Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Аналитический обзор литературы 14
1. Развитие кожи человека и его региональные особен- 14
ности в пренатальном периоде
1.1.1. Морфологические, гисто- и лектиногистохимические особенности закладки и дифференцировки эпидермиса кожи человека
1.1.2. Морфологические, гисто- и лектиногистохимические особенности закладки и формирования дермы кожи человека
1.2. Апоптоз и пролиферация клеток в процессе закладки и дифференцировки тканей человека
1.3. Экспрессия рецепторов половых гормонов эстрогенов и прогестерона клетками развивающейся кожи человека
ГЛАВА 2. Материал и методы 42
2.1. Гистохимические методы исследования 43
2.2. Иммуногистохимический метод исследования 44
2.3. Лектиногистохимический метод исследования 46
2.4. Способы получения и обработки морфометрической информации
Результаты собственных исследований .
3.1. Закономерности дифференцировки эпителия и ме- 50
зенхимы и их производных кожи головы и туловища у эмбрионов и плодов
3.1.1. Морфологические изменения, пролиферативные и 50 апоптотические процессы и присутствие углеводсодер-жащих веществ в процессе развития структур и волокнистого каркаса кожи головы и туловища
3.1.2. Закономерности появления рецепторов эстрогенов и прогестерона в эпителиальных и мезенхимных закладках кожи головы и туловища
3.2. Закономерности связывания лектинов клетками и неклеточными структурами эпителия и мезенхимы и их производными кожи головы и туловища
3.2.1. Закономерности связывания лектина зародышей пшеницы (WGA) эпителием, мезенхимой и ЭСТ и их производными
3.2.2. Закономерности связывания лектина бузины черной (SNA) эпителием, мезенхимой и ЭСТ и их производными
3.2.3. Закономерности связывания лектина клубней картофеля (STA) эпителием, мезенхимой и ЭСТ и их произ
водными
3.2.4. Закономерности связывания лектина арахиса (PNA) эпителием, мезенхимой и ЭСТ и их производными
3.2.5. Закономерности связывания лектина клещевины (RCA) эпителием, мезенхимой и ЭСТ и их производными
3.2.6. Закономерности связывания лектина сои (SBA) и лектина виноградной улитки (HPA) эпителием, мезенхимой и ЭСТ и их производными
3.2.7. Закономерности связывания лектина бобовника анагиролистного (LABA) эпителием, мезенхимой и ЭСТ и их производными
3.2.8. Закономерности связывания лектина чечевица (LCA) эпителием, мезенхимой и ЭСТ и их производными
3.3. Сравнительное возрастное перераспределение ре- 156
цепторов лектинов и эпителио – мезенхимные отношения в коже головы и туловища
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 172
Выводы
Практические рекомендации
- Морфологические, гисто- и лектиногистохимические особенности закладки и формирования дермы кожи человека
- Иммуногистохимический метод исследования
- Закономерности появления рецепторов эстрогенов и прогестерона в эпителиальных и мезенхимных закладках кожи головы и туловища
- Закономерности связывания лектина бобовника анагиролистного (LABA) эпителием, мезенхимой и ЭСТ и их производными
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Пороки развития кожи, в частности ее соединительной ткани – мало изученная гетерогенная группа заболеваний. Между тем, это обширная глава в дерматологии, которая, включает более десяти клинических форм (G. E. Pierard, et al, 1995). Многие исследователи показали, что раны кожи у зародышей и плодов ранних сроков гестации заживают без образования рубцов и это не зависит от системных факторов – фетальной сыворотки или амниотической жидкости (M.W. Ferguson et al, 2007; T. Pouyana et al, 2012). Скорее всего, такой тип регенерации обусловлен строением эмбриональной кожи как таковой. В этой связи изучение состава и архитектоники фетальной кожи крайне актуально. Кожа человека, несмотря на принципиально единый план строения, отличается видовыми, расовыми, половыми, возрастными и региональными особенностями (О.Д. Мяделец, В.П. Адаскевич, 2006; В.И. Ноздрин с соавт, 2011; K.S. Steen, R. Paus, 2001).
Степень разработанности темы. В ряде работ освещена неравномерность
дифференцировки структурных компонентов кожи различных областей, в том
числе кожи головы (КГ) и кожи туловища (КТ), а также участков в пределах
одной области (И.О. Смирнова, 2004; E. Ezhkova et al, 2009). Однако эти данные
фрагментарны и получены в основном у лабораторных животных. Сведения о
дифференцировке мезенхимы (М) в соединительную ткань дермы не получили
должного освещения в изученной нами литературе и не дают точных данных о
динамике этого процесса. Факты о биосинтезе белка коллагена, образовании на
его основе коллагеновых волокон (КВ) стромы дермы кожи эмбрионов человека
немногочисленны и кратки (R.K. Gautam et al, 1996). Появление современного
метода иммуногистохимии позволяет конкретизировать тип коллагена и сроки его
появления в развивающейся коже, о чем отсутствуют сведения в доступной
литературе. Апоптоз происходит при нормальном эмбриональном гистогенезе и
важен для поддержания оптимального баланса между старыми
4
нефункционирующими клетками и вновь образованными в результате
пролиферации (А. П. Милованов, 2006; I. Zusman et al., 2008). Сведения об
особенностях процессов пролиферации КЛ закладок разных участков кожи
человека скудны (Coolen N.A. et al, 2010), а о процессах апоптоза отсутствуют.
