Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Современные представления о структуре и функциях тимуса 12
1.1.1. Гуморальная регуляция функционирования тимуса 22
1.1.2. Клеточный состав тимуса и нейромедиаторные биогенные амины 24
1.2. Роль мелатонина в организме 28
1.2.1. Физиологическая роль мелатонина 28
1.2.2. Применение мелатонина в клинической практике 32
1.2.3. Иммуномодулирующее действие мелатонина 33
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 38
2.1. Организация эксперимента 38
2.2. Гистологические методы исследования 40
2.3. Люминесцентно-гистохимические методы исследования 40
2.4. Иммуногистохимические методы исследования 42
2.5. Метод морфометрии 43
2.6. Математические методы исследования 43
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 45
Структурно-функциональное состояние тимуса мышей при поступлении мелатонина в различных световых условиях
3.1. Морфологическая характеристика тимуса 45
3.2. CD1а-позитивные клетки тимуса 51
3.3. CD3-позитивные клетки тимуса 54
3.4. CD57-позитивные клетки тимуса 59
3.5. CD68-позитивные клетки тимуса з
3.6. Тучные клетки тимуса 68
3.7. Морфофункциональная реакция биоаминсодержащих структур тимуса экспериментальных животных
3.7.1. Гистаминсодержащие клетки тимуса 81
3.7.2. Серотонинсодержащие клетки тимуса 88
3.7.3. Катехоламинсодержащие клетки тимуса 95
3.7.4. Взаимосвязь биогенных аминов в клетках тимуса
экспериментальных мышей 99
Обсуждение результатов исследования 109
Заключение 121
Выводы 123
Рекомендации 125
Список сокращений 126
Список литературы 127
- Клеточный состав тимуса и нейромедиаторные биогенные амины
- Применение мелатонина в клинической практике
- Иммуногистохимические методы исследования
- Морфофункциональная реакция биоаминсодержащих структур тимуса экспериментальных животных
Введение к работе
Актуальность
В последние годы в связи с увеличением количества различных видов патологий, связанных с недостаточно эффективной работой иммунной системы человека ввиду ухудшения экологии, стрессовых воздействий, алиментарных причин (Долгих О. В. и др., 2012; Chinen J., Shearer W. T., 2008; Amato G. D. et al., 2015), к центральным органам иммунной защиты приковано внимание исследователей (Hanson M. L. et al., 2010; Cui W. et al., 2015).
В рамках этой проблемы несомненный интерес представляют вопросы, связанные с функционированием тимуса. Актуальность любых исследований этого органа обусловлена как высокой встречаемостью разных видов патологий, связанных с разнообразными нарушениями работы тимуса (Кулагина Н. Н., 2007), так и явной недостаточностью изученности клеточных основ различных нарушений в вилочковой железе.
Одним из наименее исследованных аспектов функционирования тимуса является гуморальная регуляция деятельности различных клеток этого органа. Несмотря на кажущуюся хорошую изученность действия различных регуляторных факторов на вилочковую железу, эта проблема далека от разрешения. Тимус изучали при воздействии ряда гормонов: соматотропного (Спирин И. В., 2007), адренокортикотропного (Лузикова Е. М., 2008), глюкокортикостероидов (Засеева М. Д., 2015), хорионического гонадотропина (Ялалетдинова Л. Р. и др., 2014), вместе с тем влияние одного из важнейших гуморальных факторов организма – мелатонина – на различные клеточные типы тимуса практически не исследовано.
На сегодняшний день мелатонин находит всё более широкое применение в клинике как адаптоген при смене часовых поясов, при инсомнии (Мендель В. Э, Мендель О. И., 2010; Innominato P. F. et al., 2015), в терапии патологии сердечнососудистой системы (Inoue Y., 2014) и желудочно-кишечного тракта (Беспятых А. Ю. и др., 2009), климактерического синдрома (Анисимов В. Н., Виноградова И. А., 2008), дегенеративных заболеваний нервной системы
4 (Sanchez-Barcelo E. J. et al., 2010), а также вводится в схемы противоопухолевого
лечения при некоторых видах рака (Сорочан П. П. и др., 2012).
