Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I Обзор литературы 8
1.1. Гистогенез трубчатых костей человека и животных 8
1.2. Этапы минерализации кости 14
1.3. Значение липидов для процессов остеогенеза и минерализации
1.4. Роль гликозаминогликанов и протеогликанов в остеогенезе и минерализации на ранних стадиях пренатального развития
1.5. Значение микроэлементов, в частности, меди и селена, для гомеостаза организма
Глава II Материалы и методы исследования 42
Глава III Результаты собственных иследовании 48
3.1. Гистогенез закладок бедренной кости человека в г.Астрахани и г.Махачкале на ранних этапах пренатального развития на светооптическом и ультраструктурном уровнях
3.2. Этапы минерализации на ранних стадиях морфогенеза бедренных костей человека в различных геохимических территориях
3.3. Липиды и фосфолипиды закладок бедренных костей человека на ранних стадиях пренатального онтогенеза в Нижневолжском и Северокавказском регионах
3.4. Гликозаминогликаны в раннем остеогенезе бедренных костей человека в геохимически различающихся областях проживания
Глава IV Обсуждение полученных результатов 86
Выводы 96
Практические рекомендации 97
Список литературы 98
Приложение
- Значение липидов для процессов остеогенеза и минерализации
- Роль гликозаминогликанов и протеогликанов в остеогенезе и минерализации на ранних стадиях пренатального развития
- Этапы минерализации на ранних стадиях морфогенеза бедренных костей человека в различных геохимических территориях
- Гликозаминогликаны в раннем остеогенезе бедренных костей человека в геохимически различающихся областях проживания
Введение к работе
Актуальность проблемы. Глубокое понимание процессов тератогенеза и регенерации костной и хрящевой тканей человека невозможно без изучения динамики, стадий и механизмов нормального остеогенеза и его факторов на ранних стадиях пренатального развития (Привес М.Г., с соавт., 1956, 1967; Павлова В.Н., с соавт., 1974; Лазько А.Е., Росткова Е.Е., 1991; Докторов А.А. 1999; Щеплягина Л.А., Моисеева Т.А.., 2003; Денисов-Никольский Ю.И., Матвейчук И.В., 2005; Kelemen Е., et al, 1984; Ducy P. et al, 2000).
Для биологии и медицины значительный интерес представляет взаимосвязь между гистогенезом трубчатых костей человека и факторами остеогенеза и минерализации в них, в частности, гликозаминогликанами и липидами на тех стадиях развития, для которых наиболее вероятно начало развития процессов, приводящих к врожденной патологии трубчатых костей конечностей (Павлова М.Н., Поляков А.Н., 1971; Chan G., 1992; Slemenda С. W., 1996; Anderson Н.С., 2003).
Процессы остеогенеза и минерализации костной ткани являются весьма сложными и зависящими от многих факторов, как эндогенных, так и экзогенных. В числе последних, как весьма важных, нужно отметить минеральные компоненты окружающей среды, в частности, металлы (Авцын А.П. с соавт., 1983, 1987, 1991; Ермаков В.В., 1999; Сусликов В.Л., 1999, 2000) .
На территории России имеется значительное количество районов, различающихся по содержанию металлов в воде, которую использует население в быту и на производстве. К таким районам можно отнести Поволжье и Дагестан. Не слишком отстоя друг от друга географически, они резко отличаются по содержанию металлов в воде рек. Так содержание хрома (Сг), кобальта (Со), меди (Си), селена (Se), кадмия (Cd) и сурьмы (Sb) в реках Дагестана весьма значительно и достоверно выше, чем в р.Волга (Бутаев A.M. с соавт., 2006).
Между тем, несмотря на довольно значительное число исследований, посвященных морфологии костей (Семенова Л.К., 1953, I960, 1962, 1971; Привес М.Г., 1955; Борисевич А.И., I960; Никитюк Б.А., 1968 а, б; Судзиловский Ф.В., с соавт., 1975; Подрушняк Е.П., Новохатский А.И., 1983; Криштофорова Б.В., 1984; Аврунин А.С. соавт., 2002, 2005; Шалина Т.П., 2009; Koziebic Т., 1981; Mattei В., е.а. 1983; Kelemen Е., е.а., 1984; Archer С, 2003), работ, в которых бы учитывалось влияние различных геохимических условий на ранний остеогенез трубчатых костей человека крайне недостаточно.
Нам не встретились данные о раннем гистогенезе и минерализации, в том числе на ультраструктурном уровне, закладок трубчатых костей человека и об особенностях факторов, которые их определяют, в частности, липидов и гликозаминогликанов, в различных геохимических условиях.
