Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Современные данные о морфологии тимуса 11
1.2.Современный взгляд на процессы инволюции тимуса 23
1.3. Современные представления о последствиях воздействия 1,2 диметилгидразина на организм в целом 29
1.4. Современные данные о состоянии иммунной системы матери в период беременности и формировании иммунитета плода 33
Глава 2. Материалы и методы исследования 38
Глава 3. Результаты собственных исследований 44
3.1. Морфологическое состояние толстой кишки при введении канцерогена 1,2-диметилгидразина в общей дозе 80 мг/кг интактным крысам и потомству спленэктомированных самок 44
3.2. Морфофункциональное состояние тимуса потомства интактных крыс .46
3.2.1. без постнатального воздействия 46
3.2.2. Морфофункциональное состояние тимуса при экспериментальном канцерогенезе потомства интактных крыс в возрасте 3-х месяцев 60
3.2.3. в возрасте 6-ти месяцев 67
3.3. Морфофункциональное состояние тимуса потомства спленэктомированных крыс 75
3.3.1. в возрасте 3-х месяцев без постнатального воздействия 75
3.3.2. в возрасте 6-ти месяцев без постнатального воздействия 83
3.3.3 Морфофункциональное состояние тимуса крыс в возрасте 3-х месяцев при экспериментальном канцерогенезе в условиях врожденного иммунодефицита 90
3.3.4. в возрасте 6-ти месяцев 99
Глава 4. Обсуждение результатов и заключение 110
Выводы 122
Список литературы 124
- Современные представления о последствиях воздействия 1,2 диметилгидразина на организм в целом
- Современные данные о состоянии иммунной системы матери в период беременности и формировании иммунитета плода
- Морфофункциональное состояние тимуса потомства интактных крыс
- Морфофункциональное состояние тимуса потомства спленэктомированных крыс
Введение к работе
Актуальность темы. Онкологическая заболеваемость в России и мире
продолжает неуклонно расти. В индустриально развитых странах
злокачественные новообразования выявляются ежегодно у сотен тысяч человек. Смертность от онкозаболеваний составляет 7,5 млн человек в год, т.е. на долю онкопатологии приходится около 13% смертей в мире (С.А. Шинкарев и др., 2013). В России этот показатель составляет 15,4% (А.В. Самойлова, 2015).
Исследования последних лет доказали несомненную роль патологий иммунной системы в развитии раковых опухолей. Так, известно, что среди пациентов с первичными иммунодефицитами стандартизованный показатель заболеваемости раком выше в 1,6 раза по сравнению с общей популяцией (C.M. Vajdic et al., 2010). Появившаяся в XX веке и стремительно развивающаяся наука онкоиммунология постоянно обнаруживает новые факты о процессах взаимодействия иммунных клеток с раковыми (O.J. Finn, 2012).
В структуре смертности от злокачественных новообразований более 30% занимают лица моложе 60 лет. Также увеличивается число детей с впервые выявленной онкопатологией (А.Д. Каприн и др., 2013). Новообразования стоят на третьем месте в списке причин детской смертности в России после смерти от внешних причин и вследствие врожденных аномалий развития (Л.П. Суханова, М.С. Скляр, 2007). Наиболее часто злокачественные новообразования встречаются у детей до 4 лет, что свидетельствует о роли в развитии данной патологии факторов, действовавших пренатально.
Состояние здоровья матери во время беременности несомненно влияет на развитие иммунной системы плода. В современной литературе мы встретили данные о негативном влиянии на формирование иммунитета потомства патологии гепатобилиарной системы матери (Т.И. Бирюкова, 2009; Е.Ю. Шаврина, 2012), экзогеннотоксических воздействий (И.В. Тарасюк, 1996; П.В. Пугач, 2012), патологии беременности (Т.А. Романова, С.В. Обухова, 2013).
Известно, что активация иммунной системы материнского организма в
ранние сроки беременности приводит к снижению противоопухолевого
иммунного ответа у потомства (С.С. Обернихин, 2013; Н.В. Яглова, 2013).
Однако нам не встретились данные об иммунном статусе и
морфофункциональных особенностях органов иммунной системы у потомства самок с иммунодефицитом. Существуют работы по изучению иммунных органов при канцерогенезе на фоне нормального функционирования иммунной системы (О.Ю. Кострова, 2013), а также при исходном вторичном иммунодефиците (Е.В. Москвичев, 2013). Несмотря на это, в доступной нам литературе мы не обнаружили данных об изменениях состояния иммунных органов при канцерогенезе в условиях врожденного иммунодефицита.
Таким образом, изучение морфологических и иммуногистохимических особенностей тимуса потомства самок с вторичным иммунодефицитом, а также изменений, происходящих в тимусе при введении канцерогена на фоне врожденного иммунодефицита, является актуальным и представляет научный интерес для широкого круга специалистов. Все вышесказанное свидетельствует о целесообразности настоящего исследования.