Широкое клиническое применение мелатонина требует детального изучения всех его биологических функций, особенно эффектов на различные органы иммунной системы, тем более что в некоторых клетках тимуса, селезенки, костного мозга и лимфатических узлов обнаружены рецепторы к мелатонину (Cernysiov V. et al., 2012). В ряде работ показано модулирующее и синхронизирующее влияние мелатонина на деятельность Т-лимфоцитов in vivo и in vitro в культуре клеток и в тимусе (Литвиненко Г. И., 2011, 2015; Carrillo-Vico A. et al., 2013), однако влияние мелатонина на различные структурно-функциональные характеристики тимуса мало изучено.
В создании микроокружения лимфоцитов тимуса важное место занимают NK-клетки, макрофаги и тучные клетки (Бибик Е. Ю., Берест А. Ю., 2011; Gupta S., 2005). Уже известно, что экзогенный мелатонин увеличивает количество NK-клеток и моноцитов, как в костном мозге, так и в селезенке (Currier N. L. et al., 2000), однако таких данных для тимуса в литературе нам не встретилось. В работе Ozkanlar S. с соавт. (2015) показано снижение количества положительных на эстеразу тучных клеток в тимусе крыс после введения мелатонина. Вместе с тем мы не обнаружили данные о том, как изменяются различные характеристики тучных клеток в тимусе при введении этого эпифизарного гормона. Недостаточная изученность различных типов клеток в тимусе во многом обусловлена низкой информативностью классических морфологических подходов, но методы иммуногистохимии позволяют корректно их идентифицировать. Так, для выявления кортикальных (дубль-позитивных) тимоцитов используется маркер CD1a (Ковальчук Л. В., 2005), макрофагов – CD68 (Taylor P. R. et al., 2005), натуральных киллеров – CD57 (Lopez-Verges S., 2010). Высокоспецифичным маркером Т-лимфоцитов является CD3 антиген. Мембранное расположение последнего характерно для зрелых Т-лимфоцитов, а цитоплазматическая локализация – для незрелых тимоцитов (Криволапов Ю. А., Леенман Е. Е., 2006).
5 Биогенные амины, такие как гистамин, серотонин и катехоламины, также
играют важную роль в процессах функционирования любых клеток (Garcia M. G.
et al., 2013; Arreola R. et al., 2015). Изменение содержания биогенных аминов в
люминесцирующих клетках тимуса напрямую связано с модуляцией их функций
в иммунных реакциях (Михайлова М. Н., 2004). Так, избыточное содержание
гистамина и серотонина подавляет функции Т-лимфоцитов (Лузикова Е. М.,
Сергеева В. Е., 2008). Поэтому изучение изменений содержания биогенных
аминов в структурах тимуса под действием мелатонина представляет
несомненный интерес, ввиду того, что возможная роль влияния этого гормона на
их содержание и секрецию клетками тимуса не исследована.
Характер освещения напрямую связан с работой эпифиза и также оказывает влияние на состояние иммунной системы. Так, в ряде работ показано угнетающее действие постоянного освещения на иммунокомпетентные клетки (Бородин Ю. И. и др., 2012), ввиду подавления в организме синтеза мелатонина. Пребывание в постоянной темноте индуцирует эпифизарную гиперфункцию (Timofei O.V. et al., 2013). Однако возможное влияние световой депривации на структурно-функциональные характеристики тимуса практически не изучено.
В связи с этим изучение влияния мелатонина на тимус при различных режимах освещения является важным и актуальным в практическом и теоретическом аспектах.
Цель работы – изучение морфологической и иммуногистохимической характеристики тимуса лабораторных мышей при поступлении мелатонина с питьевой водой в течение 2 или 4 недель в зависимости от условий освещения.
Задачи исследования:
-
Изучить морфометрические характеристики тимуса: площади коркового и мозгового веществ дольки при ежедневном поступлении мелатонина с питьевой водой в концентрации 4 мг/л в течение 2 или 4 недель в условиях естественного освещения или постоянного затемнения.
-
Исследовать количественное распределение CD1а-позитивных, CD3-позитивных клеток во всех зонах долек в тимусе мышей в моделируемых условиях эксперимента.
3. Определить особенности локализации и количественного
распределения CD57-позитивных и CD68-позитивных клеток во всех зонах долек в тимусе животных, получавших мелатонин в различных световых условиях в течение 2 или 4 недель.
