечения, которая применительно к хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии изложена в трудах Л.А. Кулакова, Т.Г. Робустовой, А.Ю. Дробышева, А.И. Неробеева и др. (Кулаков Л.А. и др., 2010; Робустова Т.Г., 2010; Дробышев А.Ю. и др., 2012).

Так, проф. В.Г. Гололобов (1997) в своей монографии писал о необходимости выполнения сберегающей первичной хирургической обработки костных фрагментов при огнестрельных травмах в связи с наличием в крупных отломках жизнеспособных клеточных элементов, способных принимать участие в репаративном остеогенезе. В дальнейшем было показано, что повышение оксигенации области регенерации экзогенными факторами стимулирует репаративный остеогенез (Гололобов В.Г. и др., 2000; Matsuda T. et al., 1993), а причины такого эффекта связаны с увеличением функциональной активности клеток остеобластической линии под действием повышенного парциального напряжения кислорода

(Kawada S. et al., 2013; Okubo Y. et al., 2003). В этой связи, стали разрабатываться и «эндогенные» способы увеличения оксигенации в зоне костного дефекта, т.е. методы индукции ангиогенеза для стимуляции репаративного остеогенеза (Saran U. et al., 2014). Важно, что вновь образованная сосудистая сеть не только увеличивает обеспечение метаболически активного регенерата кислородом, необходимым в том числе для остегенной диффренцировки костных клеток-предшественниц, но и обеспечивает доставку в область репаративного остеогистогенеза камбиальных клеток, мигрирующих как из состава сформированного периваскулярного микроокружения, так и с кровотоком из системных источников (Kuznetsov S.A. et al., 2001). Оба механизма, взятые вместе, предопределяют индуцирующее влияние ангиогенеза на репаративную регенерацию костной ткани.

Актуальность проблемы подчеркивается тем фактом, что распространенность заболеваний и патологических состояний с вовлечением костей челюстно-лицевой области, крайне велика (Дробышев А.Ю., 1999; Кулаков Л.А. и др., 2010; Робустова Т.Г. и др., 2010). В этой связи, количество пациентов, нуждающихся в реконструктивно-восстановительных операциях на костях скелета, ежегодно остается весьма значительным.

Степень разработанности темы исследования. Особенности репаративной

регенерации тканей и, в частности, репаративного остеогенеза под действием генных индукторов, влияющих на белок-синтетическую функцию клеток, остаются малоизученными в связи с малым количеством проведенных экспериментальных исследований. При этом, работы, объединяющие в себе комплексную оценку ген-активированных материалов от изготовления до оценки биологического действия in vitro и in vivo единичны.

Цель исследования – разработать ген-активированный остеопластический материал, состоящий из матрикса-носителя и биологически активного компонента – плазмидной ДНК, несущей ген сосудистого эндотелиального фактора роста-А165 (VEGF-A165); определить биологическое действие ген-активированного материала и влияние на репаративный остеогенез в ортотопических условиях.

Задачи исследования

1. Создать прототипы ген-активированных остеопластических материалов, состоящих из различных матриксов-носителей и плазмидной ДНК с геном VEGFA.

2. Оценить механизм действия генных конструкций (молекул плазмидной ДНК с геном VEGFA) и его реализацию ими в составе ген-активированных остеопластических материалов in vitro.

3. Охарактеризовать биологический эффект генных конструкций в составе ген-активированных остеопластических материалов в ортотопических условиях in vivo.

4. Оценить эффективность разработанных ген-активированных остеопластических

материалов в оптимизации репаративного остеогенеза в эксперименте.

