Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Оогенез у мыши 12
1.2. Ядрышко – основной структурный домен клеточного ядра эукариот 17
1.2.1. Ядрышки соматических клеток 17
1.2.2. Основные белки ядрышек 20
1.2.3. Производные ядрышка в митозе и мейозе 22
1.3. Ядрышко-подобное тельце – производное ядрышка в предовуляторных ооцитах 23
1.3.1. Изменение морфологии ядрышек во время роста ооцита 23
1.3.2. ЯПТ предовуляторных ооцитов 25
1.3.3. Ультраструктурная организация ЯПТ ооцитов NSN- и SN-типов 27
1.3.4. Результаты исследований состава ЯПТ 29
1.3.5. Современные представления о функциях ЯПТ 33
1.4. Заключение 36
2. Материалы и методы 37
2.1. Материалы 37
2.1.1. Лабораторное оборудование 37
2.1.2. Реактивы 38
2.1.3. Антитела 39
2.1.4. Культура клеток 41
2.1.5. Лабораторные животные 41
2.2. Методы 41
2.2.1. Окрашивание фибробластов NIH/3Т3 РНК-связывающими красителями акридиновым оранжевым и пиронином Y.
2.2.2. Окрашивание внутриклеточных белков с помощью ФИТЦ 42
2.2.3. Иммуноцитохимическое выявление белков в клетках NIH/3T3 42
2.2.4. Иммуноцитохимическое выявление белков в клетках NIH/3T3 после фиксации 70%-ным этанолом 43
2.2.5. Выявление мест синтеза рибосомной РНК в клетках NIH/3Т3 43
2.2.6. Флуоресцентная гибридизация in situ на клетках NIH/3Т3 44
2.2.7. Гормональная стимуляция мышей и выделение GV ооцитов 45
2.2.8. Прижизненное окрашивание GV ооцитов Hoechst 33342 45
2.2.9. Окрашивание GV ооцитов акридиновым оранжевым 2.2.10. Окрашивание выделенных ооцитов пиронином Y 46
2.2.11. Окрашивание ооцитов красителем ФИТЦ 46
2.2.12. Иммунофлуоресцентное мечение ооцитов после фиксации ПФА и обработки протеиназой К 47
2.2.13. Визуализация транскрипции путем микроинъекций в ооциты Бр-УТФ 47
2.2.14. Флуоресцентная гибридизация in situ GV ооцитов 49
2.2.15. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия 50
3. Результаты 51
3.1. Использование клеток NIH/3Т3 для оптимизации условий использования флуоресцентных красителей, антител к ядрышковым белками и зондов к ядрышковой РНК 51
3.1.1. Окрашивание клеток РНК-связывающим красителем акридиновым оранжевым 51
3.1.2. Окрашивание клеток флуоресцентным РНК-связывающим красителем пиронином Y 51
3.1.3. Использование ФИТЦ – флуоресцентного красителя для выявления белков 53
3.1.4. Оптимизация условий выявления белков антителами без обработки и после демаскирования антигенов протеиназой К 53
3.1.5. Визуализация транскрипции РНК полимеразы I в соматических клетках с помощью Бр-УТФ 55
3.1.6. Оценка специфичности олигонуклетидных зондов к рРНК и мякРНК в фибробластах NIH/3T3
3.2. Определение типа GV ооцитов мыши с помощью ДНК-связывающего красителя 57
3.3. Цитохимическое выявление РНК в GV ооцитах мыши 58
3.4. Выявление белкового компонента в GV ооцитах мыши с помощью ФИТЦ 62
3.5. Иммуноцитохимическое выявление белков ядрышка в GV ооцитах мыши 65
3.6. Выявление мест синтеза первичных транскриптов пре-рРНК с помощью Бр-УТФ в GV ооцитах 69
3.7. Выявление рРНК и мякРНК в GV ооцитах мыши методом FISH 75
4. Обсуждение 80
4.1. Влияние способа фиксации на выявление макромолекул в ЯПТ 80
4.2. Ядрышковые компоненты ЯПТ 83
4.3. Особенности состава ЯПТ ооцитов NSN- и SN-типов
5. Заключение 90
6. Выводы 93
7. Список литературы
- Ядрышки соматических клеток
- Окрашивание фибробластов NIH/3Т3 РНК-связывающими красителями акридиновым оранжевым и пиронином Y.
- Окрашивание клеток флуоресцентным РНК-связывающим красителем пиронином Y
- Особенности состава ЯПТ ооцитов NSN- и SN-типов
Ядрышки соматических клеток
Наиболее изученными белками ядрышка являются белки, участвующие во всех этапах биогенеза рибосом – транскрипции рДНК, процессинге рРНК, сборке и транспорте рибосомоных частиц, такие как UBF, фибрилларин, NPM1, нуклеолин.
