Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1. Тканевые макрофаги и система мононуклеарных фагоцитов: основные положения 15
1.2. Макрофаги маточно-плацентарного комплекса: происхождение, морфология и локализация 1.2.1. Плацентарные макрофаги 26
1.2.2. Децидуальные макрофаги 31
1.3. Современные представления о фенотипических и функциональных особенностях плацентарных макрофагов 34
1.3.1. Антигенные маркеры 34
1.3.2. Противоинфекционный иммунитет 38
1.3.3. Транспорт иммуноглобулинов и связывание иммунных комплексов 41
1.3.4. Иммуномодуляция 44
1.3.4.1. Секреция иммуносупрессорных (иммуномодуляторных) молекул 46
1.3.4.2. Дефицит триптофана 48
1.3.4.3. Неэффективная презентация антигена 49
1.3.4.4. Индукция апоптоза иммунокомпетентных клеток 50
1.3.5. Морфогенез и ремоделирование 51
1.3.5.1. Регуляция апоптоза 52
1.3.5.2. Регуляторные взаимодействия с трофобластом 57
1.3.5.3. Регуляция васкуло- и ангиогенеза 1.4. Макрофаги маточно-плацентарного комплекса и цитокиновая регуляция при беременности 63
1.5. Патогенетическая роль макрофагов маточно-плацентарного комплекса при некоторых акушерских патологиях 78
1.5.1. Преждевременное прерывание беременности 78
1.5.2. Преэклампсия 83
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 92
2.1. Получение культуры плацентарных макрофагов из ворсинчатого хориона в I триместре беременности 92
2.2. Получение культуры плацентарных макрофагов из ворсинчатого хориона в III триместре беременности
2.3. Культивирование плацентарных макрофагов, изолированных в I и III триместре беременности 95
2.4. Получение органотипической культуры ворсинчатого хориона 2.5. Выделение фракции мононуклеарных клеток из пуповинной крови в III триместре беременности 96
2.6. Иммуноцитохимический анализ культуры плацентарных макрофагов .97
2.7. Иммунофлуоресцентный анализ культуры плацентарных макрофагов 97
2.8. Оценка фагоцитарной активности плацентарных макрофагов в культуре 2.9. Идентификация мембраносвязанных и внутриклеточных маркеров методом проточной цитофлуориметрии 98
2.10. Определение секреторных продуктов плацентарных макрофагов и эксплантатов ворсинчатого хориона методом мультиплексного анализа .
2.11. Определение sVEGFR1 методом иммуноферментного анализа 101
2.12. Статистическая обработка данных 101
ГЛАВА 3. Получение культуры плацентарных макрофагов: проблемы и решения 103
Глава 4. Изучение поверхностного антигенного фенотипа плацентарных макрофагов в i и iii триместрах беременности 115
Глава 5. Сравнительная характеристика антигенных фенотипов моноцитов пуповинной крови и плацентарных макрофагов в III триместре беременности 140
Глава 6. Исследование внутриклеточной экспрессии цитокинов плацентарными макрофагами В I и III триместрах беременности 155
ГЛАВА 7. Исследование секреторной активности плацентарных макрофагов в I и III триместрах беременности 174
ГЛАВА 8. Исследование секреторной активности эксплантатов ворсинчатого хориона в I и III триместрах беременности 195
ГЛАВА 9. Обсуждение 212
Выводы 250
Практические рекомендации 251
Список сокращений 253
Список литературы
- Современные представления о фенотипических и функциональных особенностях плацентарных макрофагов
- Культивирование плацентарных макрофагов, изолированных в I и III триместре беременности
- Определение секреторных продуктов плацентарных макрофагов и эксплантатов ворсинчатого хориона методом мультиплексного анализа
- Исследование внутриклеточной экспрессии цитокинов плацентарными макрофагами В I и III триместрах беременности
Введение к работе
Актуальность темы исследования.
Макрофаги являются одним из основных клеточных типов в плаценте человека. Хотя история изучения плацентарных макрофагов имеет весьма солидный срок, эти клетки, составляющие достаточно многочисленную популяцию в строме плацентарных ворсин, остаются малоисследованными. В большинстве работ, посвященных исследованию плаценты, им зачастую отводилась роль второстепенных, вспомогательных элементов, и поэтому интерес к их изучению также носил в известной мере вторичный характер. Публикации, в которых плацентарные макрофаги являлись основным объектом интереса исследователей, довольно немногочисленны [Wynn, 1967; Castellucci et al, 1980; Bulmer, Johnson, 1984; Demir, Erbengi, 1984; Шатилова, 1999; Коржевский и др., 2005; Мустафина и др., 2015]. Благодаря этим и ряду других работ, в основном носящих характер исследований in situ, были сформированы основные представления о морфологии и локализации плацентарных макрофагов, охарактеризованы их ультраструктурная организация и цитохимические особенности.