Научная новизна. Новизна разработанных в результате исследования технологий и ген-активированных остеопластических материалов подтверждена тремя патентами РФ на изобретение: №2519326 от 14.04.2014 (патент Украины №112450, патент Европы №2797633, патент США № US 9,730,959 B1), №2597786 от 24.08.2016, №2623171 от 22.06.2017. По всем патентам ведется зарубежное патентование. Настоящее исследование стало первым в России в рамках создания технологической платформы ген-активированных материалов. Одно из разработанных медицинских изделий находится на этапе клинических испытаний в рамках государственной регистрации (разрешение Росздравнадзора №610/2016 от 05 июля 2016, заключение №12 от 29.12.2016 Этического совета МЗ РФ в сфере обращения медицинских изделий). Указанные клинические испытания (протокол на сайте clinicaltrials.gov: NCT03076138) стали первыми в мире для данного класса остеопластических материалов. Кроме того, в качестве матрикса-носителя для генных конструкций впервые был использован ОКФ.

Теоретическая и практическая значимость работы

4. Полученные в ходе исследования экспериментальные данные о генной индукции ангиогенеза и репаративного остеогенеза расширили представления о возможностях влияния на данные процессы с использованием инструментов и методов геннотерапевтического подхода.

5. Результаты работы сформировали научно-техническую основу биотехнологической платформы для дальнейших исследований и разработок в области ген-активированных остеопластических материалов, что позволит осуществить создание и внедрение других медицинских изделий данного класса, состоящих из иных генных конструкций и матриксов-носителей.

6. Одно из трех разработанных изделий, показавшее высокую репаративную эффективность, находится на этапе внедрения в клиническую практику: пройден первый этап регистрационных действий, проводятся клинические испытания, разрешенные Росздравнадзором, результаты которых могут позволить начать применение первого в классе ген-активированных материалов медицинского изделия в рутинной клинической практике.

Методология и методы исследования. Исследование включало экспериментальные этапы
in vitro и in vivo, в ходе которых для решения поставленных задач использовались адекватные
контрольные группы, современные методы исследований (фуориметрия, сканирующая
электронная микроскопия, полимеразная цепная реакция, иммуноферментный анализ, проточная
цитофлуориметрия, дентальная компьютерная томография, гистохимические,

иммуногистохимические и гистоморфометрические методы) и статистической обработки полученных данных.

Основные положения, выносимые на защиту

7. Оптимизированные условия для образования химических связей между матриксом-носителем, содержащим кальций, и плазмидной ДНК позволяют создать единый комплекс – ген-активированный остеопластический материал.

8. Влияние плазмидной ДНК с геном VEGFA, входящей в состав ген-активированных материалов, на культуру ММСК in vitro проявляется в повышении экспрессии гена VEGFA и продукции белка VEGF-A165 при незначительном снижении пролиферативной активности ММСК и отсутствии цитотоксичности.

9. Активизация репаративного остеогенеза обусловлена эндогенной индукцией ангиогенеза в зоне костного дефекта, вызванной повышением продукции клетками реципиентного ложа белка VEGF-A165; оптимизирующее влияние ангиогенеза опосредовано улучшением оксигенации и пополнением пула остеогенных клеток-предшественниц из состава периваскулярного микроокружения и системных источников с индукцией их дифференцировки в остеобластическом направлении.

10. Объем вновь образованной ретикулофиброзной и пластинчатой костной ткани в периферической и центральной зонах костных дефектов у животных экспериментальных групп превышает показатели контрольных групп в связи с выраженным остеоиндуктивным действием ген-активированных остеопластических материалов, благодаря которому они индуцируют образование костного регенерата не только со стороны костных опилов, но и в центре костного дефекта.

Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности полученных результатов обусловлена использованием адекватных поставленным задачам методов исследования с применением сертифицированного современного оборудования, корректным выполнением статистической обработки полученных данных и воспроизведением результатов в достаточном числе независимых экспериментов. Диссертационная работа не содержит некорректных заимствований.

Основные положения диссертации были представлены и обсуждены 12 сентября 2017
года на совместном заседании кафедр челюстно-лицевой и пластической хирургии; детской
челюстно-лицевой хирургии; гистологии, эмбриологии и цитологии ФГБОУВО «Московский
государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова»

Министерства здравоохранения Российской Федерации (протокол №3 от 12.09.2017).