Белок UBF (upstream binding factor) – это специфический транскрипционный ко-фактор РНК полимеразы I, который в нормальных условиях располагается только в ядрышках. Согласно данным ультраструктурной иммуноцитохимии, внутри ядрышек UBF локализуется, преимущественно, в ФЦ (Goessens, 1984). На светооптическом уровне места локализации UBF видны как многочисленные дискретные фокусы («точки»), общее число и размеры которых указывают на активность транскрипции рДНК. Показано, что число фокусов UBF увеличивается (может достигать нескольких десятков), а размеры фокусов уменьшаются (до 0.5-1 мкм) в более активных и крупных ядрышках (Zatsepina et al., 1993). UBF - это структурный белкок, который связывается с энхансерной областью рибосомного повтора, что приводит вытеснению из энхансера линкерного гистона Н1, «открывает» структуру хроматина и способствует сборке комплекса инициации транскрипции на промотере гена (Kermekchiev et al., 1997; Grummt, 2013). Таким образом, основная функция UBF включает поддержание активной («открытой») конформации рибосомных генов и обеспечение транскрипции рДНК, осуществляемой РНК полимеразой I (Sanij, Hannan, 2009; Goodfellow, Zomerdijk, 2012; Sobol et al., 2014).
Белок ядрышка фибрилларин – один из наиболее эволюционно-консервативных белков, гомологи которого присутствуют в клетках разных биологических видов от археобактерий до человека (Henriquez et al., 1990; Amiri, 1994; Newton et al., 2003; Amin et al., 2007). У эукариот фибрилларин локализуется в ПФК ядрышка (Fomproix et al., 1998), входит в состав малых ядрышковых РНП (мякРНП) и является основной ядрышковой метилтрансферазой, принимающей участие в метилировании и процессинге пре-рРНК (Tollervey, Kiss, 1997; Lafontaine, Tollervey, 2000; Boisvert et al., 2007). Помимо энзиматической функции, фибрилларин может играть структурную роль, поскольку сохраняется в неактивных остаточных ядрышках (Барыгина и др., 2012), а при индуцированном истощении внутриклеточного пула фибрилларина морфология ядрышка и ядра нарушается (Amin et al., 2007). Помимо ядрышка, фибрилларин располагается также в тельцах Кахала в ядре, однако, его функция в составе телец до сих пор остается не выясненной.
Белок NPM1 (B23, нуклеофозмин, или NO38) принято считать основным белком и маркером гранулярного компонента ядрышка, несмотря на то, что значительные количества NPM1 присутствуют также в ядре, а следовые количества – в цитоплазме (Ochs, 1998; Colombo et al., 2011). Существует две изоформы NPM1 - В23.1 и В23.2, которые образуются в результате альтернативного сплайсинга общей мРНК (Wang et al., 1993). Изоформа В23.1 локализуется преимущественно в ядрышках, тогда как В23.2 присутствует в основном в ядре (Wang et al., 1993; Colombo et al., 2011). NPM1 - это многофункциональный ядрышковый белок. Он участвует в регуляции транскрипции рибосомных генов (Murano et al., 2008; Colombo et al., 2011), процессинге рРНК и сборке рибосомных частиц (Herrera et al., 1995; Savkur and Olson, 1998; Itahana et al., 2003). Ингибирование экспрессии NPM1 приводит к уменьшению содержания 28S рРНК и увеличению количества 32S интермедиатов рРНК (Itahana et al., 2003). NPM1 взаимодействует с несколькими рибосомными белками (RPL5, RPS9, RPL23 и RPS10), что способствует формированию комплекса этих белков с рРНК (Savkur, Olson, 1998; Lindstrom, 2011). Кроме того NPM1 участвует в экспорте рибосомных субъединиц в цитоплазму, так что блокирование перемещения NPM1 из ядра в цитоплазму и обратно приводит к ингибированию экспорта рибосомных субъединиц, что вызывает замедление роста клеток (Maggi et al., 2008).
Нуклеолин (С23) – это тоже многофункциональный белок, который подобно NPM1, локализуется в ядрышке (преимущественно в ГК), а также в ядре и цитоплазме (Ochs, 1998). Взаимодействуя с рибосомными белками, нуклеолин участвует в сборке рибосомных частиц и их экспорте в цитоплазму (Tajrishi et al., 2011), а взаимодействуя с рРНК - в поздних этапах процессинга рРНК (Tuteja and Tuteja, 1998; Ginisty et al., 1999). Помимо регуляции различных этапов синтеза рибосом, нуклеолин регулирует метаболизм ДНК и РНК, структуру хроматина, цитокинез и пролиферацию клеток (Tajrishi et al., 2011).