Цель исследования – оценить морфофункциональное состояние тимуса потомства крыс с вторичным иммунодефицитом через 3 и 6 месяцев после рождения без постнатального воздействия, а также при постнатальном введении 1,2-диметилгидразина.
Задачи исследования:
-
Провести морфометрию коркового и мозгового вещества долек тимуса у потомства интактных и спленэктомированных самок через 3 и 6 месяцев после рождения, а также при постнатальном введении 1,2-диметилгидразина в общей дозе 80 мг/кг в этих экспериментальных группах.
-
Изучить содержание биогенных аминов в люминесцирующих структурах тимуса через 3 и 6 месяцев после рождения в указанных экспериментальных моделях.
-
Выявить экспрессию маркеров апоптоза (bcl-2) и клеточной пролиферации (Ki67) в структурах тимуса потомства крыс в эти же сроки в указанных экспериментальных моделях.
-
Установить особенности распределения зрелых Т-лимфоцитов (CD3) и ретикулоэпителиальных клеток (Pan-cytokeratin) в корковом и мозговом веществе тимуса в эти же сроки в экспериментальных моделях.
-
Определить особенности локализации и количественного распределения
клеток микроокружения долек тимуса – дендритных (S-100), тучных, нейроэндокринных (Synaptophysin) и мононуклеарных фагоцитов (CD68) в эти же сроки в указанных экспериментальных моделях.
Научная новизна работы. Впервые показано, что беременность в
состоянии иммунодефицита влечёт за собой структурные изменения тимуса
потомства. В возрасте 3-х месяцев толщина коркового вещества и площадь
мозгового вещества уменьшается по сравнению с возрастной нормой. В
возрасте 6-ти месяцев морфометрические показатели, напротив,
увеличиваются.
Установлено, что постнатальное введение канцерогена потомству
спленэктомированных самок сопровождается более значимыми
инволютивными изменениями в тимусе, чем введение той же дозы канцерогена интактным крысам. В возрасте 3-х месяцев изменения соответствуют II-III фазам инволюции, в возрасте 6-ти месяцев наблюдается IV фаза.
Впервые продемонстрировано, что введение 1,2-диметилгидразина потомству спленэктомированных крыс приводит к усилению интенсивности люминесценции биоаминсодержащих структур тимуса и увеличению отношения (серотонин+гистамин)/катехоламины. В тимусе 6-месячных крыс регистрируется особенно значимое увеличение данного отношения.
В нашей работе установлено, что беременность на фоне иммунодефицита приводит к изменению локализации и количественного распределения клеточных популяций в структурах тимуса. В возрасте 3-х месяцев наблюдается увеличение численности всех исследуемых групп клеток, причем наиболее значимо возрастает число CD3+-клеток (более чем в 2 раза). В тимусе 6-месячных крыс отмечается усиление экспрессии маркера клеточной пролиферации Ki67. Локализация и численность клеток микроокружения не отличается от возрастной нормы.
Впервые показано, что постнатальное введение канцерогена потомству самок с вторичным иммунодефицитом приводит к разнонаправленным изменениям морфологии клеток тимуса. В возрасте 3-х месяцев количество Ki67+-клеток увеличивается. В возрасте 6-ти месяцев отмечается резкое уменьшение численности пролиферирующих клеток, количество CD3+-клеток
достоверно возрастает. Численность макрофагов и эпителиальных клеток ниже, а дендритных клеток и клеток APUD-серии выше возрастной нормы на обоих сроках исследования.
Научно–теоретическая значимость. Материалы диссертационного
исследования дополняют сведения о влиянии экстрагенитальной патологии у
беременных на иммунный статус потомства. Впервые описаны изменения
морфофункционального состояния тимуса потомства в возрастной динамике в
зависимости от состояния иммунной системы матери. Проанализирована
взаимосвязь между иммунным статусом матери во время беременности и
характером инволютивных изменений в тимусе потомства при химически
индуцированном постнатальном канцерогенезе. Полученные данные
представляют интерес для гистологов, онкологов и иммунологов.
Практическая значимость. Работа носит экспериментально-
теоретический характер, а также интересна для практических врачей – онкологов и иммунологов. Результаты работы будут использованы в практике врачей женских консультаций и детских поликлиник для выявления пациентов, составляющих группу риска по патологиям иммунной системы.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Беременность в состоянии вторичного иммунодефицита приводит к морфофункциональным изменениям тимуса потомства: в возрасте 3-х месяцев на фоне уменьшения толщины коркового и площади мозгового вещества отмечается достоверное увеличение численности CD3+-лимфоцитов, дендритных клеток, макрофагов, ретикулоэпителиоцитов и клеток APUD-серии. В возрасте 6-ти месяцев значения морфометрических показателей выше, чем в группе интактных крыс того же возраста. Численность Ki67+-клеток увеличена. Количество и локализация клеток микроокружения соответствует возрастной норме.