Макрофаги привлекают особое внимание в связи с современными представлениями о роли иммунокомпетентных клеток в репродуктивных процессах. Если ранее центральная роль традиционно отдавалась клеткам адаптивного звена иммунной системы и их взаимодействиям со специфическим антигеном, то к настоящему времени существенное значение отводится сигналам, продуцируемым клетками врожденного звена иммунной системы, которые в значительной степени детерминируют развитие реакций адаптивного звена иммунной системы [Mellor, Munn, 2000]. В связи с этим возрастает значимость изучения физиологической и патогенетической роли клеток врожденного звена, в частности, участвующих во взаимодействии матери и плода при беременности [Сотникова и др., 2013].
Согласно современным представлениям, компоненты иммунной системы являются обязательными участниками процессов, происходящих в области маточно-плацентарного контакта на разных стадиях физиологической беременности. При этом взаимодействия генетически различных организмов матери и плода определяются как сформированные в процессе эволюции партнерские отношения, в которых иммунокомпетентные клетки действуют не антагонистически, а конструктивно, обеспечивая сохранение и нормальное развитие беременности [Moffett, Loke, 2004; Parham, 2004]
В то же время, становится все более очевидным, что роль макрофагов маточно-плацентарного комплекса не сводится к осуществлению лишь «классических» иммунных функций, таких как элиминация патогена, развитие воспаления и т.д. Накапливается все больше свидетельств того, что спектр выполняемых ими функций гораздо шире, и, благодаря разнообразию вырабатываемых сигналов, затрагивает различные процессы структурного характера, в частности формирование плаценты.
Необходимость исследования фенотипических и функциональных особенностей конкретной клеточной популяции особенно актуальна в отношении резидентных тканевых макрофагов, которые отличаются высокой чувствительностью к сигналам микроокружения и чрезвычайной пластичностью [Mosser, Edwards, 2008]. При наличии общих фундаментальных свойств (фагоцитоз, антибактериальная активность, продукция цитокинов и т.д.) макрофаги,
имеющие различную пространственно-временную локализацию, проявляют и существенные различия фенотипических и функциональных характеристик.
Актуальность изучения морфофункциональных характеристик плацентарных макрофагов продиктована необходимостью понимания физиологии и патофизиологии плаценты как важнейшего репродуктивного органа. Есть основания полагать, что макрофаги маточно-плацентарного комплекса при определенных условиях вносят свой вклад в развитие некоторых акушерских патологий, таких как невынашивание беременности и преэклампсия (гестоз) [Founds et al, 2009; Steinborn et al, 1998; Tang et al, 2013]. Идентификация изменений морфофункциональных характеристик макрофагов при этих нарушениях могла бы способствовать выявлению патогенетических механизмов на клеточно-молекулярном уровне и поиску путей их коррекции. Однако, это затруднено тем, что свойства этих клеток при нормальном (физиологическом) развитии беременности охарактеризованы в недостаточной степени, а имеющиеся данные, полученные разными исследователями, нередко плохо согласуются между собой или даже вступают в противоречие.
Для более полного понимания роли плацентарных макрофагов важно сопоставить их морфофункциональные характеристики в разные сроки физиологической беременности с теми процессами, которые происходят в плаценте на соответствующих стадиях ее развития. Имеющиеся в литературе разрозненные данные не позволяют провести корректное сравнение свойств и функций плацентарных макрофагов ранних и поздних сроков беременности из-за различий в методических подходах, используемых разными авторами.
В силу понятных ограничений в исследовании биологического материала, полученного от человека, ряд теоретических представлений о специфических функциях плацентарных макрофагов основаны на результатах экспериментов (особенно in vivo) с животными, главным образом, грызунами, имеющими, как и человек, плаценту гемохориального типа. Несмотря на очевидную ценность таких данных, их использование имеет ограниченный характер из-за существенных различий в физиологии человека и животных.
В связи с этим исследования in vitro во многих случаях представляют собой единственную возможность получения информации о клетках плаценты человека, в том числе и плацентарных макрофагах.
Настоящая работа является комплексным исследованием морфофункциональных характеристик макрофагов, изолированных из ворсинчатого хориона в разные сроки физиологической беременности.
Цель и задачи исследования
Цель исследования – охарактеризовать фенотипические и функциональные свойства плацентарных макрофагов в различные сроки физиологической беременности и оценить их роль в гестационном процессе.
Для достижения данной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:
1. Разработать адекватную и воспроизводимую процедуру получения клеточных культур
плацентарных макрофагов и органотипических культур ворсинчатого хориона ранних и поздних гестационных сроков, позволяющую проводить оценку их фенотипических и функциональных особенностей в условиях in vitro.
-
Охарактеризовать экспрессию молекул дифференцировки, факторов апоптоза, цитокинов, рецепторов цитокинов плацентарными макрофагами в I и III триместрах беременности и выявить изменения поверхностного антигенного фенотипа, связанные со сроком беременности.
-
Провести сравнительную оценку фенотипических особенностей плацентарных макрофагов и их возможных предшественников - моноцитов пуповинной крови.