Белки рибосом RPL26 и RPS10 (ribosomal proteins L26 и S10) входят в состав большой (60S) и малой (40S) субъединиц цитоплазматических рибосом соответственно. Оба белка присутствуют также в гранулярном компоненте ядрышек, где взаимодействуют с NPM1 (Ren et al., 2010; Preti et al., 2013). Путем нокдауна RPL26 в клетках HeLa показано, что уменьшение его содержания приводит к уменьшению содержания 32S интермедиатов рРНК (Gazda et al., 2012). Нокдаун RPS10 в клетках HeLa приводит к уменьшению содержания 18S рРНК, что свидетельствует о его необходимости для процессинга предшественников 18S рРНК и образования малой субъединицы рибосом (Doherty et al., 2010). 1.2.3. Производные ядрышка в митозе и мейозе
При вхождении клеток в митоз транскрипция рДНК, происходящая на протяжении всей интерфазы, постепенно снижается и полностью прекращается в поздней профазе (Gbrane-Youns et al., 1997). При этом часть ядрышковых белков фосфорилируются циклин В-зависимой киназой 1, что приводит к структурному распаду ядрышка и выходу большей части его белков и рРНК в нуклеоплазму, а затем - в цитоплазму (Hernandez-Verdun, 2011). Однако транскрипционный аппарат РНК полимеразы I сохраняетcя связанным с ЯОР хромосом на протяжении всего митоза (Roussel et al., 1996). Возобновление транскрипции рДНК в анафазе (или ранней телофазе) митоза запускает процесс реконструкции ядрышек, в котором участвуют два типа ядрышковых производных: проядрышки (prenucleolar bodies, PNBs) и ядрышковые дериваты (nucleolus-derived foci, NDFs). PNBs и NDFs сходны по морфологии, содержат факторы процессинга пре-рРНК, непроцессированную и зрелую рРНК, однако, различаются по локализации и времени образования: (Dundr and Olson, 1998; Dundr et al., 2000). Цитоплазматические ядрышковые дериваты собираются в цитоплазме в поздней анафазе или ранней телофазе, тогда как проядрышки образуются в дочерних ядрах в конце телофазы (Zatsepina et al., 1997; Dundr and Olson, 1998; Жарская и Зацепина, 2007). Белки PNBs сразу включаются в состав реконструирующихся ядрышек, тогда как белки NDFs сначала проникают через ядерную оболочку внутрь телофазных ядер (Dundr et al., 2000). Показано, что проядрышки, подобно ядрышкам, способны к процессингу содержащейся в них рРНК, поскольку истощение пула факторов процессинга рРНК увеличивает время существования проядрышек (Carron et al., 2012). Несмотря на то, что в ядрах соматических клеток присутствуют разные РНК-содержащие образования (Dundr, 2012), прямых аналогов проядрышек и цитоплазматических дериватов в интерфазных клетках не описано.
Профаза I мейоза в ооцитах млекопитающих отличается от профазы митоза по многим признакам. Мейотическая профаза намного длиннее по продолжительности (у человека профаза I длится до 40 лет), сопровождается ростом ооцита, а транскрипция рДНК на разных стадиях профазы I (лептотена, зиготена, пахитена, диплотена) происходит активно, снижаясь лишь к концу диплотены (Moore and Lintern-Moore, 1974; Kaplan et al., 1982; Moore and Lintern-Moore, 1978). Важно отметить, что ядрышки ооцитов примордиальных, первичных и многослойных преантральных фолликулов имеет характерную трехкомпонентную структура и по морфологии не отличаются от ядрышек соматических клеток (Choinard, 1971; Почукалина и Парфенов, 2006). После окончания роста ооцита типичное ядрышко перестраивается с образованием структуры, названной ядрышко-подобным тельцем (ЯПТ, nucleolus-like body, Szllsi et al., 1991), морфология которого резко отличается от ядрышек соматических клеток и их производных, образующихся в митозе.
Окрашивание фибробластов NIH/3Т3 РНК-связывающими красителями акридиновым оранжевым и пиронином Y.