Цель и задачи исследования. Учитывая вышеизложенное, целью исследования явилось выявление особенностей процессов гистогенеза и минерализации закладок трубчатых костей человека в существенно
различающихся геохимических условиях Нижнего Поволжья и Северного Кавказа.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи исследования:
1. На светооптическом и ультраструктурном уровнях провести
сравнительную оценку гистогенеза закладок трубчатых костей на примере
бедренной кости на ранних этапах пренатального развития человека в разных
геохимических условиях проживания.
-
Изучить в сравнительном плане в различных геохимических условиях процессы минерализации в закладках бедренной кости человека при пери- и эндохондральном остеогенезе на ультраструктурном уровнях.
-
Выявить различия в локализации, содержании, спектре нейтральных липидов и фосфолипидов в закладках бедренных костей человека в процессе раннего остеогенеза в условиях г.Астрахани и г.Махачкалы.
-
Сравнить изменение содержания гликозаминогликанов и их спектр в закладках бедренных костей человека при пери- и эндохондральном остеогенезе в различных геохимических условиях.
Научная новизна исследования. Впервые было проведено комплексное сравнительное изучение развития трубчатых костей человека, процессов остеогенеза и минерализации в них на органном, тканевом, клеточном и молекулярном уровнях при существенно различающихся геохимических условиях Нижнего Поволжья и Северного Кавказа.
Выявлены факторы остеогенеза, преимущественно испытывающие на себе влияние особенностей геохимических условий сравниваемых территорий.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты данного исследования демонстрируют процесс и механизмы адаптации трубчатой кости, как морфофункциональной системы, к возрасту и к воздействию внешней среды через изменение факторов, влияющих на остеогенез и минерализацию, что имеет значение для понимания сущности категорий гомеостаза, адаптации, развития и прогресса биологических систем.
Полученные данные о развитии трубчатых костей человека в различных геохимических условиях раскрывают тонкие процессы остеогенеза и минерализации, имеющие общебиологическое значение. Они могут быть полезны как основа для изучения аномалий опорно-двигательного аппарата, патогенеза его заболеваний и регенерации костной и хрящевой тканей. Отклонения в спектрах изученных факторов остеогенеза и минерализации можно использовать для ранней диагностики нарушений развития костносуставного аппарата. Результаты исследований основных этапов раннего остеогенеза позволят разработать рекомендации по использованию эмбриотрансплантатов при лечении ложных суставов и вяло заживающих переломов трубчатых костей.
Положения, выносимые на защиту.
-
Различия в гистогенезе закладок бедренной кости человека, обусловленные различной минерализацией окружающей среды, начинают проявляться с 9, 10 недели внутриутробного развития.
-
При наличии общей этапности процессов минерализации закладок бедренных костей человека в обеих изучаемых геохимических зонах -образование с помощью хрящевых клеток везикул матрикса, трансформация их в калькосфериты, осаждение на калькосферитах, как центрах кристаллизации, гидрооксиапатита - первый этап в зоне с повышенной минерализацией проходит интенсивнее.
-
При качественно аналогичных процессах снижения содержания нейтральных липидов и увеличения содержание фосфолипидов и расширения их спектра за счет активаторов минерализации при остеогенезе и минерализации закладок бедренных костей человека, их интенсивность выше в зоне с повышенной минерализацией.
4 . Для процессов оссификации и минерализации закладок бедренных костей в норме в обеих геохимических зонах характерно снижение содержания в несульфатированных и малосульфатированных и, напротив, нарастание концентрации кислых высокосульфатированных гликозаминогликанов -хондроитинсульфатов и кератансульфата. Повышенная минерализация окружающей среды активизирует эти механизмы.
Апробация работы.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на объединеном XII Конгрессе международной ассоциации морфологов и VII Съезде Всероссийского научного общества анатомов, гистологов и эмбриологов (Тюмень, 2014), X Международной научно-практической конференции «Prospects of world science» (Sheffield (England), 2014), Международной научной конфонференции «Современная наука: актуальные проблемы и пути их решения», (Липецк, 2014), заседаниях Махачкалинского и Астраханского отделений Всероссийских научных обществ анатомов, гистологов и эмбриологов, патологоанатомов.
Публикации. По материалам исследования опубликовано 9 научных работ, в том числе 7 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для представления результатов диссертационных исследований.
Объем и структура диссертации. Материал диссертации изложен на 127 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и приложений. Работа иллюстрирована 31 рисунком и 3 таблицами. Библиографический список включает 280 источников, из них 152 - иностранных.
Значение липидов для процессов остеогенеза и минерализации
Образование хряща в плечевой и бедренной костях человека, вернее в их закладках, начинается в стадии XVII по Streeter, а на месте лучевой и болыпеберцовой кости в стадии XIX. В закладках локтевой и малоберцовой костей хрящевая ткань формируется в стадии XX (Javor Р., 1974).
