Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
Эндотелий сосудов и старение 16
1.1. Старение сердечно-сосудистой системы 16
1.2. Молекулярные механизмы cердечно-сосудистой патологии 24
1.3. Пептидная регуляция функций сосудов при возрастной патологии
1.3.1. Пептид KED (Везуген) 39
1.3.2. Полипептидный комплекс сосудов 43
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 46
2.1. Характеристика исследуемого материала 46
2.2. Приготовление раствора пептидов для введения в культуру 46
2.3. Метод клеточных культур 48
2.4. Иммуноцитохимическое исследование 52
2.5. Иммунофлуоресцентная конфокальная микроскопия 57
2.6. Морфометрические исследования и компьютерный анализ микроскопических изображений 59
2.7. Метод молекулярного моделирования 59
2.8. Статистическая обработка результатов 62
3.1. Исследование влияния пептидов на экспрессию сигнальных молекул в культуре клеток эндотелия человека 63
3.1.1. Влияние пептидов на экспрессию Ki67 в культуре клеток эндотелия человека 63
3.1.2. Влияние пептидов на экспрессию p53 в культуре клеток эндотелия человека 66
3.1.3. Влияние пептидов на экспрессию Сx43 в культуре клеток эндотелия человека 67
3.1.4. Влияние пептидов на экспрессию VEGF в культуре клеток эндотелия человека 69
3.2. Исследование влияния пептидов на экспрессию сигнальных молекул в культуре клеток сосудов крыс 72
3.2.1. Влияние пептидов на экспрессию Ki67 в культуре сосудов крыс 72
3.2.2. Влияние пептидов на экспрессию p53 в культуре сосудов крыс 74
3.2.3. Влияние пептидов на экспрессию Сx43 в культуре сосудов крыс 78
3.2.4. Влияние пептидов на экспрессию VEGF в культуре сосудов крыс 80
3.3. Модель взаимодействия вазопротекторных пептидов с ДНК 85
Заключение 92
Выводы 97
Литература 99
- Молекулярные механизмы cердечно-сосудистой патологии
- Пептидная регуляция функций сосудов при возрастной патологии
- Иммунофлуоресцентная конфокальная микроскопия
- Исследование влияния пептидов на экспрессию сигнальных молекул в культуре клеток сосудов крыс
Молекулярные механизмы cердечно-сосудистой патологии
Интегральным показателем функционирования ССС является артериальное АД. В рассмотрении отношения АД и возраста существует несколько подходов. Одни авторы указывают, что с возрастом давление крови значительно повышается. Другие авторы считают это увеличение незначительным, объясняя механизм повышения АД у людей пожилого и старческого возраста потерей эластичности крупных артериальных сосудов. Повышение давления рассматривается при таком подходе, как реакция компенсации, необходимая для поддержания перфузии жизненно важных органов при изменениях сосудистого русла [Tumer N., Toklu H.Z., Muller– Delp J.M., Oktay S., Ghosh P., Strang K., Delp M.D., Scarpace P.J.The effects of aging on the functional and structural properties of the rat basilar artery. // Physiol. Rep. – 2014. – V. 6. – N 2(6). – P. 12031].
Повышение АД может быть вызвано снижением эластичности периферических артерий вследствие склеротических и дегенеративных изменений, происходящих в них в процессе старения [Chang W.T., Chen J.S., Hung Y.K., Tsai W.C., Juang J.N., Liu P.Y. Characterization of aging–associated cardiac diastolic dysfunction. // PLoS One. – 2014. – V. 28. – N 9(5). – P. e97455]. При физиологическом старении среднее АД у здоровых людей 60-69 лет составляет 130/80 - 135/85, у людей 70-79 лет – 135/80 - 140/85 мм рт. ст. [Van Empel V.P., Kaye D.M., Borlaug B.A. Effects of healthy aging on the cardiopulmonary hemodynamic response to exercise. // Am. J. Cardiol. – 2014. – V. 1. – N 114(1). – P. 131–135].