Выделенные ооциты фиксировали 3%-ным ПФА в ФСБ 15 мин при комнатной температуре. Ооциты отмывали в трех сменах ФСБ по 5 мин каждая и обрабатывали 0.2%-ным раствором Тритона X–100 в течение 20 мин. Фиксированные и обработанные Тритоном Х-100 ооциты промывали в трех сменах ФСБ по 5 мин каждая. Ооциты опытной группы переносили в раствор протеиназы К в концентрации 1 мкг/мл или 2 мкг/мл, приготовленную в ФСБ, и инкубировали в течение 20, 40, 80 или 160 мин при 22 С. Состояние ооцитов контролировали в фазово-контрастном микроскопе Primovert («Carl Zeiss», Германия). Ооциты контрольных групп выдерживали 10, 20, 40, 80 и 160 мин при 22 С в ФСБ без протеиназы К. Ооциты контрольной и опытной групп фиксировали 3%-ным ПФА в ФСБ 30 мин, отмывали ФСБ (35 мин) и обрабатывали 0.2%-ным раствором Тритона X–100 в течение 20 мин. После тщательной отмывки в ФСБ (45 мин) ооциты инкубировали с первичными антителами (Таблица 2) в течение 60 мин, промывали в трех сменах ФСБ по 5 мин каждая и переносили во соответствующие вторичные антитела (см. раздел 2.1.3.) на 60 мин. Промывали в трех сменах ФСБ по 5 мин каждая и окрашивали Hoechst 33342 10 мин. Промывали в трех сменах ФСБ по 5 мин каждая. Окрашенные ооциты заключали в заливочную среду Vectashield. Все операции, производили при комнатной температуре; все интубации с антителами и красителями производили во влажных камерах в темноте.
Визуализация транскрипции путем микроинъекций в ооциты Бр-УТФ Визуализацию мест синтеза РНК в ооцитах NSN- и SN-типа производили путем микроинъекций предшественника Бр-УТФ в цитоплазму ооцитов. Кроме специально обозначенных случаев, все ооциты перед инъекцией инкубировали в среде М2, содержащей дбцАМФ (100 мкг/мл) и 10 мкг/мл -аманитина при 37о C.
Микроинъекцииции Бр-УТФ проводили под контролем инвертированного микроскопа ICM 405 («Opton», Германия) с использованием микроманипулятора («Opton», Германия), шприца с винтовой подачей поршня, заполненного вазелиновым маслом, и микроинъектора («Eppendorf», Германия). В крышку от пластиковой чашки Петри (35х10 мм) помещали каплю среды М2 объемом 35 мкл, в которую переносили ооциты. Для предохранения капли от высыхания чашку заполняли минеральным маслом. В инъекционную пипетку набирали раствор для микроинъекций. Удерживающую пипетку закрепляли в держателе микроманипулятора и заполняли вазелиновым маслом для фиксации ооцита. Пипеткой для микроинъекций впрыскивали раствор для микроинъекций в цитоплазму ооцита. В цитоплазму одного ооцита инъецировали 1±0.5 пл раствора, содержащего 100 мМ 5-броуридина 5 -трифосфата (натриевая соль), 140 мM KCl, 2 мM Pipes (pH 7.4) и 50 мкг/мл -аманитина. Ранее показано, что в данных условиях происходит ингибирование транскрипции РНК полимеразы II, но не РНК полимеразы I (Bouniol et al., 1995; Bouniol-Baly et al., 1999; Masson et al., 1996; Waksmundzka et al., 2001). Для подавления транскрипции РНК полимеразы II и III ооциты инкубировали в среде М2, содержащей 100 мкг/мл дбцАМФ и 100 мкг/мл -аманитина (Wansink et al., 1993) и инъецировали их 5-10 пл транскрипционного буфера, содержащего 100 мкг/мл -аманитина (Pesty et al., 2007). Транскрипцию РНК полимеразы I и РНК полимераз II/III можно различить с помощью инкубации ооцитов в присутствии актиномицина Д в низкой концентрации (0.25 мкг/мл) (Bensaude, 2011; Moore, 1975). Для ингибирования транскрипции всех РНК полимераз в среду М2 добавляли 0.25 мкг/мл актиномицина Д и 100мкг/мл -аманитина. В контрольных экспериментах ооциты культивировали в среде М2+100 мкг/мл дбцАМФ без добавления ингибиторов. Состав сред, использованных для пре-инкубации, инъекций и пост-инкубации представлен в Таблице 3.