-
Постнатальное введение 1,2-диметилгидразина потомству самок с вторичным иммунодефицитом сопровождается более выраженными инволютивными изменениями в тимусе, чем введение той же дозы канцерогена интактным крысам. Инволюция характеризуется потерей дольчатой структуры тимуса, отсутствием сетевой организации корковых ретикулоэпителиоцитов,
инверсией распределения зрелых лимфоцитов, уменьшением численности пролиферирующих клеток, макрофагов и bcl-2+-клеток и увеличением количества дендритных клеток и клеток APUD-серии.
Внедрение результатов исследования
Данные, полученные в ходе исследования, используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедре общей и клинической морфологии и судебной медицины ФГБОУ ВПО «ЧГУ им. И.Н. Ульянова», кафедре терапии и семейной медицины АУ ЧР «Институт усовершенствования врачей», в практике БУ «Республиканский клинический онкологический диспансер». Результаты исследования в форме статей и тезисов опубликованы в отечественных и зарубежных научных изданиях.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения соответствуют формуле специальности 03.03.04 – «Клеточная биология, цитология, гистология». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно – пунктам 1, 5 и 6.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на
IV Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в
медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва,
2011); V Всероссийской научно-практической конференции
«Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные
аспекты» (Москва, 2012); V Международной студенческой электронной
научной конференции «Студенческий научный форм 2013»; V Международном
молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения –
2013» (Санкт-Петербург, 2013); IV съезде физиологов СНГ (Сочи, 2014);
конференции, посвященной 250-летию кафедры анатомии человека Первого
МГМУ им. И.М. Сеченова «Анатомия человека: вчера, сегодня, завтра»
(Москва, 2014). Материалы докладывались на XII Всемирном конгрессе
«Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2011); Итоговой Всероссийской
студенческой научной конференции с международным участием
«Медицинская весна» (Москва, 2013); научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы
экспериментальной и клинической медицины» (Чебоксары, 2014).
Апробация диссертационной работы прошла на совместном заседании кафедры общей и клинической морфологии и судебной медицины, кафедры нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией, кафедры инструментальной диагностики с курсом фтизиатрии и кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии ФГБОУ ВПО «ЧГУ им. И.Н. Ульянова» (протокол №1 от 22.05.2015г.).
Личный вклад автора. Диссертация является личным трудом автора Драндровой Елены Геннадьевны. Ею проделана большая работа по проведению экспериментов, сбору литературных источников, анализу полученных данных, написанию статей и тезисов по материалам диссертационной работы. Все экспериментальные данные получены лично автором. Статистическая обработка научных данных и подготовка иллюстративного материала выполнена самостоятельно автором. Все использованные в диссертации литературные источники проанализированы лично.
Публикации. По теме диссертации опубликованы 25 научных работ (тезисы – 16, статьи – 9). 3 работы опубликованы в ведущих рецензируемых российских научных журналах из перечня ВАК, рекомендованных для публикаций основных результатов диссертаций на соискание учёных степеней.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения и
шести глав: обзора литературы, материалов и методов, результатов
собственных исследований, обсуждения результатов и заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 157 cтраницах машинописного текста (собственно текста – 123 страницы), содержит 7 таблиц и проиллюстрирована 75 рисунками, включая микрофотографии. Список литературы содержит 313 источников, в том числе 155 зарубежных.
Современные представления о последствиях воздействия 1,2 диметилгидразина на организм в целом
Вилочковая железа или тимус - железа внутренней секреции, а также центральный (первичный) орган лимфоидного кроветворения и иммунной защиты организма.
Тимус - непарный орган, состоит из двух долей и у человека располагается в передней части верхнего средостения, непосредственно над сердцем и позади грудины (J.Gordon, 2011). Передняя поверхность железы выпуклая, лежит кзади от рукоятки и тела грудины до уровня IV реберного хряща. Правая и левая доли тимуса имеют разную величину, иногда встречается промежуточная доля (М.Р. Сапин, 2012). Железа может иметь лентовидную, пирамидальную, овоидную, парусовидную форму. У детей в большинстве случаев встречается тимус пирамидальной формы (И.Г. Михеева, Т.Г. Верещагина, 2005). По данным других авторов у взрослых обнаруживается три типа формы тимуса (лептоморфная, мезоморфная и брахиморфная) и компоновки (округлая, эллипсоидная и уплощенная) (В.А. Забродин, 2004).
С поверхности тимус покрыт капсулой из плотной волокнистой соединительной ткани. От капсулы внутрь органа отходят септы, или перегородки, которые делят тимус на дольки (С.Л. Кузнецов, 2007). Ретикулярные эпителиоциты образуют трехмерную сеть и создают микроокружение для лежащих между ними развивающихся Т-лимфоцитов (В.Л. Быков, СИ. Юшканцева, 2013).