-
Охарактеризовать цитокинпродуцирующую способность плацентарных макрофагов на ранних и поздних стадиях беременности (в последнем случае и при различных способах родоразрешения).
-
Оценить особенности базальной и индуцированной секреции цитокинов и их рецепторов клеточными культурами плацентарных макрофагов на ранних и поздних стадиях беременности и при различных способах родоразрешения.
-
Сравнить характер секреторной активности на уровне отдельной популяции (изолированные клеточные культуры плацентарных макрофагов) и органа (эксплантаты плаценты), и оценить возможный вклад макрофагов в общую продукцию цитокинов плацентой.
Научная новизна исследования
Впервые в одном исследовании изучен столь широкий спектр параметров, характеризующих особенности дифференцировки, экспрессию факторов апоптоза, рецепторный аппарат макрофагов плодной части плаценты.
Впервые охарактеризованы особенности разных этапов продукции (внутриклеточный синтез и секреция) широкого спектра цитокинов и их рецепторов, что дает возможность наиболее полно оценить участие данной клеточной популяции в межклеточной сигнализации в плаценте. Способность плацентарных макрофагов продуцировать ряд факторов (IL-11, IL-17F, sVEGFR1) продемонстрирована впервые.
Впервые в одном исследовании сравниваются характеристики клеток, полученных в I и III триместрах беременности и при разных способах родоразрешения (наличие или отсутствие спонтанной родовой деятельности), что позволяет сделать выводы о возможной регуляторной роли плацентарных макрофагов на протяжении беременности и в родовом акте.
Впервые проведен сравнительный анализ фенотипа плацентарных макрофагов и их предполагаемых предшественников - моноцитов пуповинной крови, что позволяет делать выводы о возможных изменениях функциональных характеристик в процессе дифференцировки тканевых макрофагов.
Установлено, что по мере прогрессирования беременности происходит ослабление
регуляторной функции в отношении морфогенетических процессов и усиление
провоспалительных свойств, обеспечивающих противоинфекционную защиту плода.
Впервые сопоставляются секреторная активность изолированной клеточной популяции и органотипических фрагментов плаценты, что позволяет оценить вклад плацентарных макрофагов в продукцию цитокинов плацентой в целом.
Теоретическая и практическая значимость
Теоретическая значимость работы заключается в определении роли плацентарных
макрофагов в гестационном процессе, в частности, участия этой клеточной популяции в противоинфекционной защите и регуляции морфогенеза плаценты. Уточняется место макрофагов плодного происхождения в структуре межклеточных взаимодействий при обеспечении иммунной толерантности в системе «мать-плод». Сравнительный анализ собственных результатов и литературных данных позволяет внести коррективы в современные теории активации, пластичности и гетерогенности системы мононуклеарных фагоцитов.
Разработанные модели на основе изолированных культур плацентарных макрофагов и органотипических культур плаценты разных гестационных сроков могут быть использованы для изучения фенотипических и функциональных характеристик отдельной клеточной популяции и ворсинчатого хориона в целом, как при физиологическом развитии беременности, так и при различных акушерских патологиях, а также для тестирования лекарственных препаратов.
Определение базовых характеристик одного из основных клеточных типов плаценты при физиологической беременности, осуществленное в данном исследовании, является необходимым условием для точного и объективного выявления их изменений, имеющих патогенетическое значение для некоторых акушерских патологий, что способствует разработке методов их предотвращения и коррекции.
Результаты данного исследования могут быть использованы в учебных курсах и пособиях по клеточной биологии, цитологии, гистологии, иммунологии, эмбриологии.
Методология и методы исследования. Методология in vitro была выбрана как наиболее адекватная при исследовании биологического материала человеческого происхождения. Для выполнения экспериментальной части исследования был использован набор современных методов, отвечающих поставленным целям и задачам.
Положения, выносимые на защиту.
-
Плацентарные макрофаги представляют собой клеточную популяцию, обладающую уникальными фенотипическими и функциональными свойствами, формирующимися под влиянием микроокружении и зависящими от пространственно-временных факторов.
-
С точки зрения общепринятой классификации плацентарные макрофаги при физиологической беременности имеют признаки «классической» (М1) и «альтернативной» (М2) активации. Развитие плаценты сопровождается усилением признаков обоих типов активации, что отражает функциональное созревание популяции макрофагов ворсин хориона. В то же время соотношение между уровнями активации конкретных популяций зависит от срока гестации.
-
Фенотипическая гетерогенность плацентарных макрофагов отражает их функциональные различия, связанные с выполнением различных задач. Сочетание провоспалительных и регуляторных свойств обусловливает, по крайней мере, две основные роли этих клеток: обеспечение противоинфекционной защиты и модуляцию свойств и функций других клеток маточно-плацентарного комплекса.