-
Сравнить количество тучных клеток, степень их метахромазии и дегрануляции в соединительнотканных корковых перегородках и паренхиме тимуса мышей при поступлении мелатонина в течение 2 или 4 недель в условиях естественного освещения или постоянного затемнения.
-
Исследовать содержание биогенных аминов (гистамина, серотонина и катехоламинов) в структурах тимусной дольки лабораторных мышей в моделируемых условиях эксперимента.
Научная новизна
Впервые выявлено, что мелатонин, поступающий ежедневно с питьевой водой в концентрации 4 мг/л в течение 2 или 4 недель в условиях естественного освещения или постоянного затемнения, оказывает иммуномодулирующее действие на тимус, сопровождающееся уменьшением площади коркового вещества и увеличением площади мозгового вещества долек, увеличением количества макрофагов и натуральных киллеров в корковом и мозговом веществе долек тимуса. При этом изменения количественных показателей натуральных киллеров более выражены в тимусе мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения, а макрофагов – в тимусе мышей, находившихся в условиях естественного освещения.
Показано, что CD3-позитивные клетки чувствительны, а CD1а-позитивные клетки резистентны к ежедневному поступлению мелатонина в течение 2 или 4 недель в концентрации 4 мг/л независимо от условий освещения.
Установлено, что количество тучных клеток в соединительнотканных корковых перегородках и паренхиме тимуса под влиянием мелатонина возрастает, что сопровождается увеличением доли тучных клеток без признаков дегрануляции, и эти изменения более выражены в тимусе мышей, находившихся в условиях постоянной темноты.
7 Выявлено, что при поступлении мелатонина независимо от длительности и
условий освещения, происходит снижение содержания гистамина в
биоаминсодержащих клетках дольки, и эти изменения носят более выраженный
характер в тимусе мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения в
течение месяца. Содержание серотонина и катехоламинов в люминесцирующих
гранулярных клетках долек после 4 недель поступления мелатонина
увеличивается в тимусе мышей, находившихся в условиях естественного
освещения, и снижается – в тимусе мышей, находившихся в условиях
постоянного затемнения.
Впервые показано, что в условиях поступления экзогенного мелатонина большую чувствительность к характеру освещения проявляют в тимусе макрофаги, NK-клетки и тучные клетки, но не Т-лимфоциты.
Теоретическое и практическое значение
Результаты проведенных исследований – один из примеров эндокринной регуляции нейроиммунных взаимодействий в тимусе. Они демонстрируют ответную реакцию иммунокомпетентных клеток при непосредственном участии нейромедиаторных биогенных аминов на экзогенный мелатонин, что позволяет расширить представления о роли гормона в деятельности иммунной системы.
Выводы и научные положения диссертационной работы могут быть использованы в учебном процессе вузов медико-биологического профиля при изучении дисциплин «Гистология», «Иммунология», «Эндокринология».
Полученные результаты относятся к области фундаментальных исследований и расширяют представления о закономерностях нейрогуморального обеспечения иммунного гомеостаза. Это может быть учтено при создании методов моделирования иммунного ответа с применением гормонов, в частности мелатонина.
Реализация результатов исследования
Научные положения, выводы и фотоматериалы диссертационного исследования используются в учебном процессе ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И. Н. Ульянова», в работе бюджетного учреждения «Республиканская клиническая больница» МЗСР ЧР, автономного
8 учреждения Чувашской Республики «Институт усовершенствования врачей»
Степень достоверности и апробация результатов
Для обработки полученного в ходе эксперимента материала (гистологические препараты, цифровые данные) было использовано сертифицированное оборудование. Клеточные маркеры CD1a, CD3, CD57, CD68 широко используются в клинике. Достоверность полученных результатов в ходе исследования была обеспечена с помощью подбора адекватных иммуно-гистохимических и люминесцентно-гистохимических методов, последующей статистической обработки.
Основные научные положения, выводы и результаты доложены и обсуждены на 8-й Всероссийской научной конференции «Бабухинские чтения в Орле» (Москва, 2011), Всероссийском молодежном научного семинаре «Наука и инновации – 2012» (Йошкар-Ола, 2012), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Морфология в теории и практике», посвященной 90-летию со дня рождения Д. С. Гордон (Чебоксары, 2012), 86-й Всероссийской научной конференции памяти академика АН РТ, профессора И. Г. Салихова (Казань, 2012), XIX Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Дубай, 2012), V Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения – 2013» (Санкт-Петербург, 2013), Научно-практической конференции, посвященной 40-летию кафедры патофизиологии «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Чебоксары, 2014), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Современные проблемы естественно-научных исследований» (Чебоксары, 2014), 89-й Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых (Казань, 2015), Международной научно-практической конференции «Теоретические и прикладные проблемы современной науки и образования» (Курск, 2015).