После микроинъкций ооциты переносили в среду М2+дбцАМФ+ингибиторы (Таблица 3) на 30 мин при 37C. Контрольные ооциты инкубировали в среде М2+дбцАМФ без ингибиторов в течение того же времени. Затем ооциты фиксировали 70% этанолом в течение 20-30 мин (предложенный нами способ фиксации ооцитов) или 3%-ным ПФА в течение 20-30 мин (стандартный способ фиксации ооцитов). После фиксации ПФА ооциты обрабатывали детергентом, как описано в разделе, 2.2.11. Фиксацию 70%-ным спиртом производили, как описано в разделе 2.2.1. Ооциты отмывали в трех сменах ФСБ и переносили в мышиные моноклональные антитела к Бр-дУТФ, также узнающие Бр-УТФ, на 1 час, отмывали в ФСБ (310 мин) и инкубировали с козьими антителами Alexa Fluor 568 к иммуноглобулинам мыши в течение 45 мин.
Для одновременного выявления Бр-РНК и нуклеолина ооциты, зафиксированные этанолом, инкубировали в смеси антител к Бр-дУ и кроличьих поликлональных антител к нуклеолину в течение 1 ч. отмывали в ФСБ и переносили в смесь антител Alexa Fluor 568 к иммуноглобулинам мыши и Alexa Fluor 488 к иммуноглобулинам кролика на 45 мин. Для одновременного выявления UBF и Бр-РНК ооциты инкубировали в смеси человеческой аутоиммуннной сыворотки Р419 (Zatsepina et al., 1993) и антител к Бр-дУ. В качестве вторичных антител использовали антитела к человеческим иммуноглобулинам, коньюгированные с ФИТЦ, и антитела к мышиным иммуноглобулинам, коньюгированные с Alexa Fluor 568.
Двойное иммуномечение на UBF и фибрилларин производили в смеси сыворотки Р419 и антител к фибрилларину, взятых в оптимальных концентрациях, отмывали в ФСБ и инкубировали в смеси вторичных антител к человеческим иммуноглобулинам, коньюгированным с ФИТЦ, и козьих антител против кроличьих иммуноглобулинов, меченных Alexa Fluor 568. Коммерческие антитела использовали в концентрациях, рекомендованных производителями. Перед заключением в среду Vectashield ооциты окрашивали 1 мкг/мл Hoechst 33342 в течение 15 min.
Окрашивание клеток флуоресцентным РНК-связывающим красителем пиронином Y
Для сравнения влияния двух денатурирующих фиксаторов (70%-ного этанола и смеси метанола и ледяной уксусной кислоты, 3:1) и кросс-сшивающего фиксатора формальдегида мы выявляли рРНК с помощью зондов, узнающих первичные транскрипты пре-рРНК (зонд к 5 ETS), частично процессированных рРНК (зонды к ITS1 и ITS2), а также зонды, гибридизующиеся с 18S и 28S последовательностями рРНК. Как было отмечено раньше после фиксации ПФА FISH-сигналы зондов к 5 ETS (рис. 30а), ITS1 (рис. 30г), выявляются только на поверхности ЯПТ, а в случае зонда к 28S рРНК – еще и в цитоплазме ооцита (рис. 30ж). Распределение сигналов FISH после фиксации 70% этанолом и после фиксации смесью метанола и уксусной кислоты практически не отличается в случае выявления частично процессированных рРНК (ITS1, рис. 30д, е) и зрелых рРНК (28S, рис. 30з, и). Однако локализация 47S пре-рРНК в ЯПТ после фиксации 70%-ного этанолом и смесью метанола и уксусной кислотой различаются (рис. 30б, в). После фиксации метанолом/уксусной кислотой сигналы, соответствующие 5 ETS, распределяются в ЯПТ практически равномерно (рис. 30в), а после фиксации 70%-ным этанолом они формируют дискретные фокусы и протяженные структуры (рис. 30б, стрелки). Кроме того, в ооцитах, зафиксированных 70%-ным этанолом, расположение к 47S пре-рРНК соответствует локализации новосинтезированной Бр-рРНК (рис. 24а; рис. 25а-ж) и похоже на дискретную локализацию первичных транскриптов в соматических ядрышках (рис. 13г), чего нам никогда не удалось наблюдать при использовании смеси метанола/уксусной кислоты. По этим причинам фиксацию GV ооцитов 70%-ным этанолом можно считать предпочтительной для изучения возможного присутствия внутри ЯПТ РНК методом FISH.