Известно, что в период эмбриогенеза в клетках большинства органов появляются рецепторы гормонов эстрогенов (Э) и прогестерона (П), делающих такие клетки (КЛ) чувствительными к этим гормонам (Т.А. Бойко, 2010; V. Pezzi et al., 2003; K. M. Stanfield et al., 2003). Для закладок кожи такая информация не выявлена, хотя в постнатальном периоде кожа является гормонзависимым органом.
Синтез и последовательность появления гликоконъюгатов на поверхности
клетки генетически детерминированы (Ponder BA., 1983). На последовательных
этапах гисто- и морфогенеза в составе клеток и тканей животных и человека
происходит постоянная перестройка лектин-рецепторных систем (А.Н.
Яцковский, А.Д. Луцик, 1991; Н.А. Волошин, Е.А. Григорьева, 2005; А.Д. Луцик,
2009; J. Eggens et al, 1989). Изменение гистотопографии и состава связывающих
лектины гликоконъюгатов в пренатальном онтогенезе отражает
последовательность включения различных механизмов, обеспечивающих
дифференциацию и нормальное функционирование структур различных органов
(Ю. В. Силкина, 2009; RC. Gracham, MJ. Karnivsky, 1996). Нам представляется
важным сосредоточить внимание на изучении гистотопографии и
перераспределении гликополимеров, являющихся рецепторами Л, и особенностях углеводного обмена, дополняющих морфологию и позволяющих внести ясность в вопрос региональных различий в строении кожи, обусловливающих различное течение патологических процессов в ней.
Цель исследования - выявление органной особенности гистогенеза кожи головы и туловища эмбрионов и плодов человека.
Задачи исследования:
1. Изучить морфологические особенности, синтез гликогена и
гликопротеинов, индекс пролиферации и апоптоза клеток эпителия и мезенхимы или эмбриональной соединительной ткани кожи головы и туловища в первые 12 недель эмбриогенеза человека.
-
Проследить динамику появления и редукции эстроген- и прогестерон зависимых клеток эпителия и мезенхимы или эмбриональной соединительной ткани в процессе гистогенеза кожи головы и туловища в первом триместре пренатального развития человека.
-
Выявить локализацию и сроки появления коллагеновых волокон, образованных коллагеном I, II, III и IV типов и эластических волокон в гистогенезе волокнистой стромы кожи головы и туловища в эмбриональном и начале плодного периода внутриутробного развития.
-
Сопоставить локализацию и перераспределение гликополимеров – рецепторов лектинов в эпителиальных и мезенхимных закладках кожи головы и туловища на этапах становления структурных компонентов органа в раннем эмбриогенезе.
-
Проанализировать общие и органоспецифические закономерности межклеточных взаимоотношений в структурах закладках кожи головы и туловища на этапах их становления в раннем пренатальном онтогенезе человека.
Научная новизна исследования. Впервые в работе используется
сравнительный комплексный подход к проблеме гистогенеза КГ и КТ с
применением современных методов гисто-морфологических, лектино- и
иммуногистохимических исследований с разными видами статистического
анализа, что позволило обозначить региональные особенности органогенеза кожи.
Впервые представлена сравнительная характеристика последовательных
гетерохронных гистогенетических перестроек закладок кожи на ранних сроках пренатального развития. При этом проанализированы взаимоотношения, которые разворачиваются между М и эктодермальным эпителием (ЭП) изученных
6
областей кожного покрова. Впервые на значительном эмбриологическом
материале показан эффект последовательного перераспределения
гликополимеров-рецепторов лектинов (Л) в клетка (КЛ), на их поверхности и на
внеклеточных тканевых структурах в процессе органоспецифической
дифференцировки закладок разных участков кожи. Заново на достаточно
обширном материале определена последовательность биосинтеза и активность
комплекса полисахаридной природы и их роль в дифференцировке и структурных
показателях КГ и КТ. Впервые представлена сравнительная региональная
характеристика процессов апоптоза и пролиферации КЛ эпидермиса и дермы на
ранних сроках пренатального развития. Впервые изучен биосинтез КВ I, II, III и
IV типов в структурах волокнистой стромы КГ и КТ. Впервые у Э человека
первых 12-ти недель развития выявлена локализация КЛ, имеющих рецепторы
гормонов Э и П, в составе эпителиальных и мезенхимных закладок КГ и КТ и
изменение их количества в разные возрастные периоды.
Теоретическая и практическая значимость. В диссертационной работе
изучен нормальный органогенез КГ и КТ у зародышей (ЗР) и предплодов
человека, развивавшихся в матке при отсутствии повреждающих факторов
внешней среды, поэтому полученные результаты могут стать практической
основой для изучения причин безрубцового заживления ран кожи у эмбрионов
(ЭМ) и плодов первой половины беременности, разработки параметров контроля
нормальности развития этих регионов кожных покровов, предупреждения
аномалий внутриутробного развития и возможности их коррекции при влиянии
неблагоприятных экологических факторов и пренатального стресса.
Картирование локализации гликополимеров, которые являются рецепторами
Л, на оболочках КЛ, в их цитоплазме (ЦП) и на неклеточных тканевых структурах
эпидермиса и дермы КГ и КТ в нормальном пренатальном развитии человека
необходимо для ранней диагностики потенциально злокачественных опухолевых
КЛ, что позволит создать доступные лектиногистохимические тест-системы для
онкологии и патологической анатомии.