Основные результаты диссертационного исследования были доложены и обсуждены на 12 международных и 14 всероссийских научных конференциях. Результаты исследования были отмечены научным сообществом:

11. Диплом лауреата «Конкурса на лучшую инновационную медицинскую технологию по хирургии 2012 года» (II место) по итогам участия в первой всероссийской научной конференции молодых ученых медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (6-7 декабря 2012, Москва).

12. Включение доклада в ТОП-20 постеров и допуск к очному участию в конкурсе в рамках 4rd Tissue Engineering and Regenerative Medicine International Symposium - World Congress (8-11 сентября 2015, Бостон, США).

13. Диплом победителя и памятная Юбилейная медаль «95 лет Кубанскому государственному медицинскому университету» по итогам участия в Российско-китайском фестивале вузовской науки (19-20 ноября 2015, Краснодар).

По теме исследования:

выдано 3 патента РФ на изобретения; на один из патентов РФ через стадию международной патентной заявки получены патенты Европы, Украины и решение о выдаче патента США;

опубликовано 12 научных статей, из которых 4 в международных журналах, индексирующихся в Web of Science (наивысший импакт-фактор - 7,145), 6 в журналах, включенных в список ВАК;

опубликовано 33 тезиса докладов, из которых 21 были представлены на российских и 12 - на зарубежных научных конференциях (доложены на английском языке).

Вклад автора в проведенное исследование. Автор лично сформировал рабочую гипотезу, научно обосновал возможность оптимизации репаративного остеогенеза за счет активизации ангиогенеза под действием плазмидной ДНК, несущей ген VEGFA, входящей в состав разработанных ген-активированных материалов. Автор лично выполнил лабораторные исследования по оценке связывания плазмидной ДНК различными матриксами-носителями для создания ген-активированных остеопластических материалов, участвовал в организации и выполнении экспериментальных исследований в культурах клеток, лично прооперировал всех лабораторных животных (52 кролика), осуществлял их послеоперационное наблюдение, последующее выведение из эксперимента, извлечение фрагментов свода черепа, организовывал проведение компьютерной томографии и гистологических исследований.

Автор провел качественную и количественную оценку данных компьютерной томографии, гистологических препаратов, включая гистоморфометрический анализ, выполнил статистическую обработку полученных данных, участвовал в их интерпретации, написал тезисы научных работ, научные статьи (оригинальные исследования и обзоры), заявки на выдачу патентов на изобретения, диссертацию и автореферат.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертационного исследования изложены на 191 странице, представлены следующими разделами: обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты выполненных экспериментальных исследований in vitro и in vivо и их обсуждение, заключение, выводы, практические рекомендации, приложения и список литературы. Работа содержит 40 рисунков, 15 таблиц. Библиографический указатель включает 301 источник литературы, из них 48 отечественных и 253 зарубежных.

Тканеинженерные остеопластические материалы и их влияние на репаративный остеогенез

Описаны различные варианты классификации остеопластических материалов: по происхождению, химическому составу, физическим свойствам и прочим основаниям [70]. Предложена хронологическая классификация, разделяющая все разработанные остеопластические материалы на 5 поколений: 1) ксено-, алло- и аутогенные костные фрагменты, не подвергавшиеся специальной обработке; 2) консервированные аллокостные материалы; 3) аналоги костной ткани синтетического и натурального происхождения, в том числе с факторами роста; 4) тканеинженерные костные графты; 5) ген-активированные остеопластические материалы [18]. Однако для определения места ген-активированных материалов в общей системе медицинских изделий для костной пластики более подходящей является современная прикладная классификация, основанная на составе и механизме действия. Согласно ей, все остеопластические материалы подразделяются на две категории: ординарные и активированные [103].