В паренхиме дольки тимуса условно выделяют 4 зоны: субкортикальную, внутреннюю корковую, кортико-медуллярную и мозговую (М.А. Красноперова, 2004). Субкортикальная зона, или наружный подкапсулярный слой, состоит из 1-3-х рядов больших лимфоцитов и бластных клеток с высокой митотической активностью. Здесь также встречаются эпителиальные клетки-няньки. Кнутри от субкортикальной зоны расположен внутренний кортикальный слой, или собственно корковое вещество тимуса. Здесь созревающие тимоциты, продолжая делиться, смещаются в более глубокие части коры, где становятся иммунокомпетентными клетками. В этой зоне встречаются в основном средние и малые лимфоциты, а также дендритные и эпителиальные клетки. Кортико-медуллярная зона является переходной между корковым и мозговым веществами. Некоторые авторы считают нецелесообразным выделение отдельно кортико-медуллярной зоны и вместо нее называют внутридольковые периваскулярные пространства, т.к. других особых структур на границе коры и мозгового вещества не найдено. Кортико-медуллярная зона представлена в основном малыми лимфоцитами. Здесь происходит основная миграция тимоцитов через расширения внутридольковых периваскулярных пространств (В.П. Харченко и др., 1998). В медуллярной зоне, или мозговом веществе, тимуса встречаются многочисленные эпителиальные клетки, макрофаги, единичны эозинофилы. Митотическая активность клеток низкая (А.С. Фомина, 2011). Отличительной особенностью мозгового вещества являются так называемые тимусные тельца (Гассаля) -скопления концентрически наслоённых плотных, сильно уплощенных эпителиальных клеток (А.Г. Беловешкин, 2014).
Тимус обнаруживается только у позвоночных, он развивается из энтодермы кишечной трубки вместе с паращитовидными железами (A. Grapin-Botton, D. Constam, 2007; A.M. Zorn, J.M. Wells, 2009). Закладка тимуса у человека происходит на 4-й неделе эмбриогенеза, а у мыши на 10,5 день. Из дорсальной части третьего глоточного кармана формируется паращитовидная железа, а вентральная его часть образует тимус. Зачаток представляет собой окруженный капсулой из мезенхимы эпителиальный орган, из которого позже развивается одна доля тимуса и одна паращитовидная железа (З.С. Хлыстова, 1987; В.П.Харченко, 1998; S. Clark, 1963; В. von Gaudecker, 1986; S. Gray, J. Skandalakis, 1990). Ha 11 день эмбриогенеза у мыши парные зачатки отделяются от глотки и начинают мигрировать каудально в направлении грудной полости. Вскоре после отделения от глотки, на 12-й день эмбриогенеза паращитовидные железы и тимус разделяются, и паращитовидные железы остаются на задней поверхности щитовидной железы. Доли тимуса продолжают мигрировать в каудальном направлении и на 13-й день эмбрионального развития соединяются непосредственно над сердцем по средней линии тела (J. Gordon, 2011, A.M. Farley et al., 2013). У человека данный процесс заканчивается к 6-й неделе эмбриогенеза.
Миграция клеток-предшественников лимфоцитов в тимус начинается на 11,5 день внутриутробного развития мыши и контролируется экспрессией хемокинов (С. Liu et al., 2005, Z. Liu et al., 2007). Иммиграция клеток лимфоидного ряда - непродолжительный процесс, он происходит на определенных стадиях органогенеза дискретными волнами (N.M. Le Douarin, 1973; N.M. Le Douarin, F.V. Jotereau, 1975). У человека клетки лимфоидного ряда начинают определяться в тимусе на 13-14-й неделе гестации (Г.Н. Дранник, 2013). Так как этот процесс начинается до васкуляризации тимусного зачатка (С. Liu et al., 2005; К. Foster et al., 2008), клетки-предшественники лимфоцитов проходят через окружающую мезенхиму и базальную мембрану (N.M. Le Douarin, F.V. Jotereau, 1975). Периодическое поступление клеток-предшественников лимфоцитов в тимус продолжается и в постнатальном периоде и контролируется клетками стромы вилочковой железы (М.А. Ritter, 1978; F.V. Jotereau, N.M. Le Douarin, 1982; M. Coltey et al., 1987, D.L. Foss et al, 2001; E. Donskoy et al., 2003; I. Goldschneider, 2006).