7
Выявление КЛ, содержащих рецепторы гормонов Э и П, в закладках
кожи расширяет представления о влиянии половых гормонов, в том числе и
матери, на нормальный эмбриогенез органов покровной системы и
свидетельствует о необходимости добавления женских половых гормонов в
культуральную среду при выращивании кожи из стволовых клеток.
Обнаружение последовательности и сроков синтеза КВ разного типа в дерме важно для создания каркасов биоинженерных конструкций для регенерации язв кожи различного генеза.
Полученные результаты могут быть учтены и использованы для дальнейшей
разработки теоретических положений относительно роли межтканевых
взаимоотношений в эмбриогенезе человека и в частности органов
эктодермального происхождения.
Теоретические результаты проведенной работы целесообразно учитывать в учебном процессе при преподавании соответствующих разделов в таких дисциплинах как: гистология, эмбриология, цитология, патологическая анатомия, дерматология и хирургия.
Основные положения диссертации внедрены в учебный процесс на кафедрах: гистологии и эмбриологии, патологической анатомии, дерматовенерологии и косметологии Медицинской академии имени С.И. Георгиевского ФАГОУ ВО «КФУ имени В.И. Вернадского». На кафедрах патологической анатомии, гистологии и эмбриологии ГВОУ ВПО КубГМУ.
Методология и методы исследования. Работа выполнена на 119 зародышах (ЗР) и плодах человека, развивавшихся в матке при отсутствии явно выраженных повреждающих факторов внешней и внутренней среды, полученных при медицинских социальных абортах. Одновременно были использованы серийные срезы из коллекции эмбрионов и плодов человека «Крым» Медицинской академии имени С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ имени В.И. Вернадского». Все изученные ЗР и плоды систематизированы в соответствии с мировыми классификациями и международной эмбриологической номенклатурой.
8
ЗР и плоды быстро фиксировали сразу же после операции 10%
забуференым формалином (рН 7,2-7,4) при комнатной температуре в течение 1
суток. Материал заливали в парафин по стандартной методике и из него с
помощью микротома Microm HM 325 Rotary Microtom (Termo Fisher Scientific)
изготовляли серийные сагиттальные гистологические срезы толщиной 5-6 мкм.
Использование только парафиновой заливки дало возможность сочетать
количественные, гистохимические, иммуногистохимические и
лектиногистохимические методы исследования в серийных срезах одного и того
же ЗР. Для изучения была выбрана вентральная поверхность туловища ЭМ и
плодов.
Методами исследования были: общегистологические – для изучения
структурных преобразований эпидермиса и дермы КГ и КТ; гистохимический –
для изучения содержания Г, ГП, гликозаминогликанов (ГАГ), эластических,
коллагеновых и аргирофильных волокон в КГ и КТ; цитоспектрофотометрический
– для определения количества ШИК-положительных веществ в КЛ кожи;
иммуногистохимический – для изучения локализации и количества КЛ в
состоянии пролиферации и апоптоза, КЛ с рецепторами Э и П и четырех типов КВ
в закладках кожи; лектиногистохимический – для изучения количественного
содержания и гистотопографии гликополимеров-рецепторов Л в эпидермисе и
дерме; морфометрические – для подсчета количества КВ четырех типов, КЛ в
состоянии пролиферации и апоптоза, КЛ с рецепторами Э и П, толщины
эпидермиса; статистические – для установления индекса пролиферации, апоптоза,
готовности к апоптозу и антиапоптотического индекса КЛ КГ и КТ и
достоверности сравнения выборок лектиногистохимического исследования.
Положения, выносимые на защиту:
1. Различия в гистогенезе закладок кожи головы и туловища человека начинают проявляться с 35 суток пренатального онтогенеза (зародыши 6,5 мм т.-к. длины).
2. При наличии общей этапности процессов формирования эпидермиса и
дермы увеличение толщины и слойности эпидермиса, изменение индексов пролиферации, апоптоза и антиапоптотического индекса, изменение содержания клеток с рецепторами гормонов эстрогенов и прогестерона в эпидермисе и дерме кожи головы происходит интенсивнее.
3. При качественно аналогичных процессах формирования волокнистых
компонентов дермы в виде первоначального синтеза коллагеновых волокон,
состоящих из коллагена третьего типа и эластических волокон, затем
коллагеновых волокон образованных коллагеном первого и второго типа и только
с 11-й недели пренатального развития (зародыши 46-56 мм длины) коллагеновых
волокон образованных коллагеном четвертого типа в дерме кожи туловища синтез
волокнистых компонентов запаздывает.
4. Закономерности перераспределения гликополимеров, являющихся
рецепторами использованных лектинов различной углеводной специфичности, и
их количество по мере развития зародышей в первые 12 недель эмбриогенеза в
закладках кожи головы статистически достоверно не соответствуют таковым в
закладках кожи туловища.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных данных достигнута использованием достаточного количества морфологического материала, а также применением как классических морфологических, так и современных молекулярно-биологических методов, морфометрического анализа, конкретной постановкой и решением поставленных задач с использованием адекватных статистических методов. Достоверность различий между результатами лектиногистохимических данных оценивали по T-критерию Уилкоксона для сопряженных пар.