Репаративный остеогенез под влияние ординарных и активированных материалов протекает по-разному в связи с отсутствием у ординарных и наличием в составе активированных – стандартизированных по качественным и количественным параметрам биологически активных компонентов: факторов роста (белков), клеток или генных конструкций, кодирующих факторы роста (Рисунок 1). Ординарные материалы, не содержащие биологически активных компонентов, призваны лишь оптимизировать репаративную регенерацию для ускорения и увеличения объема вновь образованной костной ткани, а вторые – индуцировать, поддерживать на высоком уровне до полного гистотипического восстановления.

К категории «ординарных» относятся: аллогенный и ксеногенный костный матрикс различных технологий обработки (деминерализованный, депротеинизированный) [38]; фосфаты кальция (-трикальция фосфат [63, 203, 274], октакальциевый фосфат [166] и др.); натуральный или синтетический гидроксиапатит [290]; синтетические (PLGA и т.д.) [115] и натуральные (коллаген, хитозан) органические полимеры [128, 158]; силикаты [273]; композитные изделия из вышеперечисленных материалов [285] и др. Апеллируя общепринятой терминологией, абсолютное большинство ординарных остеопластических материалов обладают, главным образом, остеокондукцией [103]. Некоторые из них (например, деминерализованный костный матрикс, полученный различными технологиями обработки нативной кости; фосфаты кальция и пр.) характеризуются также умеренным остеоиндуктивным действием, вероятно, за счет оптимальных физико-химических свойств и (или) наличия в составе матрикса неопределенного, не стандартизированного по качественным и количественным параметрам спектра биологически активных веществ [62]. В этой связи, основной механизм их действия обусловлен направлением формирующегося костного регенерата, а предел эффективности ограничивается оптимизацией естественного хода репаративного процесса, что обеспечивает заживление при замещении костных дефектов с высоким уровнем активности эндогенных остеоиндуцирующих факторов, но не достаточно для восполнения протяженных (объемных) костных дефектов.

Основной проблемой данной категории остеопластических материалов является недостаточный остеоиндуктивный потенциал, что ограничивает показания к их применению и делает результаты костной пластики в определенной степени непредсказуемыми, что можно проиллюстрировать следующими клиническими случаями.

Клинический случай №1. Пациентке Б. через 1 год после щадящей верхнечелюстной синусотомии справа с пластикой оро-антрального сообщения, проведенной по поводу хронического перфоративного верхнечелюстного синусита справа, был выполнен открытый синус-лифтинг справа с использованием ксеногенного депротеинизированного костного матрикса, а также винирная костная пластика в области отсутствующего зуба 1.4 кортикальным костным аутотрансплантатом с ветви нижней челюсти справа аналогичным остеопластическим материалом. За 6 мес. после операции воспалительных явлений и соответствующей им патологической клинической симптоматики в области правого верхнечелюстного синуса не наблюдалось. Однако на контрольном рентгенографическом исследовании было выявлено отсутствие интеграции имплантированного материала с внутренней кортикальной пластиной дна правого верхнечелюстного синуса. Важно, что выполненный до этого открытый синус-лифтинг слева с применением остеопластического материала той же торговой марки и одномоментной установкой дентального имплантата оказался эффективен (Рисунок 2).

Оценка цитотоксичности ген-активированных остеопластических материалов

Определение уровня белка VEGF-A165 в среде, кондиционированной ММСК, со-инкубированными с образцами ген-активированных остеопластических материалов, использовали как для оценки уровня трансляции генных конструкции разработанного изделия, так и для оценки его специфической активности.

По 1,5105 ММСК человека помещали в лунки 6-луночного планшета, куда после прикрепления клеток добавляли ген-активированные остеопластические материалы, генные конструкции без носителей, либо матриксы без генных конструкций. На сроках 1, 3, 5, 7, 10 и 12 сут. забирали образцы среды (100 мкл) для последующего анализа. Измерения проводились в четырех повторениях на каждом сроке.