-
Динамика изменений морфофункциональных характеристик плацентарных макрофагов соответствует основным этапам физиологического развития плаценты. Выявленные нами характеристики свидетельствуют о том, что на ранних стадиях преобладает регуляторная функция в отношении структурных элементов формирующегося маточно-плацентарного
комплекса; при этом провоспалительный потенциал популяции макрофагов снижен, что обеспечивает развитие плаценты и сохранение беременности на этапе плацентации. Ослабление регуляторных и усиление провоспалительных свойств в III триместре беременности отражает снижение интенсивности морфогенетических процессов в зрелой плаценте, усиление противоинфекционного иммунитета и подготовку к родовому акту.
-
Подавление продукции провоспалительных цитокинов и экспрессии активирующих рецепторов представляют собой способы модуляции функций плацентарных макрофагов, обеспечивающие физиологическое развитие плаценты и сохранение беременности. Нарушение этих регуляторных взаимодействий может приводить к повышению уровня активации макрофагов, что представляет собой один из возможных патогенетических факторов при возникновении акушерских патологий.
-
Сопоставление секреторной активности плацентарных макрофагов и органотипических фрагментов ворсинчатого хориона указывает на то, что плацентарные макрофаги могут участвовать в регуляции воспалительных процессов и вне плаценты, тогда как регуляторные эффекты макрофагов в отношении неиммунных процессов носят преимущественно локальный характер.
Степень достоверности результатов. Достоверность полученных результатов обеспечивается достаточным объемом экспериментального материала, использованием современных методов исследования и адекватных методов статистического анализа.
Апробация и реализация работы. Диссертация выполнена на базе НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О.Отта. Результаты исследований внедрены в практическую и научную деятельность отдела иммунологии и межклеточных взаимодействий НИИАГиР им. Д.О.Отта. Материалы диссертации использованы в учебном пособии для вузов «Руководство по нейроиммуноэндокринологии».
Материалы диссертационной работы были представлены на международном симпозиуме
«Иммунология репродукции» (Киев, 1996), Пятой научной конференции с международным
участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001 (Санкт-Петербург, 2001),
Международной научно-практической школы-конференции «Цитокины. Воспаление.
Иммунитет» (Санкт-Петербург, 2002), Шестой научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2002 (Санкт-Петербург, 2002), II Всероссийской конференции «Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии» (Санкт-Петербург, 2003), VIII, X, XI, XIII, XIV Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004, 2006, 2007, 2009, 2011), III Международном научном конгрессе «Новые технологии в акушерстве и гинекологии» (Санкт-Петербург, 2007), Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008), 4-й Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» (Пермь, 2010), Научно-практической конференции с международным участием «Клиническая иммунология, иммуногенетика – междисциплинарные проблемы» (Ташкент, 2010), V Российской конференции по иммунологии репродукции» (Иваново, 2012), Объединенном иммунологическом форуме (Нижний Новгород, 2013), II Национальном конгрессе «Дискуссионные вопросы современного акушерства» и обучающем
преконгрессе-курсе XI Всемирного конгресса по перинатальной медицине (Санкт-Петербург, 2013), III Национальном конгрессе «Дискуссионные вопросы современного акушерства» (Санкт-Петербург, 2015).
Публикации. По материалам исследования опубликовано 44 печатные работы, в том числе монография «Плацентарные макрофаги», глава в учебном пособии «Руководство по нейроиммуноэндокринологии», 4 статьи в зарубежных научных журналах и 16 статей в отечественных журналах, включенных в Перечень ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов диссертационных исследований (из них 13 статей в изданиях, включенных в международные базы цитирования) и 22 тезиса докладов.
Личное участие автора заключалось в планировании, проведении всех лабораторных исследований, статистической обработке, обобщении и анализе полученных результатов, подготовке публикаций. Автором была определена цель и сформулированы задачи исследования, изучены данные литературы, составлена программа исследования, выполнен сбор и обработка материалов, проведено их обобщение и осуществлен анализ полученных результатов. В ходе выполнения исследования автором была отработана и стандартизована методика получения культур плацентарных макрофагов в I и III триместрах беременности.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и списка литературы. Текст диссертации изложен на 300 страницах, содержит 33 таблицы и иллюстрирован 54 рисунками. Список литературы содержит 597 источников, из которых отечественных – 22, зарубежных -575.