Научные положения, выносимые на защиту:
1. Поступление мелатонина в организм лабораторных мышей в течение 2 или 4 недель в условиях естественного освещения или постоянного затемнения
9 приводит к снижению площади коркового вещества и увеличению площади
мозгового вещества долек тимуса. Одновременно наблюдается уменьшение
численности CD3-позитивных клеток и увеличение количества макрофагов,
натуральных киллеров в корковом веществе долек тимуса; уменьшение
количества CD3-позитивных клеток и увеличение количества макрофагов,
натуральных киллеров в мозговом веществе долек тимуса, что сопровождается
снижением содержания гистамина в люминесцирующих клетках долек и
увеличением количества тучных клеток без признаков дегрануляции в тимусе.
2. В условиях поступления экзогенного мелатонина большая зависимость от световых условий в тимусе проявляется в содержании макрофагов, тучных клеток и натуральных киллеров, но не Т-лимфоцитов.
Публикации
Основные положения диссертации отражены в 12 опубликованных работах, 8 из них (3 статьи и 5 публикаций с тезисами докладов) – в центральных периодических журналах и изданиях, рекомендованных ВАК РФ для защиты кандидатских и докторских диссертаций.
Структура и объем диссертации
Клеточный состав тимуса и нейромедиаторные биогенные амины
Внутренняя кортикальная зона. Эпителиальный остов внутренней кортикальной зоны представлен как светлыми, так и темными эпителиальными клетками, по своей ультраструктуре соответствующими III и IV типам по классификации Г. А. Галил-Оглы и соавт. (1988). Клеток-«нянек» в этой зоне нет. Темные клетки лежат ближе к мозговому веществу долек. Отростки клеток соединяются между собой и формируют широкопетлистую сеть, в ячейках которой находятся лимфоциты. При этом есть участки с относительно густой сетью эпителиальных клеток и участки, где эпителиальных клеток практически нет. Такие участки называют «резервуарами» для Т-лимфоцитов коркового вещества [171]. Эпителиальные клетки внутренней кортикальной зоны не содержат тимусных гормонов, слабо экспрессируют цитокератин и сильно экспрессируют антигены II класса МНС [18].
Большая часть лимфоцитов экспрессирует антигены CD2, CD7, CD1, CD4 и CD8 («двойные позитивные» CD4+ и CD8+), «двойные негативные» (CD4- и CD8-) лимфоциты, а также лимфоциты, характеристика которых сходна с характеристикой лимфоцитов субкапсулярной зоны, и зрелые лимфоциты с антигенами либо CD4 (Т-хелперы), либо CD8 (Т-киллеры). Эти зрелые лимфоциты в большинстве своем имеют хоминг-рецепторы для миграции в Т-зависимые зоны периферических лимфоидных органов [98, 212, 297, 316]. Такие рецепторы экспрессируются у 1 – 3% Т-лимфоцитов тимуса, причем 70% из них – это зрелые лимфоциты внутренней кортикальной и медуллярной зон долек.
Важной особенностью дифференцировки лимфоцитов в этой зоне является формирование у них Т-клеточного рецептора к антигену [108, 165].
Функциональное значение внутренней кортикальной зоны состоит в обеспечивании дифференцировки поступающих из субкапсулярной зоны ранних тимоцитов. Предполагается, что здесь происходит: 1) отбор и гибель аутоагрессивных Т-лимфоцитов; 2) отбор лимфоцитов, имеющих рецепторы к белкам MHC (позитивная селекция). Созревшие аутотолерантные лимфоциты либо мигрируют в области кортико-медуллярной границы, либо переходят в мозговое вещество [212]. Новые генерации лимфоцитов образуются в тимусе каждые 6 – 9 часов. В экспериментах на мышах показано, что в сутки в тимус поступает 0, 01% от общего числа всех ее лимфоцитов, «рождается» в ней 30%, подвергается элиминации в коре путем апоптоза 29% и эмигрирует 1% [143, 315]. Так как тимус не имеет самообновляющейся популяции гемопоэтических клеток, ввиду этого тимопоэз быстро угнетается из-за отсутствия притока новых клеток-предшественников. L. Calderon и T. Boehm (2011) обнаружили, что основным механизмом, обеспечивающим миграцию клеток в орган, является хемотаксис, который опосредуется через хемокиновые рецепторы Cсr9, Ccr7 и Cxcr4.