Суммируя наши наблюдения о влиянии фиксаторов на разные параметры ооцитов, можно заключить, что ни один из фиксаторов не позволяет одновременно сохранять общую морфологии клетки, ЯПТ, структуру хроматина и обеспечить доступность материала ЯПТ для антител и гибридизационных зондов. Для выявления белков внутри ЯПТ можно рекомендовать фиксацию ПФА с последующей обработкой ооцитов протеиназой К (этот подход прекрасно сохраняет ЯПТ и общую конфигурацию хроматина). Для выявления ядрышковой РНК лучшим фиксатором, с нашей точки зрения, является 70%-ный этанол, хотя его применение требует прижизненной идентификации типа ооцита с помощью витального ДНК-связывающего красителя Hoechst 33342. Для одновременного выявления внутри ЯПТ белков и РНК наиболее подходящим фиксатором также является 70%-ный этанол (Таблица 5).
До настоящего исследования для выявления РНК в ЯПТ GV ооцитов мыши были использованы разные подходы, однако, полученные результаты были противоречивыми: одни авторы выявляли РНК в ЯПТ (Kopecny et al., 1995, 1996a), тогда как другие отрицали ее присутствие (Antoine et al., 1988). Остин и Бишоп (Austin and Bishop, 1959) впервые применили флуоресцентный краситель акридиновый оранжевый для изучения живых ооцитов млекопитающих (на примере ооцитов крысы). Однако в данном исследовании была описана только зеленая флуоресценция, которая соответствует ДНК, в то время как красный сигнал от комплекса АО с РНК в ЯПТ был настолько слабым, что не поддавался интерпретации. Наши наблюдения подтвердили наблюдения авторов (Austin and Bishop, 1959): в живых GV ооцитах димеры АО накапливаются в цитоплазматических эндосомах (цитоплазматических везикулах, образующихся в результате эндоцитоза), тогда как ЯПТ оставались практически не окрашенными (не иллюстрировано). Фиксация ооцитов подтвердила старые наблюдения о характере окрашивания хроматина и позволила получить новые данные о присутствии РНК в составе ЯПТ. В фиксированных ооцитах зеленая флуоресценция АО, обусловленная связыванием мономеров красителя с ДНК, полностью колокализовалась с хроматином, выявляемым специфическим ДНК-связывающим красителем Hoechst 33342 (Рис. 15, б, в, з, и, л, м). В этих же ооцитах, димеры АО, которые имеют повышенное сродство к одноцепочечным нуклеиновым кислотам (РНК), наиболее ярко окрашивали материал ЯПТ (Рис. 15, а, г, ж, к). Понижение интенсивности красной флуоресценции после обработки ооцитов РНКазой А (Рис. 16) подтверждает специфичность связывания димеров АО с РНК и присутствие РНК в центральной массе ЯПТ. Растущие ооциты млекопитающих синтезируют огромное количество РНК, так что на предовуляторной стадии GV ооциты содержат около 0.5 нг РНК, что в 20-25 превышает среднее содержание РНК в соматических клетках (Bachvarova, 1985; Olszanska and Borgul, 1993). Можно предположить, что часть этой РНК, включая фракцию рРНК, может накапливаться внутри ЯПТ, но быть недоступной к гибридизационным зондам после обработки ооцитов кросс-сшивающими фиксаторами.
Как было показано с помощью красителя ФИТЦ, ЯПТ GV ооцитов помимо РНК содержат также белки (рис. 18, 19). С помощью иммуномечения белков ядрышка после умеренной протеолитической обработки протеиназой К (рис. 20, 21, 22) или после фиксации ооцитов 70%-ным этанолом (рис. 24в, ж; рис. 25е, з, и; рис. 28б, з) нам удалось идентифицировать внутри ЯПТ некоторые из этих белков. Наши данные находятся в хорошем соответствии с данными Фульки и Лангеровой, которые были получены с помощью другого метода демаскирования антигенов, предполагающего термическую обработку выделенных ооцитов (Fulka, Langerova, 2014). Однако авторы этой публикации не разделяли GV ооциты на SN- и NSN-типы, что не позволило связать характер распределения белков внутри ЯПТ с транскрипционным статусом ооцита (Bouniol-Baly et. al, 1999). Наши результаты впервые доказали, что внутренняя масса ЯПТ ооцитов как NSN-типа, так и SN-типа содержит белки, принимающие участие в основных этапах биогенеза рибосом: UBF (специфический ко-фактор РНК полимеразы I), фибрилларин (компонент мякРНП, участвует в ранних этапах процессинга пре-рРНК), NPM1 (фактор поздних этапов процессинга рРНК и сборки рибосомных частиц), нуклеолин (участвует в разных этапах процессинга рРНК) (Таблица 4). Нам не удалось найти в составе ЯПТ белки, участвующие в регуляции транскрипции структурных генов (NOBOX, топоизомераза II бета, HP1), в сплайсинге мРНК (SC35) или белков, выполняющих структурную роль в составе хроматина (гистон Н3) (Таблица 4). Кроме наших данных о присутствии белков ядрышка в ЯПТ опубликована только одна работа, в которой авторы показали наличие ядерного белка внутри ЯПТ (Inoue and Aoki, 2010). Иное и Аоки с помощью экспрессии плазмиды, кодирующий специфический ядерный белок ооцитов нуклеоплазмин 2, слитый с EGFP показали его присутствие в ЯПТ ооцитов мыши (Inoue and Aoki, 2010). В совокупности, эти данные позволяют предположить, что ЯПТ накапливают, в основном, ядрышковые белки. Важно отметить, что согласно полученным нами данным, локализация некоторых белков ядрышка в ЯПТ в ооцитах NSN- и SN-типа отличаются. Например, в ооцитах NSN-типа белок UBF (рис. 20б) и фибрилларин (рис. 20з) формируют локальные скопления, которые характеризуют транскрипционно активное ядрышко. Такое расположение белков, а также свидетельства о наличии транскрипции внутри ЯПТ объясняют сложную морфологию ЯПТ NSN-типа ооцитов, выявляемую на электронно-микроскопическом уровне (Почукалина и Парфенов, 2008).