Определение количества VEGF-A165 проводили в супернатанте с использованием набора для иммуноферментного определения концентрации VEGF-А DuoSet ELISA Development System (R&D Systems, США). Метод определения основан на твердофазном «сэндвич»-варианте ИФА, в котором специфические иммобилизованные первичные антитела к VEGF-А165, адсорбированные на поверхности лунок микропланшета, связываются с VEGF-А165 в образце. Прореагировавший VEGF-А165 взаимодействовал при инкубации с антителами к VEGF-А165 мыши, связанными с биотином. На третьей стадии биотин на связавшихся антителах взаимодействовал с комплексом стрептавидина с пероксидазой хрена. Количество прореагировавшего стрептавидина определяли цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена – тетраметилбензидина (ТМБ). Реакцию останавливали стоп-реагентом (2N H2SO4) и измеряли оптическую плотность растворов в лунках при длине волне 450 нм. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна количеству содержащегося в образце VEGF-A165. Образцы супернатантов хранили при -20о С. Перед началом работы с реагентом его прогревали до комнатной температуры (18-25оС). Непосредственно перед работой супернатанты размораживали.

На первом этапе планшет промывали 3 раза промывочным раствором (0,05% Tween20 в ФБС, pH 7.2-7.4) с помощью автоматического промывателя планшетов. При этом в каждую лунку вносили не менее 400 мкл раствора для промывки. Время между промыванием и аспирацией лунок составляло не менее 30 сек. По окончании промывки остатки влаги из лунок тщательно удаляли, постукивая перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге. Далее вносили по 300 мкл раствора для блокирования (1% БСА в ФСБ рН 7.2-7.4) в каждую лунку и инкубировали в течение часа при комнатной температуре. Промывку проводили 3 раза. На подготовленном планшете производили дальнейший анализ.

На втором этапе в лунки А-1, B-1, C-1, D-1, E-1, F-1, G-1, Н-1 вносили по 100 мкл стандартного образца (от 4 нг/мл в серии последовательных разведений), в остальные по 100 мкл исследуемых проб. Плашку закрывали плотно липкой пленкой и инкубировали в течение 2 ч. при комнатной температуре. Промывали 3 раза с помощью автоматического промывателя. Далее в каждую лунку вносили по 100 мкл антител, меченных биотином. Плотно заклеивали планшет новой клейкой пленкой и инкубировали 2 ч. при комнатной температуре. Промывку проводили 3 раза на автоматическом промывателе, как описано выше.

На третьем этапе в лунки с помощью 8-канального дозатора вносили по 100 мкл раствора стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена, в рабочей концентрации (готовый концентрированный раствор из набора разводили раствором для разведения реагентов в соотношении 1:200). Инкубировали 20 мин. при комнатной температуре без воздействия прямых солнечных лучей, промывали 3 раза, как описано выше. Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл ТМБ, инкубировали в темноте 20 мин. или до достижения достаточно интенсивного окрашивания. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл стоп реагента в каждую лунку. Оптическую плотность измеряли на микропланшетном спектрофотометре EL340 Microplate Reader Biokinetik (Bioech Instruments, США) при длине волны 450 нм, с референсной длинной волны 490 нм. Построение калибровочной кривой и обсчет данных проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prizm5.

Исследование выполнено на кроликах-самцах породы Шиншилла (n=52), массой 2,5-3,0 кг, с соблюдением международных правил гуманного обращения с лабораторными животными [54]. Каждому животному выполнялись два одинаковых симметричных полнослойных дефекта (без повреждения твердой мозговой оболочки) обеих теменных костей, диаметром по 10 мм. В дефекты правых теменных костей имплантировали ген-активированные остеопластические материалы №1, №2 и №3 (экспериментальные группы 1, 2 и 3, соответственно), в дефекты левых теменных костей (контрольные группы 1, 2 и 3) вносили аналогичные матриксы-носители без плазмидной ДНК. В четырех случаях дефекты левых теменных костей оставлялись без имплантации каких-либо материалов (естественное заживление, контрольная группа 4), а в дефекты правых теменных костей при этом имплантировали ген-активированный материал, состоящий из матрикса-носителя №1 и двухкассетной плазмидной ДНК, несущей гены VEGFA и Gfp (Таблица 6).