У здоровых людей выявляется тенденция к повышению АД в старших возрастных группах [Patel V.B., Zhong J.C., Fan D., Basu R., Morton J.S., Parajuli N., McMurtry M.S., Davidge S.T., Kassiri Z., Oudit G.Y. Angiotensin– converting enzyme 2 is a critical determinant of angiotensin II–induced loss of vascular smooth muscle cells and adverse vascular remodeling. // Hypertension. – 2014. – V. 64. – N 1. – P. 157–164]. Эта закономерность в большей степени выражена со стороны систолического и среднединамического давления, в то время, как минимальное давление остается более стабильным. В связи с тем, что максимальное и минимальное давления изменяются неравномерно, с возрастом повышается пульсовое давление. О том, что высокий уровень АД не является результатом естественного старения, свидетельствуют длительные (5-13 лет) наблюдения, указывающие на некоторое снижение максимального и минимального давления у долгожителей по сравнению с контрольной группой лиц молодого возраста [Ohanian J., Liao A., Forman S.P., Ohanian V. Age–related remodeling of small arteries is accompanied by increased sphingomyelinase activity and accumulation of long–chain ceramides. // Physiol. Rep. – 2014. – V. 28. – N 2(5). – P. e12015]. В процессе старения не происходят существенные сдвиги среднединамического давления. В возрасте 50-79 лет оно соответствует 85-100 мм рт. ст., превышение этих величин рассматривается как проявление патологических изменений.
При физиологическом старении АД существенно не повышается, несмотря на увеличение упругого напряжения крупных артериальных сосудов и потерю ими эластичности. Эти изменения происходят на фоне снижения сердечного выброса, увеличения объема аорты и других отделов сосудистой системы, а также повышения сосудистого сопротивления [Ma L., Wang K., Shang J., Cao C., Zhen P., Liu X., Wang W., Zhang H., Du Y., Liu H. Anti–Peroxynitrite Treatment Ameliorated Vasorelaxation of Resistance Arteries in Aging Rats: Involvement with NO–sGC–cGKs Pathway. // PLoS One. – 2014. – V. 12. – N 9(8). – P. e104788].
У лиц старших возрастных групп АД изменяется незначительно по сравнению с молодыми людьми. Такая же тенденция выявлена при изучении скорости распространения пульсовой волны по сосудам эластического типа. Если бы АД определялось только состоянием крупных артериальных стволов, то у людей старческого и пожилого возраста закономерным был бы высокий уровень давления. Однако исследования не выявили четкой зависимости между уровнем АД и упругим напряжением артерий в старших возрастных группах [Sikora E., Bielak–Zmijewska A., Mosieniak G. Cellular Senescence in Ageing, Age–Related Disease and Longevity. // Curr. Vasc. Pharmacol. – 2013. – P. 698-706]. Возраст-зависимые изменения упруговязких свойств крупных артерий происходят неравномерно, кроме того, упругое напряжение в сосудах мышечного типа увеличивается медленнее, чем в сосудах эластического типа. Следует особо подчеркнуть, что возрастным изменениям больше подвержены сосуды нижних конечностей. Причиной такого явления может быть значительная функциональная нагрузка на этот отдел ССС, что подтверждается морфологическими исследованиями.
При рентгенологическом исследовании сосудов наблюдается повышение плотности аорты, ее удлинение. Потеря эластичности и развитие ригидности артерий увеличивает нагрузку на сердце, деятельность которого у людей пожилого и старческого возраста в силу иволютивных изменений миокарда ограничена. Более того, нарушается адаптационная способность малого и большого круга кровообращения. Возрастные изменения артериальных сосудов обусловливают их недостаточную способность к изменению просвета, что нарушает приспособительные возможности системы кровообращения. Эти особенности хорошо прослеживаются при изучении гемодинамики под влиянием различных функциональных нагрузок [Yano Y., Ning H., Allen N., Reis J.P., Launer L.J., Liu K., Yaffe K., Greenland P., Lloyd–Jones D.M. Long–Term Blood Pressure Variability Throughout Young Adulthood and Cognitive Function in Midlife: The Coronary Artery Risk Development in Young Adults (CARDIA) Study. // Hypertension. – 2014. – № 64 (5). – P. 983-988].
Пептидная регуляция функций сосудов при возрастной патологии
Молекулярное моделирование позволяет построить химическую структуру коротких пептидов и ДНК с использованием специальных компьютерных программ, в основу которых заложены базы данных о структурах и физико-химических свойствах атомов и некоторых макромолекул. Моделирование макромолекулы включает в себя подбор необходимых атомов или фрагментарных молекул из базы данных программы и построение межатомных связей согласно валентности.