Основные результаты работы доложены и обсуждены на: І Всеукраинской научно-практической конференции „Морфология человека и животных” (Николаев, 2011); XV Юбилейной Всероссийской с международным участием медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная
10 наука и клиническая медицина – человек и его здоровье» (С.-Петербург,
2012); 3-м научном симпозиуме «Анатомо-хирургические аспекты детской
гастроэнтерологии» (Черновцы, 2012), VIII международной научно-практической
конференции «Europejska nauka XXI powieka – 2012» (Polska, Przemysl, 2012);
научно-практической конференции «Морфология на современном этапе развития
науки» (Тернополь, 2012); 84-й и 85-й международной научно-практической
конференции студентов и молодых ученых «Теоретические и практические
аспекты современной медицины» (Симферополь, 2012 и 2013); ХІ-й
международной научной конференции “Морфология нового столетия” (Киев,
2013); научно-практической конференции с международным участием
„Интернационализация высшего медицинского образования: научно-
методические методы обучения иностранных граждан в высших медицинских
учебных заведениях” и „Жутаевские чтения” (Полтава, 2013); IV симпозиуме
„Морфогенез органов и тканей под влиянием экзогенных факторов”
(Симферополь-Алушта, 2013); научно-практической конференции
«Морфофункциональные особенности нервной и сердечно-сосудистой системы в
норме, эксперименте и патологии» (Ивано-Франковск, 2013); Всеукраинской
научно-практической конференции с международным участием „Достижения
современной клинической анатомии и оперативной хирургииї” (Луганск, 2013); IX
международной научно-практической конференции “Efektivni nastroje modernich
ved – 2013” (Прага, 2013); VII международной научно-практической конференции
«Science, Technology and Higher Education» (Westwood, Canada, 2015);
Всероссийской научно-практической конференции «Экологические аспекты
морфогенеза» (Воронеж, 2015).
Апробация результатов диссертационного исследования была проведена на совместном заседании кафедр гистологии и эмбриологии, топографической анатомии с курсом оперативной хирургии, лечебной физкультуры и спортивной медицины, физиотерапии с курсом физического воспитания
11 Медицинской академии имени С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ
имени В.И. Вернадского», протокол № 37 от 11.10.2016 года.
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 17 научных работ, в том числе 6 в изданиях, рекомендованных ВАК Украины и 2 в ведущих российских и зарубежных рецензируемых журналах, входящих в перечень Высшей аттестационной комиссии при Министерстве образования и науки Российской Федерации.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 239 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, приложения и списка литературы. Диссертация содержит 32 таблицы и 99 рисунков. В списке литературы 273 источников, в том числе 156 – зарубежных.
Морфологические, гисто- и лектиногистохимические особенности закладки и формирования дермы кожи человека
Понятно, что ведущая роль в органогенезе кожи принадлежит геному клеток. Исследования в этой области далеки от завершения и во многом выполнены на лабораторных животных. Ряд авторов отмечает экспрессию разных генов у человека и животных [163]. Ген FLG, присутствующий на 1-й хромосоме, является частью комплекса генов ответственных за дифферен-цировку эпидермиса. Стимулируя активность этого гена 2,3,7,8-тетрахлордибензодиоксином в эксперименте на мышах, [254] показали, что формирование проницаемости эпидермального барьера происходит раньше на 1 день.
Методы молекулярной биологии позволили впервые у Xenopus [177] и C. Elegans [165; 272] идентифицировать HOX-гены, обеспечивающие осевую дифференцировку, сегментацию тела эмбриона и развитие почек конечностей. Последующие исследования показали, что сильная экспрессия гена HOX A4 обнаруживается в клетках базального слоя эпидермиса кожи у плодов человека в возрасте 10 недель, в клетках эпидермиса и дермы – у плодов 17 недель. Затем экспрессия снижается и слабо проявляется в коже новорожденных и взрослых. Гены HOX A5 и HOX A7 экспрессируются в аналогичных клетках, но слабее. Гены HOX С4 и HOX В7 активны в коже плодов в течении всего пренатального периода [250]. Кодируемые этими генами HOX-гомеодомейн-протеины являются факторами транскрипции. HOX В6 и HOX В4-протеины присутствуют в цитоплазме клеток во время развития кожи человека и могут участвовать в заживлении ран у плодов [196].
Другой вид генов гомеобокс-гены MSX-1, MSX-2 и MOX-1 по-разному активны в дерме и эпидермисе у плодов человека и у взрослых [251]. Возможно, именно они задействованы в безрубцовом заживлении ран у плодов. MSX-1 и MSX-2 обнаруживаются в клетках эпидермиса и волосяных фолликулов, фибробластах дермы плодов. Во взрослом состоянии эти гены активны только в производных эпителия. Ген MOX-1 присутствует в клетках эпидермиса и волосяных фолликулов, фибробластах дермы на ранних ста 17 диях развития плодов, участвуя в межклеточных взаимодействиях, а во взрослой коже отсутствует [123]. Имеется сообщение, что ген SOX9, связанный с половой хромосомой, экспрессируется при развитии ногтей, кровеносных сосудов дермы, меланоцитов и меланобластов кожи человека [197].