В этом периоде хондрогенеза скелетогенные клетки закладок трубчатых костей приобретают признаки хондробластов: контакты между ними отсутствуют, ядра слегка эксцентричны, много свободных рибосом, гранулярная эндоплазматическая сеть разрастается, уменьшается плотность митохондрий, появляются небольшие скопления гликогеновых гранул, число клеточных отростков уменьшается. В то же время межклеточное пространство значительно увеличивается и содержит электроноплотные гранулы и фибриллы с периодом поперечной исчерченности 5,5 нм, что показали на зародышах крыс и мышей S.C.Goel (1977), A.A.Missankov и V.A.Vasilev(1981).
На периферии бластемы клетки располагаются плотнее и формируют двухслойную надхрящницу, внутренний слой которой образован хондробластами, обеспечивающими оппозиционный рост хрящевой модели.
Хондроциты, находящиеся внутри провизорной хрящевой болванки, подразделяются некоторыми авторами, в частности, W.S.Hwang (1978), изучавшем хрящи ребер у плодов 26-38 недель внутриутробного развития и у зародышей человека теменно-копчиковой длины 80 мм, а также Н.В.Родионовой (1989) и А.А Докторовым (1991) на два типа. "Светлые" хондроциты характеризуются умеренно развитыми органеллами, эндоплазматической сетью, представленной относительно узкими каналами, и, самое главное, наличием в цитоплазме малоконтрастных вакуолей, содержащих хлопьевидное вещество и четкообразные филаменты и гранулы диаметром 50 нм. Наряду с этим имеются "тёмные" хондроциты, отличающиеся сильно развитой гранулярной эндоплазматической сетью с широкими цистернами, содержащими электроноплотное вещество в виде гранул. Аналогичные данные о качественном составе хондроцитов получены F.W.Browne (1977) при изучении хрящевой части костной мозоли, образовавшейся после экспериментального перелома большеберцовой кости у 4-недельных мышей.
Эти факты подтверждают и дополняют теорию П.М.Мажуги и В.З.Черкасова об адаптации хондроцитов к преимущественному синтезу или белков, в частности коллагена (хондроциты I типа), или полисахаридов -гликозаминогликанов, гликогена (хондроциты II типа). Эта теория была высказана авторами при изучении суставного хряща животных (Mazhuga P.M., Cherkasov V.V. 1974). Наблюдается почти полное соответствие ультраструктурной организации "тёмных" и "светлых" хондроцитов с хрящевыми клетками I и II типов соответственно (Мажуга П.М., Черкасов В.В., 1967; Черкасов В.В., 1969; Мажуга П.М., Черкасов В.В., 1971 а, б).
G.L.Streeter (1951) описал развитие хряща в закладке плечевой кости человека в период от 6,5 до 8 недель внутриутробного развития. Наиболее молодые и интенсивно делящиеся хондробласты располагаются в области концов хрящевой модели. В результате размножения этих клеток образуются ряды плоских, свободно лежащих хондроцитов, расположенные ближе к центру закладки. Еще центральнее становится заметно значительное увеличение межклеточного пространства в результате синтеза клеточными элементами компонентов хрящевого матрикса. Хондроциты становятся более крупными, а их цитоплазма - везикулярной. Хрящевые клетки достигают своего максимального размера и подвергаются крайней вакуолизации в следующей зоне, расположенной ближе предыдущей к центру модели. И, наконец, на последнем этапе развития, хондроциты начинают дегенерировать и распадаться.
Гистоавторадиографическими исследованиями установлено, что гипертрофии хондроцитов предшествует усиление синтеза ими сульфатированных полисахаридов, а также щелочной и кислой фосфомоноэстераз. Возможно, в результате нарушения выведения полисахаридов, они накапливаются в гиалоплазме хондроцитов, что, вследствие гидрофилии этих веществ, приводит к связыванию большого количества воды и гипертрофии клеток. Электронная микроскопия подтверждает, что в гипертрофированных хондроцитах не происходит увеличения объема органелл, а имеет место чрезмерная гидратация (Житников А.Я., 1975, б). По мере усиления гидратации происходит нарушение целостности цитоплазмы. Эти изменения в хряще способствуют прорастанию кровеносных капилляров (Кабак С.А., 1988; Marcus R., 1998.). Толщина межклеточных хрящевых перегородок уменьшается, в них появляются отложения фосфорно-кальциевых солей (Robling A., Stout S., 1999).