Особенности состава ЯПТ ооцитов NSN- и SN-типов
Одним из самых главных наблюдений настоящей работы является обнаружение синтеза рРНК, а также непроцессированной рРНК внутри ЯПТ в GV ооцитах мыши NSN-типа. Присутствие транскрипции рДНК было показано нами двумя разными методами: с помощью микроинъекций Бр-УТФ, который в присутствии -аманитина включается только в новосинтезированную рРНК (рис. 24а; рис. 25а-ж; и; рис. 26а), и методом FISH с зондом, выявляющим короткоживущий 5ETS-фрагмент 47S пре-рРНК (рис. 28а, г). Однако транскрибирующиеся гены рРНК оказалось возможным выявить внутри ЯПТ только после фиксации ооцитов денатурирующими фиксаторами, такими как 70%-ный этанол и смесь метанола и ледяной уксусной кислоты. В ооцитах, зафиксированных ПФА, включение Бр-УТФ проявлялось только на поверхности ЯПТ (рис. 23а-г), что полностью соответствует данным литературы (Bouniol-Baly et al., 1999; Masson et al., 1996; Pesty et al., 2007; Zatsepina et al., 2000). Однако после фиксации ооцитов 70%-ным этанолом мы выявяли новосинтезированную рРНК внутри всех ЯПТ за исключением самых маленьких (около 1 мкм в диаметре, рис. 25, ж, и), которые, скорее всего, формируются самыми маленькими хромосомными ЯОР. Внутри ЯПТ новосинтезированная рРНК была видна в виде розеточных структур (рис. 24а, рис. 25а-е), одиночных фокусов (0.5-1.5 мкм в диаметре, рис. 25ж, и) или протяженных структур. Разные типы распределения Бр-рРНК скорее всего являются результатом разной эффективности мечения рРНК Бр-УТФ или перемещения Бр-рРНК от мест ее синтеза в другие домены.
Необходимо отметить, что характер распределения Бр-рРНК в ЯПТ весьма похож на мечение Бр-УТФ соматических ядрышек в фибробластах (рис. 13а), поскольку в обоих случаях новосинтезированная РНК формировала дискретные фокусы. Дискретные фокусы «новой» рРНК особенно отчетливо были видны при гибридизации ооцитов с зондом к короткоживущему 5 ETS-участку 47S пре-рРНК. При этом в ЯПТ можно было наблюдать несколько десятков одиночных фокусов (рис. 28а). Как известно, общее число повторов рДНК на гаплоидный набор мыши составляет 100 (Long and David, 1980), а GV ооциты, находящиеся на стадии профазы первого деления мейоза, имеет тетраплоидный набор хромосом. Это означает, что каждый ооцит может содержать до 400 транскрибирующихся рибосомных генов. Однако такого количества дискретных сигналов в ЯПТ мы никогда не наблюдали. Можно заключить поэтому, что в ЯПТ либо не все гены рРНК транскрибируются, либо активные гены настолько сближены, что не различаются в световом микроскопе. Оба варианта описаны в ядрышках соматических клеток, где одиночные цистроны рДНК невозможно различить на светооптическом уровне, а около 50% генов не транскрибируется (McStay and Grummt, 2008; Mullineux et al., 2012). Мы обнаружили в ЯПТ NSN-ооцитов также специфический ко-фактор РНК полимеразы I, UBF и фактор раннего процессинга рРНК фибрилларин, которые колокализуются с сайтами Бр-рРНК (Рис. 26в). Это подтверждает способность ЯПТ к транскрипции рДНК и процессингу рРНК, поскольку похожая топология UBF, фибрилларина и Бр-рРНК характерна для активных ядрышек соматических клеток (рис. 12д, е, ж; рис. 13а, б).