Цитотоксичность и влияние ген-активированных остеопластических материалов на пролиферативную активность клеток

Изначально, в ходе лабораторного этапа исследования из 10 различных остеопластических материалов были выбраны три – наиболее подходящие в качестве матриксов-носителей плазмидной ДНК, несущей ген VEGFA. Для дальнейших экспериментов in vivo, направленных на оценку безопасности и специфической активности разработанных прототипов ген-активированных материалов, были выбраны два изделия, содержащие наименьшую и наибольшую концентрации генных конструкций. Кроме того, выбранные ген-активированные материалы «Кол/Га + pl-VEGFA» и «ОКФ + pl-VEGFA» имели набольшие перспективы для регистрации и внедрения в клиническую практику в организационном аспекте, так как в качестве матриксов-носителей содержали отечественные остеопластические материалы.

Было установлено, что ни матриксы, ни ген-активированные материалы не обладали цитотоксичностью, лишь в некоторой степени снижали пролиферативную активность клеток в культуре. Результаты оценки специфической активности оказались несколько более сложными для интерпретации. Несмотря на низкий уровень поступления «голой» плазмидной ДНК в клетки, указанные генные конструкции, высвобождаясь из структуры ген-активированных материалов, поступали в ММСК in vitro, приводя к продукции мРНК трансгена и повышению секреции белка VEGF-A165. Максимальное увеличение наблюдалось на 5 сут.: на этой отметке уровень мРНК гена VEGFA в случае ген-активированных материалов «Кол/ГА + pl-VEGFA» и «ОКФ + pl-VEGFA» был больше на 51,6 и 134,3%, соответственно, чем в группах с матриксами-носителями без генных конструкций. Однако концентрация белка VEGF-A165 в средах, кондиционированных ген-активированными материалами, была сопоставима с таковой в случае интактной кульутры ММСК. Детальный анализ полученных данных с учетом результатов определения цитотоксичности и влияния на пролиферативную активность, а также понимание особенностей изменения морфофункциональной активности клеток, эпигенетических механизмов регуляции продукции белков позволяют объяснить полученные результаты.

Во-первых, клетки, находящиеся в течение 12 сут. в культуре под влиянием матриксов-носителей, содержащих фосфаты кальция и гидроксиапатит, могли начать дифференцировку в остеобластическом направлении. В этом случае, по некоторым данным, синтезированный белок VEGF-A165 мог быть использован для нужд самих клеток, как интракринный остеоиндуцирующий фактор [65, 188], что привело бы к снижению его секреции в культуральную среду.

Во-вторых, в части оценки специфического действия генных конструкций определение мРНК трансгена имеет наибольшее значение, нежели определение концентрации терапевтического белка. Это обусловлено тем фактом, что плазмидная ДНК содержит в своем составе ряд регуляторных последовательностей, повышающих эффективность транскрипции трансгена, т.е. в некоторой степени побуждает клетку к экспрессии, что закономерно приводит к повышению продукции мРНК. Максимальный уровень мРНК гена VEGFA был выявлен на 5 сут. со-инкубирования культур ММСК с ген-активированными материалами, статистически значимо превышал показатель интактных культур. В то же время особенностью геннотерапевтического воздействия на клетки-мишени является «мягкость» влияния – клетки сохраняют нормальную реакцию на стимулы микроокружения и при отсутствии необходимости в терапевтическом белке могут нивелировать воздействие генной конструкции за счет посттранскрипционных механизмов регуляции времени жизни мРНК [103]. В результате, несмотря на поступление плазмидной ДНК с геном VEGFA в ММСК, клетки, находящиеся в гипероксических, по сравнению с физиологическими, условиях культивирования могли разрушить синтезированную мРНК трансгена. Это является наиболее очевидной причиной тому, что пик продукции мРНК гена 101 VEGFA на 5 сут. культивирования не привел к ожидаемому пику секреции белка VEGF-A165 на 7 или 10 сут.