Современные представления о фенотипических и функциональных особенностях плацентарных макрофагов
Среди клеток, имеющих гемопоэтическое происхождение, макрофаги представляют собой наиболее разнородную, как морфологически, так и функционально, группу. Будучи филогенетически древними клетками, они представлены практически во всех органах и тканях млекопитающих: печени, легких, центральной нервной системе, кишечнике, селезенке, коже, лимфатических узлах, жировой и костной ткани и т.д. [16, 371]. Разнообразие морфологических и функциональных форм затрудняет классификацию этих клеток. На сегодняшний день общепризнанным является обобщающий термин «система мононуклеарных фагоцитов», который объединяет моноциты крови, тканевые макрофаги (как конечный этап дифференцировки) и клетки-предшественники [546]. Дендритные клетки миелоидного происхождения одними авторами выделяются в отдельную группу [16], тогда как другие включают их в систему мононуклеарных фагоцитов [184]. Характерными чертами макрофагов являются фагоцитарная активность, подвижность, высокая чувствительность к внешним сигналам. Длительное время объединяющим признаком считалось и общее костномозговое происхождение. Однако, этот постулат пришлось пересмотреть, поскольку выяснилось, что на протяжении онтогенетического развития существует несколько разных источников, дающих начало клеткам моноцитарно-макрофагального ряда. Эксперименты на животных показали, что в постнатальном периоде костномозговые гемопоэтические предшественники главным образом дают начало циркулирующим моноцитам и производным от них макрофагам, тогда как их вклад в создание специализированных локальных популяций макрофагов различных органов гораздо скромнее, а в некоторых случаях минимален. Предшественники же резидентных макрофагов заселяют соответствующие органы и ткани на более раннем этапе развития, и их основными источниками являются желточный мешок и/или печень плода [184, 581]. Таким образом, на сегодняшний день известно, по крайней мере, три пути дифференцировки мононуклеарных фагоцитов, два из которых связаны с эмбриональным периодом развития. Кроме того, подвергнут ревизии «классический» постулат иммунологии, согласно которому большинство тканевых макрофагов взрослого организма происходят из циркулирующих моноцитов. Результаты исследований показывают, что популяция резидентных макрофагов может в значительной степени обновляться и пополняться за счет пролиферации, тогда как рекрутирование моноцитов в ряде случаев играет второстепенную роль, по крайней мере, в физиологических условиях [186, 199]. Разное происхождение тканевых макрофагов, очевидно, является первым, но далеко не единственным фактором, обеспечивающим высокую морфологическую и функциональную гетерогенность мононуклеарных фагоцитов.
Справедливости ради надо отметить, что хотя возможность поддержания пула тканевых макрофагов за счет самовозобновления без привлечения моноцитов широко и активно обсуждается в последнее время, этот вопрос пока далек от однозначного разрешения, особенно, когда речь идет о клетках человека. Поэтому на сегодняшний день можно лишь ограничиться констатацией, что популяции резидентных макрофагов, заселяющих разные органы, состоят из клеток, имеющих различное происхождение: эмбриональное (из эктодермы желточного мешка, минуя фазу моноцита) и костномозговое, при котором предшественниками тканевых макрофагов являются преимущественно моноциты. Предполагается, что соотношение этих двух субпопуляций в разных органах может значительно варьировать от практически полного преобладания одной из них до полного паритета, однако на сегодняшний день нет методических подходов, позволяющих дифференцировать эти субпопуляции в физиологических условиях [236]. При этом нет разногласий в вопросе о значимости сигналов микроокружения, которые в существенной степени определяют фенотипическое и функциональное своеобразие популяций резидентных макрофагов, локализованных в различных органах, независимо от их происхождения.
Макрофаги, как и дендритные клетки, являются «профессиональными» антигенпрезентирующими клетками. Однако, если для дендритных клеток презентация антигена Т-лимфоцитам является основной функцией, то для макрофагов она не является первостепенной, как фагоцитоз. Таким образом, если главная задача дендритных клеток заключается во взаимодействии с адаптивным звеном иммунной системы и инициации иммунного ответа, то макрофаги «фокусируются», прежде всего, на обеспечении целостности органов и тканей [581]. Полифункциональность макрофагов обусловливает их участие в различных процессах: реализация неспецифического и регуляция адаптивного звена иммунного ответа на патоген, развитие и репарация органов и тканей, и т.д. Уникальные и разнообразные свойства макрофагов позволяют рассматривать их в качестве центрального элемента, контролирующего функции остальных иммунокомпетентных клеток [350] (рисунок 1).
Культивирование плацентарных макрофагов, изолированных в I и III триместре беременности
Экспрессия IFN и IFN наблюдалась в децидуальных и плацентарных макрофагах, начиная с первого триместра беременности [65, 77, 223]. Однако, менее 1% децидуальных макрофагов, полученных в I триместре, секретировали IFN in vitro [305], а в конце беременности лишь слабый уровень экспрессии IFN- и IFN был обнаружен в минорной субпопуляции клеток Кащенко-Гофбауэра [77].
Нет определенности и в вопросе о продукции противовоспалительного цитокина IL-4. Есть сообщение о том, что экспрессия этого цитокина макрофагами плацентарных ворсин носила нерегулярный характер [126]. В этом же исследовании иммуногистохимический анализ выявил конститутивную экспрессию IL-4 децидуальными макрофагами, однако, в экспериментах in vitro доля децидуальных макрофагов, секретирующих IL-4, составляла менее 1% [305].