Вилочковая железа - эндокринный орган, который играет важную роль в процессе лимфопоэза. Основная функция тимуса - регуляция Т-клеточного иммуногенеза. Властные клетки (предшественники Т-лимфоцитов) поступают в тимус из костного мозга (Ю.И. Будчанов, 2008). В эмбриональном периоде - из гемопоэтической ткани печени (С.А. Кащенко, И.В. Бобрышева, 2013). Они мигрируют через кровеносные сосуды, расположенные на границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса и располагаются во внутридольковых периваскулярных пространствах. Затем лимфоциты совершают свой стереотипный маршрут от коркового вещества к мозговому и покидают тимус опять по кровяному руслу (E.F. Lind et al, 2001; J. Gordon, N.R. Manley, 2011). Каждые 6-9 часов в тимусе появляются заново обученные тимоциты. С током крови они достигают периферических органов иммунной системы -лимфатических узлов и селезенки, где окончательно созревают.
В тимусе наблюдается высокая митотическая активность клеток-предшественников Т-лимфоцитов. По данным литературы, из 2 108 тимоцитов 20-25% ежедневно образуются заново за счёт деления бластных клеток. Но лишь 2-5% из них покидают тимус, поступая в кровь и расселяясь в лимфоидных органах. 95-98% тимоцитов погибают в тимусе путем апоптоза, их остатки фагоцитируются макрофагами (И.С. Фрейдлин, 1997; В.О. Полякова и др., 2001; И.Г. Михеева, Т.Г. Верещагина, 2005).
Отбор Т-клеток проходит в 2 этапа. Позитивную селекцию проходят лимфоциты, способные распознавать собственные белки МНС (главного комплекса гистосовместимости). В процессе негативной селекции происходит элиминация потенциально аутореактивных Т-клеток (В.О. Полякова и др., 2001; J. Gordon, N.R. Manley, 2011). Результатом генетически детерминированного отбора является формирование субпопуляций Т-клеток: сначала одновременно экспрессирующих маркеры хелперов и киллеров (CD4+CD8+) и рецепторов Т-клеток (двойные позитивные Т-лимфоциты), затем - рецепторы Т-клеток и только один из маркеров (Н.В. Бойчук, 2007).
Современные данные о состоянии иммунной системы матери в период беременности и формировании иммунитета плода
При обработке срезов тимуса потомства интактных крыс в возрасте 3 месяцев люминесцентно-гистохимическими методами выявлено, что паренхима железы разделена на дольки полигональной или округлой формы. При окраске по Фальку-Хилларпу для выявления серотонина и катехоламинов наблюдается желто-зеленое свечение тканей, а при окраске по Кроссу-Эвену-Росту для идентификации гистаминсодержащих структур в дольках отмечается зеленое свечение. Мозговое вещество в центре дольки имеет более темное окрашивание. Корковое вещество, расположенное вокруг мозгового, более светлое, что свидетельствует о более высоком содержании в его клетках биогенных аминов.
На фоне равномерного свечения лимфоцитарной паренхимы определяются более яркие участки скопления биогенных аминов - люминесцирующие гранулярные клетки (ЛТК). Среди ЛГК выделяют более крупные, расположенные в один-два ряда вокруг мозгового вещества клетки кортико-медуллярной зоны (КМЗ), обладающие ярко-желтым свечением (рис. 3). Диффузно расположенные так называемые клетки субкапсулярной зоны (СКЗ) в корковом веществе дольки обладают меньшими размерами, с меньшим бледно-желтым свечением. По периферии коркового вещества, в области границ долек встречаются единичные тучные клетки. При люминесцентной микроскопии они визуализируются как клетки овальной формы, заполненные неоднородным содержимым в виде беловато-желтых гранул. Ядра этих клеток, как правило, расположены по периферии и не люминесцируют.
Для определения функционального состояния клеток тимуса нами было использовано соотношение (серотонин+гистамин)/катехоламины. В предыдущих наших исследованиях было выявлено, что повышение этого показателя происходит при угнетении функциональной активности тимуса, а понижение -при активизации происходящих в нем процессов (Г.Ю. Стручко, 2003).