Оссификация закладок трубчатых костей начинается в середине хрящевой модели. Тонкий слой быстро кальцифицирующегося костного матрикса откладывается клетками внутреннего слоя надхрящницы -надкостницы между ним и той частью диафиза закладки, которая содержит гипертрофированные, дегенерирующие хондроциты, окруженные минерализованным хрящевым матриксом. Этот слой образует периостальный костный валик или манжетку. Как только первичная костная манжетка начинает четко вырисовываться, она пронизывается в различных точках кровеносными сосудами, которые иногда сопровождаются синусоидными капиллярами (Gardner Е., 1956; Saggese G., 1995).
Клетки кровеносных капилляров выполняют разрушительную и созидательную функцию при энхондральном остеогенезе. Так, резорбция хряща обусловлена проникновением капилляров в лакуны гипертрофированных хондроцитов, чему способствует прогрессирующее гидростатическое напряжение внутри хрящевых клеток. Очаги резорбции образуются в результате разрушения гипертрофированных хондроцитов с последующим разрывом стенки кровеносного сосуда. Освобождающаяся при этом силой гидростатического давления полость хондроцита заполняется периваскулярными, эндотелиальными и клетками крови, занимающими здесь упорядоченное расположение, причем периваскулярные клетки примыкают к стенкам хрящевой лакуны.
При рассмотрении вопроса об источниках остеогенных клеток высказываются различные мнения. В этом плане интересны работы А.С.Аврунина с соавт., (2000), Н.В.Корнилова, А.С.Аврунина (2001), L.J.Melton (1997), которые на эту роль выдвинули периваскулярные клетки. Эндостальные остеобласты дифференцируются из перицитов через стадию преостеобластов (Мажуга П.М., 1975, 1977). Н.В.Родионова (1975; 1982; 1984) на основании своих исследований с помощью электронной микроскопии, авторадиографии, электронной авторадиографии развития бедренной кости кроликов и крыс, также поддерживает взгляд на периваскулярные клетки как на источники образования преостеобластов и остеобластов. Автором подчеркивается важнейшая роль васкуляризации в остеогенезе.
При дальнейшем развитии эндохондрального окостенения, изучавшемся у кур методами электронной микроскопии, было установлено, что, вокруг остеобластов образуется перицеллюлярное влагалище зачаток костной балки, построенное из мельчайших глыбок аморфного вещества и частично агрегированных коллагеновых фибрилл с периодом 57-69 нм. Данный материал представляет собой остеоид, готовый к отложению костных минералов (Howlett C.R., 1980; Pandey А.К., 1992)
По данным W.W.Kuprijanow и N.G.Gontschar-Zaikina (1978), в различных костях плодов человека второй половины беременности между формирующимися костными балками обнаружены ангиомезенхимные лакуны. В них содержатся волокна и кровеносные капилляры, диаметром 5 -6 мкм. В ключице и плечевой кости ангиомезенхимные лакуны ориентированы по длиннику кости, в окончаниях лакун присутствуют функционально активные остеобласты. С развитием кости лакуны преобразуются в узкие костные каналы. К моменту рождения в костях формируется микроциркуляторное русло, представленное артериолами, пре-и посткапиллярами, а также венулами.
Роль гликозаминогликанов и протеогликанов в остеогенезе и минерализации на ранних стадиях пренатального развития
Гистохимически липиды в закладках бедренных костей изучали на криостатных срезах с использованием следующих реакций: I. окраска нейтральных дипидов Суданом III и IV по Кею и Уайтхеду, 2. окраска фосфолипидов жженым Суданом черным В по Беренбауму (Pearse Е., 1962).
Для контроля специфичности реакций и идентификации липидов и фосфолипидов применялись экстракционные методы по Кейлиг и Бекер (Pearse Е., 1962).
После окраски на нейтральные липиды некоторые препараты подкрашивались гематоксилином Караци.
Для исключения возможного маскирующего эффекта окрашивания полисахаридов на выявление липидов, контрольные препараты подвергались обработке тестикулярной гиалуронидазой (0,3 мг/мл) в 0,1М растворе хлорида натрия в смеси с равным количеством 0,1 М ацетат-уксусного буфера (рН=4,9). Инкубация продолжалась 6 часов при +37С.
Материал для электронномикроскопического исследования липидов обрабатывали и заливали в эпон по ускоренному методу, обеспечивающему сохранность данных веществ (Stein О., Stein Y.,1967).
Спектр липидов и фосфолипидов закладок бедренных костей человека исследовался методом тонкослойной хроматографии, для чего из исследуемого материала были получены липидные экстракты по методу Фольча, изложенному в руководстве А.А.Покровского (1969). Разделение общих липидов и фосфолипидов на фракции проводили на пластинках "Silufol" с слоем силикагеля фирмы "Kavalier" (Чехия). Для проявления общих липидов использовалась система растворителей гексан-эфир-ледяная уксусная кислота, а для выявления спектра фосолипидов - хлороформ-метанол-вода (Stahl Е., 1965). Контроль и идентификация фракций производились по параллельным (выполненным на одной и той же пластинке) хроматограммам липидов сывороток крови женщин, имеющих такой же срок беременности, как и женщины, от которых был получен материал.