Еще один противовоспалительный цитокин IL-10, по-видимому, играет роль в регуляции гестационых событий. Об этом свидетельствуют хотя и противоречивые, но достаточно многочисленные экспериментальные данные, указывающие на изменение системных и локальных уровней IL-10 в связи с изменением срока беременности, срочными и преждевременными родами или спонтанными абортами, а также при таких акушерских патологиях, как преэклампсия и задержка внутриутробного развития [56, 84, 161, 201, 202]. Кроме того, что этот цитокин, являясь ингибитором продукции провоспалительных медиаторов, вносит вклад в обеспечение «иммунной толерантности» на границе мать-плод, ему приписывают и другие эффекты. IL-10, возможно, участвует в регуляции инвазии трофобласта [397]. IL-10 также рассматривается как фактор, способствующий сохранению беременности путем негативной регуляции биосинтеза простагландинов и сократительной активности миометрия [201, 202].
Есть основания полагать, что макрофаги маточно-плацентарного комплекса вносят значительный вклад в локальную продукцию IL-10. Согласно результатам исследований in vitro, макрофаги в ранние и поздние сроки беременности являются основным источником IL-10 в децидуа, и уровень их секреторной активности значительно выше, чем уровень продукции цитокина моноцитами/макрофагами периферической крови [213, 305]. Иммуногистохимический анализ выявил наличие IL-10 в трофобласте и макрофагах плацентарных ворсин [202], а внутриклеточное определение методом проточной цитометрии показало, что и в плодной части плаценты наиболее вероятным источником IL-10 являются макрофаги [458].
Изначально открытый как гемопоэтический регуляторный фактор, IL-11 впоследствии оказался цитокином, обладающим плейотропным действием. Среди репродуктивных эффектов IL-11 на сегодняшний день наиболее известным и значимым является участие в регуляции наиболее ранних (децидуализация эндометрия, имплантация бластоцисты) и последующих (плацентация) этапов беременности [137, 138]. Кроме того, показано, что IL-11 является важным сигналом для дифференцировки децидуальных NK клеток и ремоделирования маточных сосудов [32]. Оказалось, что IL-11 влияет и на функции трофобласта: в экспериментах in vitro были продемонстрированы стимуляция миграции и инвазии клеток хориокарциномы JEG-3 [511], стимулирующее влияние цитокина на миграцию и ингибирующее действие на инвазивные свойства клеток вневорсинкового трофобласта человека [377, 379, 500], а также выявлена опосредованная IL-11 модуляция экспрессии и секреции белковых продуктов этими клетками [499].
Поскольку гестационные эффекты IL-11 рассматриваются, прежде всего, с точки зрения адаптации эндометрия к прогрессирующей беременности, современные исследования фокусируются, главным образом, на клеточных источниках IL-11, имеющих материнское происхождение. В то же время уровни экспрессии мРНК для IL-11 и его рецептора IL-11R в ворсинчатом хорионе оказались выше, чем в эндометрии или децидуа [102]. При иммуногистохимическом анализе плацентарных ворсин в I триместре беременности IL-11 и IL-11R был обнаружен в цито- и синцитиотрофобласте, а в строме ворсин выявлены IL-11+ клетки [122]. Однако, клеточные типы, ответственные за продукцию IL-11 в строме плацентарных ворсин, выявлены не были.
Одним из эффектов провоспалительных цитокинов, в частности, IL-1, IL-6 и TNF, является индукция простагландинов и эндотелинов, которые представляют собой сильные стимуляторы сократительной активности миометрия, приводящей к изгнанию плода из матки при срочных и преждевременных родах [71, 93, 257]. Предполагается, что в маточно-плацентарном комплексе TNF и IL-1 являются основными стимуляторами биосинтеза простагландинов и ингибиторами их метаболизма [257], в то время как противовоспалительные цитокины, в частности, IL-4 и IL-10 обладают противоположным эффектом [183, 468, 486]. По мнению некоторых исследователей, снижение уровня противовоспалительных цитокинов перед родами представляет собой эволюционную адаптацию, ведущую к стимуляции воспалительных процессов, необходимых для обеспечения физиологического родового акта [492].
Благодаря своей цитокинпродуцирующей активности, макрофаги маточно-плацентарного комплекса могут вносить свой вклад в опосредованную регуляцию родовой деятельности, в частности, индуцируя сократительную деятельность матки при срочных и преждевременных родах.
Более того: оказалось, что макрофаги способны самостоятельно продуцировать простагландины, играющие ключевую роль в стимуляции сокращения маточной мускулатуры. Так синтаза простагландина Е2 была обнаружена в макрофагах плацентарных ворсин на ранних и поздних стадиях беременности [345]. При иммуногистохимическом исследовании плаценты и плацентарного ложа была продемонстрирована экспрессия ключевого фермента синтеза простагландинов – циклооксигеназы; при этом наибольший уровень COX-1 и COX-2 наблюдался в макрофагах [202, 569]. Среди клеточных популяций децидуальной оболочки при срочных родах макрофаги также обладали наиболее высоким уровнем продукции PGE2, PGD2 и PGF2 [379, 381], а изолированные макрофаги плодной части плаценты секретировали PGE2 и тромбоксан А2 [567].