На препаратах тимуса у потомства интактных крыс в возрасте 6 месяцев наблюдается уменьшение размеров дольки преимущественно за счёт уменьшения толщины коркового вещества. Границы между дольками частично стерты. ЛГК КМЗ увеличиваются в размерах, располагаются в 2-3 ряда вокруг мозгового вещества, промежутки между ними уменьшаются. Часть клеток дегранулирует. Количество клеток субкапсулярной зоны в поле зрения увеличивается (рис. 4). серотонина и гистамина достоверно выше во всех исследуемых группах клеток, причём в большей степени повышается уровень гистамина. Уровень катехоламинов увеличивается не столь значительно (табл. 1). Данные изменения приводят к небольшому увеличению соотношения (серотонин+гистамин)/катехоламины (рис. 5). Таблица 1 - Интенсивность люминесценции биоаминов (у.е.) в структурах тимуса у потомства интактных крыс в возрасте 3 и 6 месяцев Структуры тимуса 3 месяца 6 месяцев СТ гст КА СТ гст КА ЛГК кортико-медуллярнойзоны 509,75± 14 543,5 ± 2,91 195,7 ± 5,85 531,7± 10,2 606,2±4,3" 190,5± 6,4 ЛГКсубкапсулярнойзоны 284,8 ±2,22 440,8 ± 9,58 174 ± 1,8 307,6± 3,6" 496,4±5,3" 183,7±3,3 Тимоциты коркового вещества 234,1 ± 1,83 446,7 ± 5,84 154 ±7,9 257,9± 2,32" 463,1±2,9" 160,3±5,2
Тимус. Потомство интактной крысы, 3 месяца. Дольки, разделенные междольковыми перегородками. Окраска гематоксилином и эозином. МИКРОМЕД 3 ЛЮМ. Ув. 100х При окраске препаратов тимуса интактных крысят в возрасте 3-х месяцев гематоксилином и эозином визуализируются дольки округлой или полигональной формы, разделенные между собой междольковыми перегородками (рис. 6). Паренхима тимуса образована клетками небольшого размера с плотным округлым ядром, окруженным базофильной цитоплазмой в виде тонкого кольца, -лимфоцитами. В корковом веществе клетки расположены более скученно, что придает ему более темную окраску. Мозговое вещество заполнено тимоцитами в меньшей степени и окрашивается менее насыщенно.
При проведении морфометрии установлено, что площадь мозгового вещества дольки составляет 0,43±0,076 мм2, толщина коркового вещества равна 341,2±14,7мкм.
Дольки тимуса 6-тимесячных крысят уменьшаются в размерах преимущественно за счёт коркового вещества. Границы между дольками частично стираются. Дольки, расположенные в центре органа, вытягиваются в длину, и форма их приближается к овальной. Мозговое вещество повторяет форму дольки. По периферии органа среди коркового вещества встречаются небольшие изолированные друг от друга участки мозгового вещества площадью 0,019±0,009 мм2 (рис. 7). Площадь мозгового вещества долек равна в среднем 0,39±0,013 мм2, толщина коркового вещества 247,5±19,0 мкм, что в 1,4 раза меньше соответствующих показателей у 3-хмесячных крысят (р 0,001).
При окраске срезов по методу Унна установлено, что тучные клетки в тимусе потомства интактных крыс располагаются преимущественно вдоль междольковых соединительнотканных септ. Единичные тучные клетки встречаются также в корковом веществе. При подсчёте в поле зрения обнаруживается 3,8±0,4 тучных клетки с преобладанием в их числе недегранулирующих и слабодегранулирующих форм (рис. 8). Индекс дегрануляции тучных клеток у этой группы крыс составляет 1,2. В возрасте 6 месяцев индекс дегрануляции незначительно повышается и составляет 1,34. Число тучных клеток также увеличивается - до 4,2±0,3 клеток в поле зрения.
Морфофункциональное состояние тимуса потомства интактных крыс
Расположение эпителиальных клеток в корковом веществе не подвергается изменениям. Однако меняется расположение медуллярных эпителиальных клеток. Они заселяют мозговое вещество не равномерно, а небольшими участками, между которыми находятся пространства, свободные от эпителиоцитов. Доля медуллярных эпителиоцитов снижается и составляет 23,5±1,3%. В корковом веществе доля эпителиальных клеток, напротив, возрастает на 8% и равна 38,0±3,2% (рис. 44).
Численность дендритных клеток несколько выше, чем в тимусе потомства интактных крыс, и составляет 29,2±2,6 клеток в поле зрения, что больше на 19,7% (р 0,01) (рис. 45).
Таким образом, в тимусе потомства спленэктомированных крыс в возрасте 3-х месяцев наблюдаются небольшие морфологические изменения. Рисунок 44 - Тимус. Потомство спленэктомированной крысы, 3 месяца. Изменение расположения медуллярных эпителиальных клеток. Иммуногистохимическая реакция к панцитокератину. МИКРОМЕД 3 ЛЮМ. Ув. 400х - Тимус. Потомство спленэктомированной крысы, 3 месяца. Увеличение количества дендритных клеток. Иммуногистохимическая реакция к белку S-100. МИКРОМЕД 3 ЛЮМ. Ув. 100х 3.3.2. Морфофункциональное состояние тимуса потомства спленэктомированных крыс в возрасте 6-ти месяцев без постнатального воздействия
Проведение люминесцентной микроскопии тимуса потомства спленэктомированных крыс в возрасте 6-ти месяцев позволяет выявить, что орган сохраняет дольчатую структуру. В центре дольки визуализируется более темное мозговое вещество, по периферии его окружает корковое вещество. Часть долек имеет округлую или полигональную форму, некоторые дольки вытянутые. При окраске по Фальку наблюдается увеличение количества и усиление интенсивности люминесценции ЛГК (рис. 46). Размеры клеток также увеличены. При окраске по Кроссу интенсивность люминесценции ЛГК кортико-медуллярной и субкапсулярной зон, напротив, снижена.