С целью выявления сульфатированных гликозаминогликанов, парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм обрабатывались 0,5% раствором коричневого основного по способу М.Г.Шубича (1961).
Для дифференцированного определения хондроитинсульфата и кератансульфата применяли окраску 0,1% раствором альцианового синего на ацетатном буфере (рН=5,8) с использованием метода критической концентрации электролита (Лопунова Ж.К., с соавт., 1969; Шубич М.Г. Лспунова Ж.К., 1973). В качестве неорганического электролита применяли магния хлорид - 0,9 М хлорид магния в 0,1% растворе альцианового синего для окраски на кератансульфат и раствор красителя с 0,4 М хлорида магния для суммарной гистохимической реакции на хондроитинсульфат и кератансульфат (Копьева Т.Н., с соавт., 1983).
Разделение исследуемых гликозаминогликанов по степени кислотности, в значительной степени зависящей от количества сульфогрупп, достигалось применением окраски 0,5% раствором толуидинового синего при различных кислых значениях рН мединал-ацетатного буфера, применяемого в качестве растворителя краски. При рН=2,62 выявлялись кислые высокосульфатированные гликозаминогликаны, а при рН=6,12 -менее кислые, низкосульфатированные вещества этой группы (Pearse Е., 1962).
Для контроля специфичности выявления гликозаминогликанов применяемыми гистохимическими реакциями, гистологические препараты параллельных серий подвергались обработке тестикулярной гиалуронидазой (0,3 мг/мл) в 0,1М растворе хлорида натрия в смеси с равным количеством 0,1 М ацетат-уксусного буфера (рН=4,9). Инкубация продолжалась 6 часов при +37С. Содержание гликозаминогликанов в закладках бедренных костей оценивали визуально под световым микроскопом в баллах (или по системе плюсов) (Шаповалов Ю.Н., 1962).
Отсутствие окрашивания рассматривалось как субпороговое (минимальное) для данного красителя содержание гликозаминогликанов (0 баллов, -). Очаговое бледное метахроматическое красно-фиолетовое окрашивание толуидиновым синим расценивалось как низкое содержание гликозаминогликанов (1 балл, +), диффузное бледное красно-фиолетовое -умеренное содержание гликозаминогликанов (2 балла, ++), диффузное яркое красно-фиолетовое окрашивание - как значительное их содержание (3 балла, +++).
Бледноголубое окрашивание альциановым синим ставилось в соответствие с малым содержанием гликозаминогликанов (I балл, +), голубое -рассматривалось как умеренное (2 балла, ++), яркоголубое свидетельствовало о значительном содержании этих веществ (3 балла, +++).
Низким содержание сульфатированных гликозаминогликанов считали при светложелтом окрашивании основным коричневым (1 балл, +), умеренным - при насыщенном желтом окрашивании (2 балла, ++), и значительным - при желто-коричнев ом (3 балла, +++).
Для электронномикроскопического исследования локализации гликозаминогликанов ультратонкие срезы контрастировали на сетках 0,5% раствором нитрата висмута по A.Serafini-Fracassini, J.W.Smith (1966).
Количество хондроцитов в единице объема хрящевых закладок бедренных костей человека в процессе раннего остеогенеза вычислялось по формуле (1) (Автандилов Г.Г., 1973): N . N . = D (мм"3) (1) где: и - количество хондроцитов, содержащихся в единице объема N . ткани; т - количество срезов хондроцитов, подсчитанное в единице площади случайного гистологического среза; г - средний диаметр хондроцитов в изучаемом срезе. На ультраструктурном уровне определялось ядерно-плазматическое отношение по формуле (2) и вычислялась частота встречаемости конкретного его значения (h) в исследуемой возрастной группе: N/P = S? (2) где: Sn - площадь сечения ядра хондроцита, Sp - площадь сечения его цитоплазмы, измеренные на электронограмме.
В период раннего остеогенеза в различных отделах закладок бедренных костей была определена абсолютная удельная поверхность мембран эндоплазматической сети хондроцитов, т.е. количество квадратных микрометров поверхности мембран эндоплазматической сети, содержащихся в одном кубическом микрометре его цитоплазмы (Автандилов Г.Г., 1973; Автандилов.Г.Г., с соавт., 1981).
На электронограммах подсчитывалось количество отпочковывающихся от наружной поверхности хондроцитов везикул матрикса (Borg Т.К., et. al., 1981) в разных зонах и стадиях развития хрящевой закладки.