Определение секреторных продуктов плацентарных макрофагов и эксплантатов ворсинчатого хориона методом мультиплексного анализа
Задачи нашего исследования требовали максимально возможной сохранности антигенов, расположенных на наружной стороне клеточной мембраны. При ферментативной обработке всегда существует риск повреждения этих молекул. Альтернативой ферментативной диссоциации является механическая диссоциация ткани: измельчение, продавливание через сито, обработка ультразвуком. В литературе можно найти сообщения об успешном применении этого подхода. Так Оливейра и соавторы сообщали о выделении макрофагов при простом встряхивании фрагментов плацент III триместра беременности в питательной среде и преимуществах этого способа перед ферментативной обработкой [386]. Однако, эта работа вызывает сомнения как с теоретической, так и с практической точек зрения. Плацента характеризуется развитой сетью кровеносных сосудов и капилляров и хорошо выраженными структурами внеклеточного матрикса, для которых характерна анизотропия. Основными компонентами внеклеточного матрикса являются коллаген разных типов, различные изоформы фибронектина и ламинина, витронектин, гепаран сульфат протеогликан [90, 231]. По мере созревания плаценты увеличивается количество коллагеновых волокон в строме ворсин [79]. Все это затрудняет простое механическое разделение клеточных и внеклеточных элементов и получение жизнеспособных клеток в достаточном для исследований количестве. Очевидно, что для извлечения макрофагов, находящихся в строме ворсин необходимы специфические подходы, направленные на ослабление и разрушение связей клеток между собой и с компонентами внеклеточного матрикса. Наш опыт также показывает, что таким способом невозможно получить сколько-нибудь значимые количества клеток с морфофункциональными характеристиками макрофагов. Скорее, речь может идти о высвобождении мононуклеарных клеток крови, находящихся в мелких сосудах плацентарных ворсин.
В более поздней работе Нагаевой и соавторов сообщалось о выделении изолированных лейкоцитарных клеток из децидуальной оболочки путем ее измельчения и «протирания» через сито с размером пор 60 мкм [372]. Однако, другие авторы утверждают, что механическая дезинтеграция децидуа дает малый выход лейкоцитарных клеток при большом количестве клеточного дебриса и нелейкоцитарных клеток, в то время как ферментативная обработка позволяет получить большее количество жизнеспособных лейкоцитов при минимальном содержании других клеточных типов [447].
При разработке методики выделения мы проводили эксперименты по дезинтеграции ткани плаценты с использованием ультразвука, но и в этом случае результаты не были удовлетворительными. Полученные препараты характеризовались большим количеством клеточного и тканевого детрита, клеточных агрегатов, включающих в себя как живые, так и частично разрушенные клетки. Выход изолированных клеток был невысок, и хотя он увеличивался с увеличением периода озвучивания, жизнеспособность клеток при этом заметно снижалась. Доля клеток с морфофункциональными характеристиками макрофагов была относительно невысокой. Все это убедило нас в том, что механические способы дезинтеграции ткани зрелой плаценты не позволяют получить достаточные для дальнейших исследований количества жизнеспособных макрофагов, а могут служить лишь способом предварительной обработки ткани для ее последующей ферментативной диссоциации.
Тот факт, что подавляющее большинство исследователей используют процедуру ферментативной обработки, а также наш собственный опыт, убеждают в том, что ферментативная диссоциация ворсинчатого хориона является наиболее адекватным способом получения изолированных клеток плаценты. В отличие от аналогичных процедур, применямых зарубежными авторами, чаще всего использующими для этих целей коллагеназу бактериального происхождения (из Clostridium histolyticum), мы использовали коллагеназу, полученную из гепатопанкреаса камчатского краба (Paralithodes camtschatica). В проведенных нами предварительных экспериментах коллагеназа краба давала гораздо лучшие результаты по выходу и жизнеспособности клеток. При существенной разнице в стоимости препаратов зарубежного (коллагеназа клостридия) и отечественного (коллагеназа краба) производства использование последнего заметно снижает стоимость достаточно дорогостоящих экспериментов, что также является немаловажным преимуществом данной методики.
Для дальнейшей «очистки» популяции макрофагов обычно используют один из двух подходов. Первый основан на различиях в адгезивной способности разных типов клеток. Макрофаги способны прикрепляться к культуральному субстрату гораздо быстрее и прочнее, чем остальные лейкоциты и другие клетки, изолированные из ворсин хориона, в частности клетки трофобласта и фибробласты. Второй способ «очистки», который все чаще используется исследователями, представляет собой сепарацию клеточной суспензии с помощью магнитных бус и иммобилизованных на них антител, специфически связывающих поверхностные антигены клеток (иммуномагнитная сепарация). Для изоляции макрофагов применяют как позитивную селекцию, используя антитела к мембраносвязанным антигенам макрофагов/моноцитов/лейкоцитов [117, 506, 591], так и негативную селекцию, удаляя из супензии клетки, несущие специфические маркеры других клеточных типов [344, 413, 526, 567, 584].
Исследование внутриклеточной экспрессии цитокинов плацентарными макрофагами В I и III триместрах беременности
Результаты исследования поверхностных цитокиновых рецепторов в моноцитах и макрофагах представлены в таблицах 8 и 9.