Рисунок 46 - Тимус. Потомство спленэктомированной крысы, 6 месяцев. Увеличение количества и усиление интенсивности люминесценции ЛГК. Метод Фалька-Хилларпа. МИКРОМЕД 3 ЛЮМ. Ув. 100х
Результаты цитоспектрофлуориметрии показывают, что уровень гистамина достоверно выше в тучных клетках, тимоцитах микроокружения тучных клеток, тимоцитах коркового и мозгового вещества. В ЛГК кортико-медуллярной и субкапсулярной зон уровень гистамина снижен. Серотониновая и катехоламиновая насыщенность клеток изменяется разнонаправленно (табл. 5). Таблица 5 - Интенсивность люминесценции биоаминов (у.е.) в структурах тимуса у потомства интактных и спленэктомированных крыс в возрасте 3-х и 6-ти месяцев
Структуры тимуса Потомствоинтактных крыс ввозрасте 3-хмесяцев Потомствоинтактных крыс ввозрасте 6-тимесяцев Потомствоспленэктомированных крысв возрасте 3-хмесяцев Потомствоспленэктомированных крысв возрасте 6-тимесяцев
При микроскопии срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, выявлено, что междольковые септы почти не визуализируются, в связи с чем определить толщину коркового вещества не представляется возможным. Площадь мозгового вещества увеличена на 32% по сравнению с группой потомства интактных крыс. На границе коркового и мозгового вещества, в кортико-медуллярной зоне, отмечается повышенная васкуляризация (рис. 48). Рисунок 48 - Тимус. Потомство спленэктомированной крысы, 6 месяцев. Увеличение площади мозгового вещества. Отсутствие дольчатой структуры. Усиленная васкуляризация кортико-медуллярной зоны Окраска гематоксилином. МИКРОМЕД 3 ЛЮМ. Ув. 100х
Средний показатель массы тимуса в данной группе не отличается от показателя в группе потомства интактных крыс того же возраста и составляет 234±43,8 мг. Однако масса крыс в данной группе значительно меньше и в среднем равна 213,3±23,4 г (р 0,001). Вследствие этого, относительная масса тимуса на 56% выше аналогичного показателя в группе интактных крыс и равна 1,1 мг/г.
При окраске срезов по методу Унна тучные клетки определяются в междольковых промежутках. В поле зрения встречается 5,95±0,6 клеток, что на 42% больше, чем у потомства интактных крыс такого же возраста (р 0,01) (рис. 49). Однако распределение клеток по степени дегрануляции значительно не отличается от такового у интактных крыс. Клетки с сильной степенью дегрануляции составляют лишь 4% всех тучных клеток (рис. 50). Индекс дегрануляции равен 1,37, что также достоверно не отличается от значения данного показателя у потомства интактных крыс.
При проведении иммуногистохимической реакции на CD3 установлено, что распределение зрелых тимоцитов в тимическои дольке почти не отличается от распределения их в дольке тимуса потомства интактных крыс. В корковом веществе наблюдается незначительное (на 4%) повышение числа зрелых Т-клеток, они занимают 32,2±5,4% всей площади. В мозговом веществе, напротив, регистрируется небольшое снижение CD3+ клеток - они составляют 44,3±3,2% всей популяции. Численность пролиферирующих клеток и в корковом, и в мозговом веществе дольки увеличивается. В мозговом веществе Ki67+ клетки занимают 23,3±2,8% всей площади, что в 1,7 раза больше, чем в тимусе крыс контрольной группы. В корковом веществе 82±2,3% всех клеток являются пролиферирующими (в тимусе интактных крыс соответствующий показатель равен 29,5±1,4%)
Морфофункциональное состояние тимуса потомства спленэктомированных крыс
Есть мнение, что диффузная нейроэндокринная система влияет на функциональную активность тимуса опосредованно через активацию тучных клеток. Согласно исследованиям Т. Marinova (2007) и В.В. Гусельниковой (2013), зрелые тучные клетки в тимусе располагаются в пределах капсулы, септ, субкапсулярных и периваскулярных пространств. Аналогичная локализация характерна для клеток, дающих положительную реакцию на синаптофизин. Функционально зрелые тучные клетки в ответ на воздействие нейропептидов дегранулируют, что мы и наблюдаем в процессе развития акцидентальной инволюции тимуса. Выделяются такие вещества как серотонин, гистамин, триптаза, фактор роста нервов и др. Есть данные о возможности селективной дегрануляции, т.е. серотонин может быть секретирован тучными клетками независимо от гистамина (Н. Vliagoftis et al., 1990). Медиаторы тучных клеток разнонаправленно действуют как на клетки APUD-серии - источники нейропептидов, так и на клетки, обеспечивающие дифференцировку Т-лимфоцитов. Т.е. тучные клетки играют роль посредников, между неироэндокринными клетками и клетками паренхимы тимуса (В.В. Гусельникова, 2013).