В-третьих, учитывая влияние матриксов-носителей на жизнеспособность и морфофункциональную активность клеточных культур, в наибольшей степени проявляющееся, очевидно, в условиях «без замены среды», оценка специфической активности ген-активированных материалов по уровню продукции терапевтического белка в виде сравнения параметра с интактной культурой ММСК недостаточно объективна. Наиболее корректным является сравнение с культурами, со-инкубированными с соответствующими матриксами-носителями. В этой связи, именно данному аспекту было уделено основное внимание при анализе результатов эксперимента. Максимальная, статистически значимая разница в накопленной концентрации белка VEGF-A165 в 25,3 и 33,9 % наблюдалась на сроках в 7 сут. и 10 сут. в случаях ген-активированных материалов «Кол/Га + pl-VEGFA» и «ОКФ + pl-VEGFA», соответственно, при их сравнении с матриксами-носителями без генных конструкций.

Таким образом, с учетом повышения уровня мРНК гена VEGFA под действием ген-активированных материалов с пиком на 5 сут. со-инкубирования с культурами ММСК, а также существенное повышение концентрации белка VEGF-A165 в среде, по сравнению с матриксами без генных конструкций, свидетельствует о реализации специфического действия плазмидной ДНК с геном VEGFA в составе ген-активированных материалов. Иными словами, генные конструкции в условиях in vitro высвобождались из матриксов-носителей, поступали в ММСК и экспрессировались с продукцией мРНК трансгена и терапевтического белка. Ген-активированный материал «ОКФ + pl-VEGFA», несмотря на меньшее содержание генных конструкций, показал более выраженное биологическое действие, что может быть обусловлено повышением эффективности поступления плазмидной ДНК в клетки в составе высвобождающихся из ОКФ микрочастиц фосфатов кальция.

Рекомендации к проведению клинических исследований ген-активированных остеопластических материалов

Ген-активированные материалы являются новым классом медицинских изделий, которые до настоящего времени не имеют прецедентов регистрации и внедрения в клиническую практику на территории России и за рубежом. Это факт предопределяет отсуствие специфических для данного класса медицинских изделий требований и рекомендаций для проведения клинических исследований. Вместе с тем, возрастающая активность исследований и разработок в данной области формирует потребность в таких рекомендациях.

Рекомендации для проведения клинических исследований ген активированных материалов в виду особенностей состава и механизма действия изделий должны охватывать два направления.

С одной стороны, наличие в составе ген-активированных материалов биологически активных нуклеиновых кислот, кодирующих терапевтические белки, обеспечивающих специфический механизм действия изделия и определяющих его эффективность, требует выполнения комплексных доклинических исследований, направленных на оценку безопасности и подтверждение реализации биологического действия генными конструкциями. Такие задачи могут быть решены с помощью культуральных методов in vitro с определением цитотоксичности разрабатываемых ген-активированных материалов и их компонентов (матриксы-носители, генные конструкции и т.д.), влияния на пролиферативную активность клеток, дифференцировочный потенциал, а также с оценкой эффективности поступления генных конструкции в клетки, экспрессии трансгена и продукции терапевтического белка. Помимо выявления указанных параметров in vitro, оценка безопасности, эффективности трансфекции и специфической активности ген-активированных материалов должна быть проведена in vivo. Для этого могут быть использованы эксперименты с гетеротопической имплантацией изделия. Оценка основного эффекта – влияние на репаративный остеогенез, обязательно должна быть выполнена в ортотопических условиях в релевантных моделях, особенно костных дефектах «критических размеров», сопровождающихся остеогенной недостаточностью. Не все из представленных методов являются регламентированными в рамках получения разрешения на проведение клинических испытаний Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения в целях государственной регистрации медицинского изделия. Однако выполнение комплекса доклинических исследований, позволяющих оценить специфические для ген активированных остеопластических материалов свойства, позволяет получить крайне важную информацию для планирования последующих этапов разработки, включая клинические исследования. Пример такого комплекса экспериментальных исследований in vitro и in vivo приведен в данной работе. С другой стороны, ген-активированные остеопластические материалы за счет входящих в их состав биологически активных нуклеиновых кислот, несущих гены терапевтических белков, призваны компенсировать остеогенную недостаточность за счет восполнения утраченных или минимизированных в зоне костного дефекта остеоиндуцирующих факторов. В этой связи, протоколы клинических исследований могут быть в первую очередь ориентированы на включение пациентов с протяженными (объемными) костными дефектами, деформациями, выраженной атрофией альвеолярного гребня челюстей. Кроме того, наиболее информативны методы исследований, позволяющие оценить биологическое действие ген-активированного материала с учетом вида терапевтического гена, включенного в состав генной конструкции. Одним из оптимальных методов решения этой задачи является гистологическое исследование биоптатов тканей, полученных из зоны костной пластики, с определением ключевых для терапевтического белка гистологических проявлений биологического действия. В частности, для ген-активированных материалов с плазмидной ДНК, несущей ген VEGFA, важным является качественная и количественная оценкая не только остеогенеза в препаратах, но и ангиогенеза (количество сосудов) как канонического эффекта терапевтического белка, кодируемого генной конструкцией.