Здесь, в первую очередь, следует отметить различие количественных характеристик экспрессии рецепторов к IL-17. Практически все моноциты пуповинной крови несли на своей поверхности IL-17R, тогда как для подавляющего большинства макрофагов (более 90%) было характерно отсутствие этого рецептора (таблица 8). Следует также отметить чрезвычайно низкую вариабельность количества IL-17R+ клеток среди моноцитов (коэффициент вариации менее 1%) в отличие от популяции плацентарных макрофагов (коэффициент вариации более 80%). Примечательно, что количество положительно окрашенных клеток различалось между двумя изучаемыми популяциями примерно в 10 раз (таблица 8), тогда как показатели средней интенсивности окрашивания различались лишь в 5 раз (таблица 9). Это свидетельствует о том, что в популяции плацентарных макрофагов при существенном снижении доли клеток с фенотипом IL-17R+ интенсивность экспрессии рецептора отдельными клетками возрастает.
Принимая во внимание тот факт, что IL-17 стимулирует продукцию провоспалительных цитокинов макрофагами [247], можно предположить, что дифференцировка моноцитов в макрофаги приводит к значительной потере способности отвечать на воздействие IL-17 и генерировать воспалительный ответ. Такую особенность можно рассматривать как одно из свидетельств в пользу так называемой «альтернативной активации» плацентарных макрофагов.
Известно, что IL-23 также индуцирует провоспалительные свойства моноцитов/макрофагов, стимулируя в этих клетках продукцию IL-1, IL-6, TNF [238, 292]. В нашем исследовании моноциты, имеющие рецепторы к IL-23, составляли хоть и малую, но заметную часть всей популяции (около 12%). В то же время, говорить о сколько-нибудь значимой экспрессии IL-23R в популяции плацентарных макрофагов не приходится: доля IL-23R+ клеток составляла менее 3%, а средняя интенсивность флуоресценции была на уровне негативного
Данные представлены в виде медиан. Слева и справа подстрочным текстом указаны, соответственно, нижняя и верхняя границы 95%-го доверительного интервала для медиан.
В левом нижнем углу – количество наблюдений. В правом нижнем углу в скобках приведены значения коэффициента вариации.
Значительное снижение экспрессии рецепторов к IL-17 и отсутствие рецепторов к IL-23 на поверхности плацентарных макрофагов, вероятно, являются проявлениями локальных регуляторных механизмов, направленных на подчинение функциональных свойств клеток логике гестационного процесса. Поскольку активация макрофагов маточно-плацентарного комплекса по воспалительному типу несет потенциальную угрозу для сохранения беременности, минимизация вероятностей и путей такой активации снижает риск прерывания или патологических изменений беременности.
Данные представлены в виде медиан. Слева и справа подстрочным текстом указаны, соответственно, нижняя и верхняя границы 95%-го доверительного интервала для медиан. В левом нижнем углу – количество наблюдений. В правом нижнем углу в скобках приведены значения коэффициента вариации.
Единственным антигеном, наличие которого не было выявлено ни в одном образце обеих клеточных популяций, была -цепь рецепторов для IL-2 и IL-15 (CD122). В большинстве исследованных образцов не наблюдалось сколько-нибудь значимой экспрессии TGF RII как моноцитами, так и макрофагами. Лишь в нескольких случаях наблюдались «выбивающиеся» высокие значения, однако полученные в результате статистической обработки результаты (доля TGF RII+ клеток менее 5%, средняя интенсивность флуоресценции на уровне негативного контроля) не позволяют делать вывод о значимой экспрессии этого рецептора в обеих клеточных популяциях (таблицы 8, 9).
Два типа рецепторов TNF были представлены в разной степени на поверхности моноцитов пуповинной крови: более 80% клеточной популяции демонстрировало положительную окраску на TNFR1, и лишь чуть более 10% всех моноцитов составляли TNFR2+ клетки. По результатам нашего исследования можно констатировать с ограниченной статистической достоверностью, что по сравнению с моноцитами пуповинной крови в плацентарных макрофагах уровни экспрессии TNFR1 и TNFR2 снижены примерно в 6 и 2 раза, соответственно (таблица 8).
Несмотря на то, что параметры, характеризующие экспрессию рецептора васкулоэндотелиального ростового фактора VEGFR1, указывают на существенное снижение этого показателя в популяции плацентарных макрофагов по сравнению с популяцией моноцитов, это различие не достигало статистической значимости из-за высокой вариабельности исходных значений. Экспрессия TNFR1 также отличалась высокими значениями коэффициента вариации (таблицы 8, 9).
Нами была выявлена существенная связь между этими двумя цитокиновыми рецепторами в обеих исследуемых клеточных популяциях. И для моноцитов пуповинной крови, и для плацентарных макрофагов значения коэффициентов корреляции экспрессии TNFR1 и VEGFR1 были выше 0,9 (таблица 10), что, согласно общепринятым критериям, интерпретируется как очень сильная корреляция.