Малые ядрышковые РНК (мякРНК) – это некодирующие РНК, которые принимают участие в процессинге пре-рРНК и являются обязательными компонентами активных ядрышек соматических клеток (Tollervey and Kiss, 1997). U3 мякРНК входит в состав C/D мякРНП, участвующих в удалении 5 ETS – лидерного конца пре-рРНК и метилировании пре-рРНК, U3 мякРНП всегда содержат фактор раннего процессинга рРНК фибрилларин (Herrera-Esparza et al., 2002; Watkins, and Bohnsack, 2012). Наши данные показали, что в транскрипционно активных ооцитах NSN-типа, также как в соматических ядрышках, U3 мякРНК полностью колокализуется с фибрилларином (рис. 28ж, и). Кроме того, сайты U3 мякРНК/фибрилларина пространственно сближены с зонами, содержащими 47S пре-рРНК (рис. 28а-е) и UBF (рис. 26г-е). Таким образом, взаимное расположение в ЯПТ ооцитов NSN-типа активных рибосомных генов, а также факторов, необходимых для транскрипции рДНК (UBF) и раннего процессинга рРНК (U3 мякРНК и фибрилларин) оказывается сходным с расположением этих компонентов в активных ядрышках соматических клеток (Hernandez-Verdun et al. 2011) (рис. 13а-и). Весьма сходным с соматическими ядрышками оказывается также распределение в ЯПТ NSN-ооцитов непроцессированной рРНК (рис. 29а-г) и факторов позднего процессинга рРНК, таких как NPM1, нуклеолин, RPL26, (рис. 20з, и; рис. 21б, в, з; рис. 22ж, к) и RPS10 (не иллюстрировано). В совокупности, эти наблюдения указывают на способность ЯПТ ооцитов NSN-типа транскрибировать рДНК, процессировать рРНК и участвовать в сборке пре-рибосомных частиц подобно ядрышкам соматических клеток, несмотря на резкие различия в их ультраструктуре. Следует отметить, однако, что характер распределения непроцессированной и процессированной (18S и 28S рРНК) в ЯПТ и ядрышках различается: в ядрышках разные типы рРНК располагаются в одних районах, тогда как в ЯПТ непроцессированная рРНК и 18S/28S рРНК не колокализуются (рис. 13м, п). Причины этих различий могут являться предметом будущих исследований.
Другое важное различие между ЯПТ GV ооцитов и соматическими ядрышками состоит в разной доступности их молекулярных компонентов к антителам и FISH-зондам. Вероятно, это связано с большей концентрацией белков в ЯПТ по сравнению с нормальными ядрышками. По данным литературы, ЯПТ мыши содержит около 1.6 нг белков (Fulka et al., 2012). Фиксация ПФА, безусловно, приводит к образованию дополнительных внутри- и межмолекулярных сшивок в белковых и других биомолекулах, присутствующих в ЯПТ. Напротив, 70% этанол не формируют подобных сшивок, способствует экстракции водорастворимых белков (Eltoum et al., 2001) и разворачиванию молекул рРНК (Prent, 2009), тем самым облегчая проникновение зондов во внутреннюю массу ЯПТ. Другое отличие ЯПТ от ядрышек соматических клеток состоит в отсутствии трех-доменной организации, которая является обязательной для активных ядрышек (Hernandex-Verdun et al. 2011). В ЯПТ не выявляются фибриллярные центры, плотный фибриллярный и гранулярный компоненты (Debey et al., 1993). Однако в ЯПТ ооцитов NSN-типа на электронно-микроскопическом уровне выявляются районы, состоящие из частиц, размер которых совпадает с размером пре-рибосом (20 нм) (Choinard, 1971; Debey et al., 1993; Почукалина и Парфенов, 2008). Эти районы могут соответствовать 18S и 28S рРНК-содержащим областям, которые выявляются при гибридизации in situ (рис. 29б, г).
Известно, что уменьшение размеров фибриллярных центров может сопровождаться активацией транскрипции рДНК (Jordan and McGovern, 1981; Zatsepina et al., 1988) и схожие события могут происходить в ЯПТ ооцитов NSN-типа. Также возможно, что многочисленные белки могут маскировать трех-доменную организацию ЯПТ.