Эпидермис в дефинитивном состоянии представлен многослойным плоским ороговевающим эпителием, в котором постоянно происходят обновление и специфическая дифференцировка клеток-кератиноцитов – кератинизация. Толщина его колеблется от 0,03 до 1,5 мм и более. Наиболее толстой является кожа ладоней и подошв. Эпидермис других участков кожи значительно тоньше. Толщина его, например, на волосистой части не превышает 170 мкм. Блестящий слой в нем отсутствует, а роговой представлен лишь 2-3 рядами ороговевших клеток – чешуек.
Некоторые авторы [24; 35; 83] на основании различной толщины эпидермиса подразделяют кожу на толстую и тонкую. Толстая кожа покрывает небольшие участки тела (ладони, подошвы), тогда как тонкая выстилает остальные обширные его поверхности. На ладонях и подошвах в эпидермисе различают 5 основных слоев клеток: базальный, шиповатый (или остистый), зернистый, блестящий (или элеидиновый) и роговой. В остальных участках (т.н. тонкой) кожи имеется 4 слоя клеток эпидермиса, отсутствует блестящий слой. В эпидермисе различают 5 типов клеток: кератиноциты (эпите-лиоциты), клетки Лангерганса (внутриэпидермальные макрофаги), лимфоциты, меланоциты и клетки Меркеля.
Сроки пренатальной дифференцировки клеток эпидермиса остаются дискуссионными. Исследователи сходятся во мнении, что в самом раннем периоде внутриутробной жизни эпидермис состоит из одного слоя клеток, но между 5-й и 7-й неделями внутриутробной жизни он становится двуслойным [17; 29; 212; 234]. Один слой – это внутренний или зародышевый, второй – наружный эпитрихиальный слой или перидерма. Зародышевый слой состоит из больших кубических клеток, перидерма – из плоских. На III месяце внутриутробной жизни между этими двумя слоями появляются отдельные клетки, образующие затем сплошную линию – промежуточный слой [78; 140]. Около VI месяца перидерма отделяется и участвует в образовании творожистой массы – vernix caseosa [258]. Верникс казеоза представляет из себя белую кремообразную барьерную субстанцию, покрывающую кожу плода человека во время последнего тримстра беременности. Функции этого вещества продолжают вызывать дискуссию. Протеомный анализ идентифицировал присутствие 41 протеина, из которых 25 имеются только в верникс казеоза. 39% из идентифицированных белков являются компонентами иммунитета, 29% имеют прямое отношение к антимикробной активности, что свидетельствует о антимикробной защитной функции этой субстанции [261].
К концу внутриутробной жизни промежуточный слой становится многослойным и развивается в шиповатый слой. Эмбриональный зародышевый слой дифференцируется в следующие типы клеток: 1) базальные клетки, 2) зародышевые клетки эккринных потовых желез, 3) первичные эпителиальные зародышевые клетки, а также, возможно, 4) дендритические и светлые клетки. В отличие от клеток эмбрионального зародышевого слоя зрелые ба-зальные клетки имеют межклеточные мостики. Путем прогрессирующей дифференциации базальные клетки развиваются в шиповидные, зернистые и роговые клетки, образуя многослойную поверхность эпидермиса [186]. Авторы показали, что при культивации эпидермоцитов эмбрионов человека до 9 недель гестации образуются только монослойные структуры. Эпидермо-циты более старших возрастов способны дифференцироваться в многослойные образования. Высказывается мнение на основе гистологического исследования, что развитие эпидермиса завершается к 34-й неделе беременности [188].
Иммуногистохимический метод исследования
Серийные срезы после депарафинизации погружали в 96 градусный этанол, а затем для инактивации эндогенной пероксидазы инкубировали 20 минут в метаноле, содержащем 0,3% перекиси водорода. Препараты обрабатывали с применением стандартных наборов НПК «Лектинотест» г. Львов в разведении лектина 1:50 по рекомендуемой методике [61; 62]. Визуализацию мест связывания лектина проводили в системе диаминобензидин-перекись водорода. Контроль специфичности реакции осуществляли путем исключения из схемы обработки препаратов диаминобензидина.
Для обработки гистологических препаратов использовали: лектин бузины черной (SNA), специфичный к концевым нередуцирующим остаткам N-ацетилнейраминовой (сиаловой) кислоты гликополимеров; лектин арахиса (PNA), специфичный к бета-D-галактозе: лектин клещевины (RCA), специфичный к бета-D-галактозе, экранированной сиаловой кислотой; лектин чечевицы пищевой (LCA), специфичный к альфа-D-маннозе; лектин сои (SBA) и лектин виноградной улитки (HPA), специфичные к N-ацетил-D-галактозамину; лектин клубней картофеля (STA), специфичный к N-ацетил 47
D-глюкозамину; лектин зародышей пшеницы (WGA), специфичный к N-ацетилнейраминовой кислоте и в меньшей степени - к N-ацетил-Б-глюкозамину и лектин бобовника анагиролистного (LABA), специфичный к альфа-Ь-фукозе. Сокращенное наименование лектинов приведено в соответствии с международной номенклатурой лектинов [200]. Специфичность лектинов к терминальным нередуцирующим моносахаридным остаткам гликоконъюгатов дана в соответствии с данными [6; 23; 61; 62].
Интенсивность окрашивания срезов различными лектинами оценивалась в баллах методом полуколичественной оценки.
Обработку всех полученных данных проводили на персональном компьютере с использованием пакета программ MS Office Excel 2007, аналитического пакета приложения STATISTICA Enterprise (StatSoft Inc., США), с привлечением возможностей программы «STATGRAPH 5.1» («Microsoft», США). Результаты статистической обработки сведены в таблицах и использованы в рисунках.