В данной работе для молекулярного моделирования использовали специальную компьютерную программу Molecular Operating Environment 2012 для визуализации химического строения коротких пептидов, нахождения новых структурных изомеров, выполнения докинга и конформационного поиска. Молекулы не являются абсолютно жесткими структурами, при комнатной температуре их кинетическая энергия достаточно велика для того, чтобы все атомы в молекуле находились в постоянном движении. Переход из одной конформации в другую связан с изменением торсионных углов при одинарных химических связях.
Структуры, отвечающие максимуму потенциальной энергии, неустойчивы. Предполагается, что биологическая активность лекарственного вещества определяется одной, так называемой «биоактивной» конформацией его молекул, которую необходимо обнаружить среди множества всех низкоэнергетических конформаций. Основываясь на сведениях об активной конформации, можно сконструировать новые активные лиганды для конкретной мишени действия. Таким образом, установление низкоэнергетических конформаций имеет важное значение для понимания корреляции между структурой и биологической активностью молекулы. Затраты времени на конформационный анализ прямо зависят от выбора метода расчета энергии.
Для поиска низкоэнергетических конформаций пептидов использовали метод LowModeMD. Этот метод выполняет молекулярную динамику со скоростью атомов, определенную низкочастотным колебанием. В этом методе поиск конформаций осуществляется с использованием короткой молекулярной динамики, которая рассчитывается около 1 пс при постоянной температуре, после чего система оптимизируется. Потом процедура повторяется. Результат состоит из списка низкоэнергетических конформеров молекулы, ранжированных по значению потенциальной энергии. Предполагалось, что наиболее энергетически выгодные стереоизомеры молекул являются биологически активными и именно в такой конформации несут свою биологическую функцию.
Докинг является компьютерным моделированием взаимодействия между лигандом (пептидом) и активным сайтом рецептора (ДНК). Метод докинга включал подстановку лиганда в низкоэнергетической конформации в сайт связывания и расчет оптимальной взаимной ориентации молекулы пептида и ДНК при их связывании и энтальпии (ккал/моль). Использовали «полугибкий» докинг, где учитывали конформационную подвижность только пептида, а азотистые основания ДНК были жесткими.В расчетах учитывали площадь контакта, число водородных связей, параметры гидрофобных и электростатических взаимодействий. В работе использовали силовое поле Amber 12EHT и генетический алгоритм поиска GBVI/WSA. После построения молекулы ДНК и пептидов протонировали при pH 7 и Т=300 К. Энергию взаимодействия пептидов с ДНК определяли величиной оценочной функции S [ккал/моль], которую рассчитывали по формуле: S c + a - (A ECOH/ + A E sol ) + A E vdw + j3ASA weighted где c - значение потери ротационной и трансляционной энтропии комплекса; , - экспериментально определенные константы, которые зависят от силового поля; Ecoul - значение кулоновской энергии, которая рассчитывается с использованием заряда системы при диэлектрической константе равной 1; Esol - значение электростатической энергии растворителя; Evdw - Ван-дер-Ваальсовый вклад в энергию взаимодействия; SAweighted - вклад молекулярных оболочек в значение энергии. Было проведено по 10 итераций докинга пептидов KED и DS с каждым промоторным участком. Решения докинга ранжировали по убыванию от наиболее энергетически выгодного решения до наименее энергетически выгодного решения. Из каждого решения докинга (n=10) анализировали только первые решения, так как они являются наиболее энергетически выгодными. Для определения наиболее вероятной конформации лиганда в водной среде весьма важен учет влияния растворителя на поведение всей системы. Был использован метод, в котором растворитель рассматривается как непрерывная протяженная среда вокруг молекулы растворенного вещества, что позволило оценить влияние сольватации с меньшими затратами на вычисление. Такая модель называется «обобщенное приближение Борна, GB-SA», которая описывает зарядовые взаимодействия.
Иммунофлуоресцентная конфокальная микроскопия
Как было показано ранее, получены экспериментальные данные, свидетельствующие, что вазопротекторные свойства пептида KED связаны с его способностью регулировать экспрессию различных сигнальных молекул, в том числе и транскрипционного фактора пролиферации клеток Ki67.