Количественные данные, полученные в ходе выполнения исследования, проанализированы методами вариационной статистики и определения достоверности различий с помощью непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. При проведении статистической обработки использовалась утилита OpenOffice Calc из свободно распространяемого программного продукта OpenOffice (Ver. 3.0), работающая под управлением операционной системы Windows ХР Ноше Edition (сертификат OEM Х12-53766).
Этапы минерализации на ранних стадиях морфогенеза бедренных костей человека в различных геохимических территориях
Если у хондроцитов I типа различие мод ядерно-цитоплазматического отношения для Астрахани и Махачкалы имеет лишь характер тенденции, то для хондроцитов II типа это различие статистически достоверно (Р 0,05).
Подобным образом варьирует и значение абсолютной удельной поверхности мембран эндоплазматической сети хондроцитов эпифизарных отделов закладок этого срока (рис. 9). Мода абсолютной удельной поверхности мембран эндоплазматической сети хондроцитов эпифизарных отделов закладок бедренных костей человека на 9 - 10 неделях пренатального развития для хондроцитов I типа в г.Астрахани равна 0,365 мм" . 0,
Варьирование значения абсолютной удельной поверхности мембран эндоплазматической сети хондроцитов эпифизарных отделов закладок бедренных костей человека на 9 - 10 неделях пренатального развития.
Для г.Махачкалы аналогичный параметр равен 0,37 мм" , но различия по нему с г.Астраханью статистически не достоверны, так как большая встречаемость хондроцитов I типа именно с таким значением абсолютной удельной поверхности мембран эндоплазматической сети в этом регионе нивелируется большим числом хондроцитов с близкими значениями данного параметра в г.Астрахани ("плоская" кривая).
Моды абсолютной удельной поверхности мембран эндоплазматической сети хондроцитов эпифизарных отделов закладок бедренных костей человека на 9 - 10 неделях пренатального развития для хондроцитов II типа для Астрахани и Махачкалы практически одинаковы -0,33 мм" . Однако мода для зоны с высокой минерализацией более "плоская", что свидетельствует о большем числе хрящевых клеток данного типа, имеющих близкое значение удельной поверхности эндоплазматической сети.
Следующий период остеогенеза характеризуется продолжением и развитием интенсивных процессов оссификации в закладках бедренных костей человека. В это время (11 - 12 недель пренатального развития) интенсифицируется эндохондральное окостенение путем инвазии кровеносных капилляров в зону гипертрофированных и дегенерирующих хондроцитов, вместе с которыми в закладку кости проникают перивасрулярные - остеогенные клетки. Дифференцируясь через стадию преостеобластов в остеобласты, они начинают выработку остеоида с последующей его минерализацией.
Варьирование ядерно-цитоплазматического отношения в хондроцитах эпифизарных отделов закладок бедренной кости предплодов человека 11, 12 недель пренатального развития.
Как и в предыдущий период развития (9, 10 недель), в эпифизарных отделах закладок бедренных костей на 11, 12 неделях пренатального развития и в г.Астрахани и в г.Махачкале присутствуют хондроциты двух типов с различными морфологическими и цитометрическими признаками, варьирующими по бимодальному распределению. Так, мода значений ядерно-плазматического отношения в хондроцитах I типа эпифизарных отделов закладок бедренных костей предподов 11, 12 недель пренатального развития в г.Астрахани равна 0,66; а в хондроцитах II типа этот показатель имеет значение 0,62 - 0,64 с достоверной степенью различия с аналогичным параметром хрящевых клеток I типа (Р 0,05) (рис. 10).
В г.Махачкале кривая распределения ядерно-цитоплазматического отношения в хондроцитах II типа эпифизарных отделов закладок бедренной кости предплодов человека 11, 12 недель пренатального развития имеет максимум на значении 0,635 и более остроконечна в сравнении с аналогичной кривой для хондроцитов этого типа в г.Астрахани.
Для хондроцитов I типа мода распределения ядерно-цитоплазматического отношения в эпифизарных отделах закладок бедренной кости предплодов человека 11, 12 недель пренатального развития равна 0,67 и статистически достоверно отличается как от мод для хондроцитов II типа г.Махачкалы (Р 0,01), так и от аналогичного параметра хондроцитов I типа г.Астрахани (Р 0,05).
При сравнительном анализе кривых варьирования абсолютной удельной поверхности мембран эндоплазматической сети хондроцитов I и II типов эпифизарных отделов закладок бедренных костей человека на 11 - 12 неделях пренатального развития в г.Астрахани и г.Махачкале (рис.11) обращает на себя внимание значительно большая "сближенность" двух мод этого параметра для г.Махачкалы, что делает меньше разницу их значений (Р 0,05), по сравнению с аналогичной разницей для хондроцитов в г.Астрахани. Также в г.Махачкале чаще встречаются хондроциты I типа с высокой абсолютной удельной поверхностью мембран эндоплазматической сети.