На микрофотографиях срезов, окрашенных гематоксилином Майера и эозином, с помощью программы Image J, измеряли толщину эпидермиса кожи головы и туловища эмбрионов и плодов по 50 замеров в каждом изученном возрасте. Полученные цифровые данные (выраженные в пикселях) были переведены в мкм при помощи деления пикселей на коэффициенты, специально для этого выведенные: объективы х10 - 6379251, х40 -98911797. Для описания выборочной совокупности данных использовали средние значения со стандартной ошибкой средних показателей (x+Sx). Сравнения средней толщины эпидермис кожи головы и туловища у зародышей и плодов каждого возраста проводили в процентах по отношению в меньшей в абсолютном значении средней толщине. Индекс пролиферации, готовности к апоптозу и апоптоза, антиапопто-тический индекс определяли путем подсчета количества Ki-67, CD 95 / Apo 1, p53 и Bcl-2-позитивных клеток на 100 клеток каждой закладки кожи головы и туловища при увеличении х1350 с последующим вычислением показателя в процентах в среднем по результатам всех изученных зародышей и плодов каждого возраста. Аналогично в ста клетках каждой закладки под-считывалось количество клеток с рецепторами эстрогенов и прогестерона. Сравнения средних величин индексов в коже головы и туловища у зародышей и плодов каждого возраста проводили в процентах по отношению в меньшей в абсолютном значении средней величине.
Волокна позитивные по отношению экспрессии маркеров коллагеновых волокон первого, второго, третьего и четвертого типов изучали как минимум на 5-ти срезах. В каждом из них определяли количество окрашенных в коричневый цвет коллагеновых волокон в 10 полях зрения на площади 502,08 мкм2 (увел. х 400 микроскопа «Olympus CX-41») с помощью окулярной сетки по Г.Г. Автандилову [1].
Независимые вариационные ряды интенсивности окрашивания клеток эпителиальных и мезенхимных закладок кожи в пределах одного возраста зародыша или плода различными лектинами, оцениваемая в баллах, подвергнута статистическому анализу на предмет принадлежности к одной или разным генеральным совокупностям с помощью непараметрического статистического парного T-критерия Уилкоксона. Непараметрические критерии занимают особое место среди статистических критериев, т.к. не используют информацию о численном значении наблюдений, а связаны только с взаимным расположением выборочных значений. Эти критерии несколько слабее, т.к. не используют существенную часть информации. Но они имеют важнейшее преимущество, состоящее в инвариантности по отношению к монотонным масштабным преобразованиям переменных. Парный Т-критерий Уилкоксона сравнивает выборки, связанные попарно некоторыми общими условиями (зависимые выборки): расположением рецепторов лектинов на цитолемме, в цитоплазме, на апикальной поверхности или базальной мембране эпителия или мезенхимы или ЭСТ. Все вышеуказанные методы статистического анализа изложены в специальных руководствах [2; 3; 70; 95; 96].
Закономерности появления рецепторов эстрогенов и прогестерона в эпителиальных и мезенхимных закладках кожи головы и туловища
Количество ШИК-положительных веществ в клетках эпителия и мезенхимы кожи продолжает нарастать в основном за счет биосинтеза гликогена, который концентрируется в виде гранул в цитоплазме клеток. Красно-фиолетовые гранулы гомогликана крупнее в клетках эпидермиса кожи головы (рисунок 3.6). Содержание гликопротеинов также увеличилось, что свидетельствует об усложнении углеводного обмена в закладках кожи.
Несмотря на активное накопление полисахаридов в клетках мезенхимы ГАГ не обнаруживаются.
Стадия 17. Зародыши К1 – 20, К1 – 81, К1 – 88 – 42 суток (13 мм длины). У зародышей в возрасте 42 суток эпидермальный эпителий сохраняет двухслойное строение. Его толщина существенно не изменилась, сохраняясь больше в области головы (рисунок 3.7). Туловище покрыто низким двухслойным эпителием с уплощенными ядрами в обоих слоях (рисунок 3.8). Базальная мембрана хорошо контурируется. Индекс пролиферации клеток эпидермиса головы и туловища снизился на 3,7% и 4,1% соответственно по сравнению с таковыми у зародышей в возрасте 38-41 суток (10-12 мм длины) и составляют 39,21+0,07 и 37,84+0,21 (таблица 3.5). Индекс апоптоза эпидермоцитов кожи головы и туловища увеличился на 3,9% и 3,4% соответственно и составляет 40,17+0,15 и 41,82+0,22. Антиапоптотический индекс клеток эпидермиса головы снизился на 2,8% и составляет 38,23+0,09, в то время как среди эпидермоцитов туловища зафиксировано более высокое снижение на 3,1% (36,02+0,14). Обнаружено такое же количество клеток с экспрессией CD95 среди эпителиоцитов эпидермиса кожи головы и туловища, как и у зародышей в возрасте 38-41 суток (10-12 мм длины).