Известно, что белок Ki67 является ведущим маркером оценки снижения пролиферативной активности клеток и степени инволютивных процессов в различных органах и тканях. Вероятно, стимуляция пептидом KED пролиферации клеток может быть связана с активацией экспрессии гена пролиферативного протеина MKI67. Одним из основных факторов транскрипции гена MKI67, регулирующего его экспрессию, является белок Sp-1. Белок Sp-1 взаимодействует с коровым промотором гена MKI67 по 2 сайтам связывания, локализованным в диапазонах от -159 до -145 пар нуклеотидов и от -14 до +12 пар нуклеотидов (п. н.) относительно точки инициации транскрипции. Эти участки отвечают за положительную регуляцию экспрессии гена MKI67 и являются важными для поддержания транскрипционной активности гена. Ранее было высказано предположение, что короткие пептиды проникают в ядро клетки и сайт-специфически взаимодействуют с промоторными участками генов, эпигенетически регулируя их экспрессию [Fedoreyeva L. I., Kireev I. I., Khavinson V. Kh., Vanyushin B. F. Penetration of short fluorescence labelled peptides into the nucleus in HeLa cells and in vitro specific interaction of the peptides with deoxyribooligonucleotides and DNA // Biochemistry. 2011. Vol. 76, N. 11. P. 1505-1516; Khavinson V. Kh., Solov ev A. Yu., Tarnovskaya S. I., Lin kova N. S. Mechanism of biological activity of short peptides: cell penetration and epigenetic regulation of gene expression // Biology Bulletin Reviews. - 2013. - Vol. 3, № 6. -P. 451-455]. Кроме того, в зарубежном исследовании методом молекулярного моделирования была показана возможность взаимодействия тетрапептида с ДНК [Huang H., Kozekov I. D., Kozekova A., et al. Minor groove orientation of the KWKK peptide tethered via the Nerminal amine to the acrolein-derived 1,N2-gamma-hydroxypropanodeoxyguanosine lesion with a trimethylene linkage // Biochemistry. - 2010. - Vol. 27, N. 49. - P. 6155-6164]. В связи с этим способность KED и других вазопротекторных пептидов активировать синтез пролиферативного протеина Ki-67 может быть связана с их участием в регуляции экспресcии гена белка Ki-67 (MKI67). Для того чтобы показать возможность эпигенетической регуляции экспрессии гена белка Ki-67 были созданы молекулярные модели взаимодействия пептидов KED и DS с промоторными участками этого гена.
Рассчитана низкоэнергетическая конформация пептида KED в растворе (рис. 25). Пептид состоит из трех а.о. лизина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты. При рН 7 суммарный заряд молекулы равен -1. Пептид образует сеть внутримолекулярных водородных связей, изображенных на рисунке пунктиром. Далее эта конформация использовалась для выполнения докинга.
Низкоэнергетическая конформация пептида KED, найденная методом LowModeMD. Красным цветом изображены атомы кислорода, синим цветом – атомы азота, черным цветом – атомы углерода, светло-серым цветом изображены атомы водорода, пунктиром изображены водородные связи.
В базе данных ENSEMBL был проведен поиск промоторных последовательностей гена белка Ki-67. Ген MKI67 локализован на 10 хромосоме. Были найдены промоторные последовательности трех транскриптов гена MKI67, локализованных в различных позициях хромосомы. Каждый из исследуемых диапазонов промотора имел по три различных последовательности. Так, в диапазоне от -159 п. н. до -145 п. н. относительно точки инициации транскрипции изучали последовательности 5 - agcagttggcaagct-3 , 5 -agtcttcaaagaca-3 и 5 -ccccgcccacgccct-3 . В диапазоне от -14 п. н. до +12 п. н. изучали последовательности 5 acgctgcgggcgggcgggcgggcggga-3 , 5 -agcctcaaccatcaggaaaacaagagt-3 , 5 ccaagagcacctaaggaaaaggcccaa-3 . С полученными последовательностями проводили докинг пептида. Результаты докинга представлены в таблице
Промоторные участки Оценочная функция докинга S (ккал/моль; n=10) Сайтсвязывания пептидавмолекулеДНК Оценочна я функция докинга S (ккал/мол ь; n=10) Сайтсвязывания пептидавмолекулеДНК -159 -145 п. н. agcagttggcaagct -7,53±0,25 TGGC; CAAG -5,50±0,08 GCA -159 -145 п. H. agtcttcaaagacag -6,19±0,11 GTCT -5,63±0,19 AG, CA -159 -145 п. н. ccccgcccacgccct -7,25±0,01 CGC -5,29±0,14 CC acgctgcgggcgggcgggcgggc ggga -5,72±0,01 GGCG -4,84±0,08 CGG -14+12 п. н.agcctcaaccatcaggaaaacaagagt -7,04±0,01 CATC; GGA -5,47±0,15 CATC -14+12 п. н.ccaagagcacctaaggaaaaggcccaa -8,14±0,01 CACC -6,02±0,00 TAAG Табл. 1. Взаимодействие пептидов с промоторными участками гена MKI67 in silico.