У потомства спленэктомированных крыс в возрасте 3-х месяцев наблюдается снижение всех морфометрических показателей относительно возрастной нормы. Высокая интенсивность люминесценции биоаминов и резкое увеличение соотношения (СТ+ГСТ)/КА подтверждает угнетение иммунных процессов в тимусе. Увеличение численности зрелых лимфоцитов, а также макрофагов, дендритных клеток и клеток APUD-серии говорит о напряженности иммунного ответа.
Воздействие неблагоприятных экзогенных факторов негативно влияет на закладку и созревание различных систем органов плода, в том числе и иммунной. Данная концепция, известная как «перинатальное программирование», в последние годы является объектом многих научных исследований. Доказано, что пренатальный стресс сильно влияет на гомеостаз развивающегося организма (А.П. Парахонский, 2009; V.G. Moisiadis, S.G. Matthews, 2014). Выделяемые при активации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы глюкокортикоиды, проникая через плаценту, угнетающе действуют на формирование эндокринной, иммунной и нервной систем плода (А.В. Шайтарова и др., 2011; N. Shanks, S.L. Lightman, 2001; J. Dotsch, 2014). Аналогичным образом влияют глюкортикоиды и в неонатальном периоде.
Мы полагаем, что предшествующая беременности спленэктомия столь же отрицательно сказывается на закладке органов и систем плода. В основе этого влияния лежит стойкое увеличение уровня кортизола в крови, выявляемое даже в отдаленные сроки после операции (Г.Ю. Стручко, 2003), Еще одним немаловажным фактом является недостаточность как гуморального, так и клеточного звеньев иммунитета матери (И.Е. Павлова, 2007; В.В. Масляков и др., 2012).
Известно, что во внутриутробном и неонатальном периодах плод, а впоследствии - новорожденный приобретает пассивный иммунитет от матери. Через плаценту к плоду поступают антитела, продуцируемые В-лимфоцитами матери. При нормально функционирующей плаценте в крови плода обнаруживаются только материнские иммуноглобулины G, однако при патологиях плаценты возможно попадание в кровь плода и других групп иммуноглобулинов (F. Saji и др., 1999, Е. Jauniaux, В. Gulbis, 2000). После рождения факторы иммунитета продолжают поступать в организм новорожденного вместе с материнским молоком. Так, известно, что в состав грудного молока входят иммуноглобулины, множество цито- и хемокинов, факторы врожденного иммунитета (комплемент, лизоцим, фактор хемотаксиса и др.), пребиотики, гормоны и факторы роста и даже некоторые виды клеток (макрофаги, нейтрофилы, лимфоциты) (D.S. Newburg, 2005, C.J. Field, 2005, G. Chirico, 2005). Недостаточность пассивной иммунизации плода и новорожденного в период незрелости его собственной иммунной системы также, по нашему мнению, является причиной запуска в тимусе патологических процессов.
В возрасте 6-ти месяцев у потомства спленэктомированных самок отмечается увеличение относительной массы тимуса. В целом, в вилочковой железе наблюдаются процессы, отличные от тех, что происходят в тимусе потомства интактных крыс того же возраста. Значения основных морфометрических показателей увеличиваются. На фоне усиления экспрессии bcl-2 растет процент пролиферирующих клеток. Количество, размеры и интенсивность люминесценции ЛТК также увеличиваются.
Белок bcl-2 является важнейшим супрессором апоптоза. Экспрессируется главным образом на мембране митохондрий и, в меньшей степени, на ядерной и клеточной мембранах (A.M. Камышный и др., 2007; V. Marsden, A. Strasser, 2003). Высокий уровень экспрессии bcl-2 наблюдается в незрелых Т- и В-клетках, а также зрелых долгоживущих иммунных клетках памяти, нейронах головного мозга, хондроцитах и др. (D. Langenau, С. Jette, 2005). Увеличение количества bcl-2+ клеток наблюдается при высокой интенсивности клеточного деления (Е.В. Москвичев, 2013; J.C. Reed et al, 1987).
Высокий уровень клеточной пролиферации и усиление экспрессии антиапоптотического белка bcl-2 указывает на преобладание пролиферативных процессов над клеточной гибелью. На наш взгляд, данные изменения в тимусе являются последствием влияния повышенного уровня глюкокортикоидов во внутриутробном и неотанальном периодах. Так, доказано, что введение дексаметазона крысам в течение первой недели жизни приводит к длительному нарушению процессов Т-клеточной дифференцировки в тимусе и является фактором риска для развития аутоиммунных заболеваний (J.M. Bakker et al., 2001).