Анализ количественных цитофотометрических данных содержания полисахаридов в клетках эпителия и мезенхимы кожи, представленных в таблице 3.2 и таблице 3.3, показывает, что биосинтез ШИК-позитивных веществ продолжает нарастать. Содержание гликогена в эпидермисе кожи увеличилось и составляет 28,31+0,12у.е. Оно увеличилось на 37,02% по сравнению с зародышем в возрасте 38 суток (6,5мм длины). Гранулы гликогена Рисунок 3.7 2 – мезенхима дермы. равномерно распределены в цитоплазме клеток эпителиального пласта. Уровень синтетических процессов в клетках мезенхимы дермы крайне низкий. В серийных срезах после обработки ферментом амилазой в цитоплазме клеток сохраняется слабое розовое окрашивание, свидетельствующее о присутствии здесь гликопротеинов. Цитоспектрофотометрически их количество составляет 2,87+0,04 у.е., что на 19,16% больше, чем у зародышей в возрасте 38 суток (6,5 мм длины).
Элементы периэпителиальной мезенхимы кожи головы несколько уплотняются и ориентируются вдоль базальной мембраны. Впервые в этом возрасте выявлены различия в пролифиративной и апоптотической активности клеток дермы головы и туловища. Среди мезенхимоцитов дермы головы и туловища, по-прежнему, наиболее часто встречаются клетки с экспрессией антиапоптотического гена Bcl-2, но в дерме кожи головы их больше. В дерме кожи головы этот индекс равен 40,34+0,31, а в дерме кожи туловища – 38,16+0,28 (см. таблицу 3.5). Уменьшение составило 2,6% и 7,9%. Индекс пролиферации тех же клеток остается высоким, хотя и снизился на 5,5% для мезенхимоцитов головы и составляет 35,22+0,24 и на 8,2% для мезенхимо-цитов туловища (34,21+0,18). Индекс апоптоза и готовности к апоптозу клеток дермы головы уменьшились на 7,7% и 8,5% и составляют 24,30+0,16 и 7,12+0,04 соответственно. Уменьшение данных индексов для клеток мезенхимы дермы туловища более значительно – на 15,8% (22,18+0,12) и 10,1% (7,00+0,11).
В данном возрасте нами впервые зафиксированы ГАГ в виде нежной сиреневой метахроматической окраски, появившейся в цитоплазме молодых дифференцирующихся из мезенхимоцитов фибробластов и межклеточном пространстве после окраски срезов раствором толуидинового синего в буфере Михаэлиса с рН = 4,13 и 5,32. Обработка материала раствором красителя в буфере со значением рН = 3,2 дает синее ортохроматическое окрашивание этих же участков. Такая избирательность позволяет судить о том, что в клетках мезенхимы произошло усложнение обмена углеводов и они приступили к синтезу гиалуроновой кислоты, одного из важнейших компонентов основного вещества соединительной ткани. Подтверждением тому служит и неустойчивость метахроматического окрашивания к действию бактериальной и тестикулярной гиалуронидазы. Способность синтезировать гиа-луроновую кислоту знаменует трансформацию клеток мезенхимы в молодые фибробласты. В мезенхиме будущей дермы кожи туловища прослеживается только ортохроматическое синее окрашивание, свидетельствующее об отсутствии синтеза ГАГ.
Стадии 17-18. Зародыши К1-41, К1-42, К1-82, К1-84, К1-6; К1-19; К1-58; К1-67; К1-79; К1-83 – 43-45 суток (14-16 мм длины). К концу последующих трех суток у зародышей 16 мм длиной продолжается формирование эпидермиса, который состоит из двухслойного эпителия. На хорошо видимой базальной мембране располагаются призматические эпителиоциты со слегка овальными ядрами. Второй слой – перидерма – образован уплощенными клетками. По-прежнему толщина эпидермиса кожи головы выше, чем в области туловища. Индекс пролиферации эпителиоцитов эпидермиса кожи головы самый высокий у зародышей этого возраста и составляет 38,15+0,07, что вместе с тем означает снижение его на 2,8% по сравнению с зародышами в возрасте 42 суток, 13 мм длины (таблица 3.6). Индекс апоптоза снизился на 2,4% (39,23+0,32). Индекс пролиферации эпителиоцитов эпидермиса кожи туловища несколько ниже – 36,31+0,22, а индекс апоптоза выше – 41,82+0,22, хотя они и уменьшились на 4,1% и 2,0% по сравнению с предыдущими зародышами. Индекс готовности к апоптозу и антиапоптоти-чекий индекс не изменились.
В данном возрасте происходит дальнейшее накопление полисахаридов, выявляемых ШИК-реакцией с ферментативным контролем, в клетках эпидермиса и эмбриональной соединительной ткани кожи всех участков зародышей. Наряду с интенсивным синтезом гликогена нарастает биосинтез гликопротеинов. Клетки эпидермиса кожи гораздо богаче ШИК-положительными веществ, чем клетки эмбриональной соединительной ткани дермы.
В мезенхиме кожи головы и туловища кроме гиалуроновой кислоты синтезируется небольшое количество хондроитинсульфатов А и С. Полисахаридные эфиры серной кислоты, присутствующие в хондроитинсульфатах А и С, дают метахромазию с толуидиновым синим, приготовленным на буфере Михаэлиса с рН = 3,2. Способность синтезировать гиалуроновую кислоту, знаменующую трансформацию клеток мезенхимы в молодые фибробласты и мезенхимы в эмбриональную соединительную ткань, приобрели в описываемом возрасте все клетки периэпителиальной мезенхимы. Клеточные элементы расположены достаточно густо, но синцитиальное строение отсутствует. Форма клеток изменилась с отростчатой на неправильную или веретеновидну. Все изученные индексы представлены в таблице (см. таблицу 3.6). Молодые фибробласты активно размножаются и способны активно дифференцироваться благодаря высокой экспрессии антиапоптотического гена Bcl-2, который препятствует вступлению фибробластов в процессы апоптоза. Поэтому индекс апоптоза и готовности к апоптозу не высоки.