Были проанализированы наиболее энергетически выгодные решения докинга пептида с участками ДНК. Пептиды KED и DS взаимодействовали с молекулой ДНК в основном со стороны малой бороздки. Только в одном случае пептид KED связался с большой бороздкой: в промоторе 5 acgctgcgggcgggcgggcgggcggga-3 по сайту GGCG, однако такое взаимодействие не оказалось среди наиболее энергетически выгодных, и энергия взаимодействия составила -5,72 ккал/моль. При взаимодействии с ДНК пептид KED образовывал донорно-акцепторные и ионные связи с 3-4 п. н. Со всеми 6 промоторными участками пептид связывался по разным сайтам, однако с наиболее низкой энергией он взаимодействовал с промотором 5 -ccaagagcacctaaggaaaaggcccaa-3 по сайту CACC (табл. 1). Энергия образования такого комплекса составила -8,14 ккал/моль (рис. 26Б). Благодаря боковой группе лизина KED выступал в качестве донора протонов, и образовывал сеть из водородных связей с атомами кислорода O 4 дезоксирибоз и О2 цитозина. Карбоксильные группы боковой цепи аспарагиновой кислоты и С-концевого участка, наоборот, выступали в качестве акцепторов протонов и образовывали водородные связи с аминогруппой NH2 во втором положении гуанина (рис. 26Б).
Исследование влияния пептидов на экспрессию сигнальных молекул в культуре клеток сосудов крыс
В диссоциированных культурах сосудов крыс и человека при их старении in vitro пептиды KED и DS увеличивали экспрессию Ki67 наиболее выраженно в «молодых» и менее выражено в «старых культурах». Однако влияние пептидов на экспрессию апоптотического маркера p53 не было выявлено, за исключением снижения экспрессии р53 под действием пептида KED в «молодых» культурах. Для выявления воздействия пептидов на маркеры Сх43 и VEGF было проведено иммуноцитохимическое окрашивание и конфокальная микроскопия. Пептид DS увеличивал площадь экспрессии коннексина Сх43 в «молодых культурах» при иммуноцитохичиском окрашивании, а при конфокальном – площадь экспрессии в «старых культурах». Кроме того, пептиды KED и DS увеличивали площадь экспрессии VEGF в «старых» и «молодых культурах» при конфокальной микроскопии, в то время как при иммутоцитохимическом исследовании была только выявлена тенденция к увеличению экспрессии маркера при воздействии пептида DS.