Таким образом, в качестве научно обоснованных рекомендаций к клиническим исследованиям ген-активированных материалов можно предложить следующие: 1) проведение комплексных доклинических исследований, включающих оценку специфических для ген-активированных остеопластических материалов особенностей биологического действия и позволяющих охарактеризовать эффект изделия в случаях костных дефектов с остеогенной недостаточностью; 2) планирование клинических исследований с учетом включения пациентов с костными дефектами и атрофией костей склета, характеризующимися остеогенной недостаточностью; 3) выполнение гистологического анализа биоптатов из области костной пластики с оценкой проявлений, характерных для терапевтического белка, кодируемого генной конструкцией. С учетом сформулированных рекомендаций начато клиническое исследование ген-активированного остеопластического материала «ОКФ + pl-VEGFA» в рамках его регистрации в качестве медицинского изделия.

Экспериментальный этап in vivo был направлен на решение двух важнейших задач: оценку влияния генных конструкций в составе ген-активированных остеопластических материалов на пролиферативную активность, экспрессию мРНК гена VEGFA, продукцию белка VEGF ММСК in vitro и на репаративный остеогенез in vivo. Несколько авторов уже охарактеризовали специфическую активность генных конструкций, в том числе плазмидной ДНК с геном VEGFA, in vitro и in vivo, определили уровень трансфекции и эффективность в оптимизации репаративной регенерации костной ткани в составе матрикса-носителя [154]. Однако последовательности плазмидных векторов и однотипных трансгенов, зачастую, отличаются, как различаются и матриксы, выбранные в качестве носителей, и доза активного вещества, и технологии объединения компонентов в единое изделие – ген-активированный материал. В этой связи, разработка каждого варианта ген-активированного материала, даже состоящего из известных, на первый взгляд, компонентов должна начинаться с решения фундаментальных задач в рамках характерной для генной терапии последовательности событий: «ген – белок – (признак) / функция».

С использованием маркерной генной конструкции в настоящем исследовании удалось подтвердить высвобождением генных конструкций из матрикса-носителя, поступление в клетки реципиентного ложа и экспрессию в них с продукцией белка VEGF-A165, кодируемого трансгеном. С помощью иммуногистохимического исследования с определением количества сосудов в регенерате была подтверждена индукция ангиогенеза при использовании ген-активированных материалов с плазмидной ДНК, несущей ген VEGFA. Именно активный ангиогенез за счет повышения оксигенации и создания условий для миграции малодифференцированных колеток-предшественниц в зону костного дефекта, а также, вероятно, иные биологические эффекты VEGF-A165, описанные в обзоре литературы, обеспечили активизацию репаративного остеогенеза, что привело к формированию статистически значимо большего объема костного регенерата в экспериментальных группах, по сравнению с контрольными.