Проведенное исследование позволило выявить, что на ранних стадиях хондрогенеза (6-8 недель внутриутробного развития) хондроциты закладок бедренных костей человека и в г.Астрахани и в г.Махачкале представляют собой гомогенную группу. Это подтверждается нормальным законом распределения цитометрических признаков, который хорошо соответствует опытным вариационным кривым. Данные признаки характеризуют хондроциты ранних стадий остеогенеза как малодифференцированные клетки с большой генеративной способностью.
Количество клеточных элементов в единице объема метафизарных отделов закладок 6-8 недель внутриутробного развития довольно велико, они плотно прилегают друг к другу из-за малого количества межклеточного вещества.
В хрящевых закладках бедренных костей человека в изучаемых геохимических регионах, начиная с 9 недели внутриутробного развития, наблюдается неоднородность клеточного состава. Хондроциты I типа характеризуются крупным ядром, значительным развитием шероховатой эндоплазматической сети, наблюдается наличие в многочисленных вакуолях, образованных эргастоплазмой, электронноплотного, осмиофильного содержимого.
У хондроцитов II типа ядро более мелкое, что подтверждается постоянным преобладанием по величине ядерно-плазматического отношения у хондроцитов I типа. Эндоплазматическая сеть развита слабее. Показатель абсолютной удельной поверхности её мембран также свидетельствует об этом, постоянно уступая в хондроцитах II типа аналогичному показателю хрящевых клеток I типа. В цитоплазме хондроцитов II типа имеются крупные вакуоли с малоконтрастным веществом в виде тонких и коротких филамент и хлопьев.
Необходимо отметить, что моды цитологических параметров, а именно, ядерно-цитоплазматического отношения и абсолютной удельной поверхности мембран эндоплазматической сети для хондроцитов и I и II типов на изучаемых этапах пренатального онтогенеза в г.Махачкале статистически достоверно смещены в сторону больших значений по сравнению с г.Астраханью.
С развертыванием процессов остеогенеза в хондроцитах и I и II типов достоверно уменьшается ядерно-цитоплазматическое отношение, и достоверно повышается абсолютная удельная поверхность мембран эндоплазматической сети, отражающая усиление способности к синтезу составных частей межклеточного вещества хряща и остеоида.
Также в процессе остеогенеза в закладках бедренных костей в результате синтеза межклеточного вещества и гипертрофии хондроцитов плотность упаковки их, выражаемая числом клеток в единице объема, падает.
Гликозаминогликаны в раннем остеогенезе бедренных костей человека в геохимически различающихся областях проживания
В данной работе мы представили в сравнительном аспекте сведения о нормальных процессах остеогенеза и минерализации закладок бедренных костей человека, как характерных представителей трубчатых костей, на 7 -12 неделях пренатального онтогенеза в геохимически различающихся регионах Северного Кавказа и Нижнего Поволжья. Сравнивались также динамика содержания и спектр некоторых факторов остеогенеза и минерализции в закладках бедренных костей в процессе раннего пренатального развития.
По мнению П.М.Мажуги (1975, 1977), А.Я.Житникова (1976), Г.И.Лаврищевой с соавт. (1981) и других исследователей законы и механизмы остеогенеза едины. Эндохондральный и перихондральный остеогенез на ранних стадиях и на более поздних этапах онтогенеза протекают по одной схеме, "ибо "природа не может быть расточительной (Watson D., 1967).
Остеогенез является важнейшим формообразующим процессом для кости как органа. Естественно, что интенсивные процессы остеогенеза не могут быть вне сферы внимания при изучении процессов органогенеза кости на этапах пренатального развития. Как нам представляется, к главным звеньям остеогенеза относятся гистогенез, минерализация, углеводный, и липидный обмены веществ в костной ткани. Эти составные части остеогенеза, как показал анализ литературы, недостаточно изучены у человека вообще, а в случае экзогенного влияния на них, тем более.
Изменения в любом из этих звеньев, вызванные, например, особенностями микроэлементного окружения, может вести к трансформациям органогенеза кости, тонкие механизмы которых во всех чертах в настоящее время неизвестны.
Мы надеемся, что проведенное исследование в какой-то степени способно осветить некоторые стороны данной проблемы. В работе было выявлено, что, если на ранних стадиях хондрогенеза (6 -8 недель пренатального развития) хондроциты закладок бедренных костей человека и в г.Астрахани и в г.Махачкале представляют собой гомогенную группу клеток, то на более поздних стадиях (9- 10и 11 -12 недель внутриутробного развития) налицо неоднородность клеточного состава хрящевых закладок в обеих геохимических зонах.