Поскольку ранее было высказано предположение, что короткие пептиды способны проникать в клетку и эпигенетически регулировать экспрессию генов [Fedoreyeva L.I., Kireev I. I., Khavinson V. Kh., Vanyushin B. F. Penetration of short fluorescence labelled peptides into the nucleus in HeLa cells and in vitro specific interaction of the peptides with deoxyribooligonucleotides and DNA // Biochemistry. - 2011. - Vol. 76, - N. 11. - P. 1505-1516], нами были созданы сравнительные молекулярные модели взаимодействия пептидов KED и DS с фрагментами промоторных зон генов, кодирующих изученные белки. Предполагаемой молекулярной мишенью действия пептида KED, вазопротекторное действие которого было ранее установлено у пациентов старших возрастных групп с различной сосудистой патологией, является промоторная зона гена MKI67 5 -agcctcaaccatcaggaaaacaagagt-3 , кодирующего пролиферативный протеин Ki67. В основе этой гипотезы лежит увеличение экспрессии протеина Ki67 под действием пептида в диссоциированных культурах клеток сосудов при их старении. Кроме того, установлено, что пептид DS обладал в культурах эндотелиоцитов при их старении эффектом, аналогичным KED. Ранее, в экспериментах с другими короткими пептидами (КЕ, AEDG), была показана возможность эпигенетической регуляции экспрессии различных генов [Khavinson V. Kh., Malinin V. V. Gerontological aspects of genome peptide regulation. Basel (Switzerland): Karger AG. - 2005. 104 p.]. Аналогично предположительным механизмом действия пептидов KED и DS явилось их связывание с промоторными участками гена MIK67, (гена пролиферативного протеина Ki67), ответственного за положительную активацию его транскрипции. Нами были предложены модели комплексообразования пептидов с различными сайтами связывания гена MIK67 и рассчитаны значения энергий образования таких комплексов. Установлено, что пептид KED образовывал более энергетически выгодные комплексы с молекулой ДНК, чем пептид DS. Это, скорее всего, связано с наличием дополнительной функциональной группы в пептиде KED. В промоторе гена MKI67 5 -agcctcaaccatcaggaaaacaagagt-3 пептиды KED и DS связывались с ДНК по одному сайту связывания CATC. Вероятно, взаимодействие обоих пептидов с этим сайтом определяло одинаковый эффект увеличения экспрессии пролиферативного белка Ki67 пептидами.
Данные о влиянии пептида KED на экспрессию белков Ki67, p53, Cx43 в культурах эндотелиоцитов человека и крыс при их старении могут играть важную роль в понимании молекулярных механизмов антиатеросклеротического действия этого пептида, выявленного при пероральном применени у пациентов пожилого возраста в работах Китачева и соавт. Известно, что нарушение целостности эндотелиальной выстилки интимы артерий может быть вызвано апоптотической гибелью эндотелиальных клеток (ЭК). Причиной развития апоптоза ЭК при атеросклерозе может быть индукция перекисного окисления липидов и накопления активных радикалов кислорода. Исследование, проведенное на коронарных артериях, взятых от 52 умерших больных с атеросклерозом и ИБС на различных стадиях атерогенеза показало увеличение апоптотического индекса эндотелиоцитов в коронарных артериях, пораженных атеросклерозом, по сравнению с неповрежденными сегментами сосудов контрольной группы. При этом процессы апоптоза эндотелия сосудов интенсивно протекают только на ранних стадиях атеросклеротического процесса [Владимирская Т.Э., Швед И.А., Криворот С.Г. Апоптоз клеток стенки коронарных артерий как фактор развития и прогрессирования коронаросклероза // Актуальные вопросы кардиологии. 2013. - N 9. - P. 22–26]. Экспрессия Cx43 резко снижается в местах атеросклеротического поражения сосудов у человека и животных. Атеросклеротическое поражение аорты человека характеризуются резким уменьшением количества щелевых контактов, что определяется по снижению экспрессии Cx43. То есть при развитии атеросклеротических поражений разрушается трехмерная клеточная сеть, формируемая щелевыми соединениями [Orekhov A.N., Andreeva E.R., Bobryshev Y.V. Cellular mechanisms of human atherosclerosis: Role of cello-cell communications in subendothelial cell functions // Tissue Cell. - 2016. - V. 48. - N 1. - P. 25-34]. Следовательно, стимуляция пролиферации (экспрессия белка Ki67), образование межклеточных контактов (экспрессия Сх43) и снижение апоптоза (белок р53) под действием пептида KED могут указывать на способность этого трипептида предотвращать развитие атеросклероза на его начальной стадии.
Таким образом, одним из важнейших молекулярных аспектов вазопротекторного действия пептидов KED и DS является регуляция процессов клеточного обновления, снижения уровня апоптоза и стимуляция межклеточных взаимодействий. По данным молекулярного моделирования пептиды KED и DS могут эпигенетически регулировать экспрессию генов, продукты которых обеспечивают поддержание функциональной активности эндотелиоцитов сосудов при старении. Поскольку эффект пептида KED был больше выражен в эндотелиальных клетках человека в сравнении с пептидом DS, можно предположить, что трипептид будет оказывать более выраженные вазо-и геропротекторные свойства по сравнению с дипептидом, однако это требует проведения дополнительных исследований.