Закономерности связывания лектина бобовника анагиролистного (LABA) эпителием, мезенхимой и ЭСТ и их производными
Слойность эктодермального покрова туловища не меняется по сравнению с зародышами в возрасте 49 суток (20 мм длины). Его толщина составляет 10,7+0,1 мкм. На базальной мембране присутствуют кубические клетки с круглыми ядрами. Поверхностные клетки сильно уплощены и располагаются параллельно базальной мембране. Ядра вытянуты и занимают почти всю цитоплазму клеток. Индекс пролиферации и антиапоптотический индекс клеток эпидермиса кожи туловища ниже по сравнению с эпидермисом кожи головы и составляют 35,73+0,25 и 35,27+0,28, что означает снижение этих индексов в рамках статистической погрешности на 1,0% и 1,4% по сравнению с зародышами в возрасте 47-49 суток, 18-20 мм длины. Индекс апоптоза остается самым высоким – 39,24+0,26. Индекс готовности к апоп-тозу составляет 8,39+0,17 (см. таблицу 3.9). Оба этих индекса уменьшились на 1% и 7,4% соответственно.
Дерма кожи образована эмбриональной соединительной тканью. Разделения ее на слои не просматривается. Под базальной мембраной лежат молодые фибробласты слегка вытянутой формы. В более глубоких слоях форма фибробластов неправильная с короткими толстыми отростками. Ядра крупные, овальной формы. Цитоплазма слабо базофильна. Среди молодых фибробластов дермы кожи головы и туловища обнаружен, как и у зародышей в возрасте 47-49 суток, 18-20 мм длины, высокий индекс пролиферации (33,51+0,14 и 32,68+0,31) и антиапоптотический индекс (38,05+0,29 и 36,22+0,27). Клетки этих закладок слабо подвержены апоптозу: индекс апоптоза – 21,83+0,10 и 19,41+0,17 и индекс готовности к апоптозу – 6,55+0,09 и 6,14+0,05 (см. таблицу 3.9). Пролиферативная и апоптотическая активность выше в дерме кожи головы, в то время как снижение всех индексов в возрастном аспекте незначительное.
Межклеточное пространство после окраски толуидиновым синим при всех использованных рН ярко окрашивается в розово-фиолетовый цвет, что означает присутствие гиалуроновой кислоты и хондроитинсульфатов А и С. Следует отметить, что их количество несколько увеличилось по сравнению с предыдущим возрастом эмбрионов.
Обогатился и волокнистый компонент межклеточного вещества эмбриональной соединительной ткани дермы кожи головы и туловища. Эластические волокна пронизывают дерму в виде нежной сети (рисунок 3.21). Более густой она выглядит в глубоких слоях дермы. Иммуногистохимиче-ски между молодыми фибробластами контурируются только коллагеновые волокна образованные коллагеном III типа. Они пересекают друг друга в различных направлениях, образуя сеть. Эти же волокна являются аргиро-фильными после импрегнации серебром. Наибольшее их количество сконцентрировано под базальной мембраной, где сеть особенно густая.
Основную массу ШИК-позитивных веществ, по-прежнему, составляет гликоген. Амилазный контроль выявляет присутствие гликопротеинов в цитоплазме клеток всех закладок. Количество гликогена в клетках эпидермиса
Стадии 22-23. Зародыши К1-17, К1-34, К1-47, К1-52, К1-66, К1-71 К1-90, К1-96, К1-28; К1-38; К1-70; К1-85 – 55-57 суток (25-27 мм длины). Зародыши данного возраста (25-27 мм длины) покрыты формирующейся кожей, которая состоит из двух основных компонентов – производного эктодермального покровного эпителия или эпидермиса и производной мезенхимы – дермы. Слои дермы на данном этапе не выявляются. Все клетки эпидермиса внутри слоев не дифференцированы в различные виды, имеющиеся в эпидермисе в постнатальном периоде.
Эпидермис кожи головы у зародышей в возрасте 55-57 суток (25-27 мм длины) ясно отличается от эпидермиса кожи туловища. Эпидермис кожи головы состоит из трех слоев клеток, в связи с чем он толще эпидермиса кожи туловища. Базальный слой призматических клеток прилежит к базальной мембране и имеет овальные или округлые ядра. Кубические клетки промежуточного слоя в один слой покрывают клетки базального слоя. На поверхности присутствует перидерма, состоящая из одного слоя уплощенных клеток с вытянутыми ядрами. Индекс пролиферации и апоптоза эпителиоцитов эпидермиса кожи головы продолжает постепенно снижаться по сравнению с зародышами в возрасте 50-52 суток (21-23 мм длины) на 0,7% и 2,4% соответственно и составляет 36,89+0,31 и 37,69+0,21 (таблица 3.10). Антиапоптотичекий индекс уменьшился на 1,0% (36,09+0,19) (рисунок 3.22). Индекс готовности к апоптозу остался на прежнем уровне.