Хондроциты можно разделить по признаку преимущественного синтеза ими или белкового (хондроциты I типа) или углеводного компонента матрикса хряща (хондроциты II типа) на две примерно равные по численности группы, что хорошо согласуется с данными исследований П.М.Мажуги и В.В.Черкасова (1974), которое было проведено ими, однако, на суставном хряще молодых крыс.
С развертыванием процессов остеогенеза цитоморфометрические показатели свидетельствуют о снижении репродукционной способности хондроцитов и об их дифференцировке и специализации. Об этом, в частности, говорит прогрессирующее уменьшение количества хондроцитов в единице объема метафизов закладок бедренных костей человека на всех рассматриваемых этапах пренатального онтогенеза.
Следует отметить статистически достоверное превышение количества хондроцитов в метафизарных отделах закладок бедренных костей в г.Махачкале по сравнению с г.Астраханью на всех рассматриваемых периодах раннего остеогенеза человека, что, возможно, свидетельствует о повышенной генерационной способности хондробластов в геохимической зоне с высокой минерализацией.
На стадиях 6-8 недель пренатального развития ядерно-цитоплазматическое отношение и абсолютная удельная поверхность мембран эндоплазматической сети, отражающая плотность их упаковки в клетке, в хондроцитах диафизарного отдела закладок в обоих изучаемых геохимических районах статистически не различаются. Исследование цитометрических показателей - ядерно-цитоплазматического отношения и площади абсолютной удельной поверхности мембран эндоплазматической сети - также свидетельствует о неоднородности популяции хондроцитов закладок бедренных костей человека на стадиях пренатального развития 9 - 10 и 11 - 12 недель.
Примечательно статистически достоверное превалирование моды ядерно-цитоплазматического отношения у хондроцитов II типа г.Махачкалы над таким же параметром аналогичных хрящевых клеток из г.Астрахани на стадии 9-10 недель пренатального развития. Это может свидетельствовать в пользу предположения о большей интенсивности процессов синтеза углеводного компонента матрикса хряща в клетках из геохимической зоны с большей минерализацией.
На стадии 9 - 10 недель намечается "сдвиг вправо" кривых варьирования ядерно-цитоплазматического отношения и абсолютной удельной поверхности мембран эндоплазматической сети хондроцитов эпифизарных отделов закладок бедренной кости из г.Махачкалы по отношению к г.Астрахани. Это может служить подтверждением предположения о начинающейся интенсификации синтеза и белкового и минерального компонентов хрящевого матрикса в зоне с большей минерализацией окружающей среды.
На следующих этапах внутриутробной оссификации закладок бедренных костей (11 - 12 недель) процесс интенсификации синтеза компонентов матрикса в геохимической зоне с высокой минерализацией продолжает развиваться, о чем свидетельствует увеличение вышеописанного "сдвига вправо".
Этапы минерализации, выявляемые с помощью морфологических методик, в минерализующемся хряще диафизарного отдела закладок бедренных костей и в остеоиде при пери- и эндохондральном остеогенезе в обеих изучаемых геохимических зонах принципиально сходны. Процессы, приводящие к насыщению минеральными солями, начинаются с образования везикул матрикса, проходят стадию калькосферитов, как конгломератов везикул матрикса, эпитаксиального роста кристаллов гидрооксиапатита из калькосферитов и фазовых превращений, приводящих к переходу аморфного, лабильного кальций-фосфата в стабильный кристаллический гидрооксиапатит.
Обращает на себя внимание тенденция превышения количества везикул матрикса в закладках бедренных костей из г.Махачкалы, что может служить косвенным признаком более интенсивных процессов минерализации в данном геохимическом регионе.
Различие в процессах отложения минерального компонента в минерализующемся хряще и остеоиде заключается, по нашему мнению, в том, что в минерализации хряща, происходящей в анаэробных условиях, наиболее деятельную роль играют калькосфериты, лежащие свободно в перицеллюлярной области, тогда как минерализацию остеоида, происходящую в аэробных условиях, в большей степени обеспечивают калькосфериты, ассоциированные с волокнами коллагена. Повышенное содержание кислорода, возможно, создает предпосылки к образованию на коллагене активных участков, к которым и прикрепляются калькосфериты.
Из проведенного исследования локализации, качественного и количественного состава липидов на ранних стадиях пренатального остеогенеза (от б до 12 недель внутриутробного развития) следует, во-первых, что вещества этой группы присутствуют во всех отделах закладок бедренных костей этого периода, и, во-вторых, количественное содержание липидов и их качественный состав определенным образом изменяются в зависимости от локализации в закладке и стадии остеогенеза.