Макрофаги тимуса имеют костномозговое происхождение, одной из главных функций которых является элиминация поврежденных лимфоцитов. Макрофаги синтезируют IL-1, IL-6 и фактор некроза опухолей (ФНО), а также простагландины Е, ограничивающие процессы пролиферации в тимусе. Макрофаги тимуса представлены гетерогенной популяцей, которая отличается морфологически, фенотипически и по функциональным способностям. Иммунофенотипические исследования обнаруживают в тимусе ED1+ и ED2+ макрофаги. Первые являются активно фагоцитирующими, локализуются во всех зонах тимуса, демонстрируют высокую активность кислой фосфатазы и экспрессируют на поверхности антигены II класса МНС. Их функция сводится к утилизации лимфоцитов, погибающих в результате негативной селекции [335]. С другой стороны, эти клетки входят в систему гистосовместимости, могут презентировать тимоцитам антигены II класса МНС и, следовательно, принимать прямое участие в процессах позитивной и негативной селекции Т-лимфоцитов. ED2+ макрофаги являются нефагоцитирующими. Сигналом к пролиферативной активации Т-лимфоцитов является IL-1, который продуцируют макрофаги. Популяция ED2+ клеток может восполняться как за счет дифференцировки ED1+ клеток, так и за счет поступления циркулирующих моноцитов, которые мигрируют в тимус через посткапиллярные венулы и периваскулярные пространства [18]. Широко распространенным в гистологии маркером для выявления макрофагов является антиген CD68 [131, 259]. CD68 (макросиалин) – скавенджер-рецептор [272, 326], антиген клеток моноцитарно/макрофагальной линии, входит в семейство лизосом-ассоциированных мембранных гликопротеинов [114, 338].
Кортико-медуллярная зона. Кортико-медуллярная зона содержит клетки стромы костномозгового происхождения, в первую очередь дендритные клетки [128]. В данной зоне происходит выход лимфоцитов на периферию и в мозговое вещество. Дендритные клетки ответственны за Т-клеточную негативную селекцию [111, 249, 262]. Дендритные клетки представляют уникальную клеточную популяцию тимуса, которая экспрессирует молекулы МНС класса I и II в высоких концентрациях [224, 346]. Эти клетки обладают способностью захватывать, процессировать и презентировать ауто- и аллогенные антигены в контексте молекул МНС [181, 206, 249]. Кроме того, дендритные клетки продуцируют дополнительные сигналы, решающие в конечном итоге, подвергнется ли клетка клональной делеции или продолжит созревание [107].
Мозговое вещество долек. Мозговое вещество долек представлено густой сетью крупных эпителиальных клеток, образующих небольшие ячейки. Количество Т-лимфоцитов здесь меньше, чем в корковом веществе долек, но эта зона характеризуется большим числом клеток мезенхимального происхождения и наличием эпителиальных тимических телец (тельца Гассаля). Медуллярные эпителиальные клетки содержат тимусные гормоны, экспрессируют цитокератины, но не экспрессируют антигены МНС [18].
В мозговом веществе долек выявляются более крупные светлые эпителиальные клетки, формирующие тимические тельца. Клетки тимических телец, как и субкапсулярные, относятся к светлым, эктодермального генеза.
Согласно объединенной теории центральной иммунотолерантности, эпителиальные клетки телец Гассаля играют особую роль в поддержании иммунологического гомеостаза: презентируют тканеспецифические антигены для элиминации аутореактивных лимфоцитов, синтезируют хемокины, влияющие на миграцию лимфоцитов [14, 15, 16].
Применение мелатонина в клинической практике
В ходе проведения исследования были применены следующие методы окраски: 1) окраска срезов гематоксилином и эозином для проведения общегистологической характеристики структур тимуса [71]; 2) окраска полихромным толуидиновым синим по Унна – для контроля состояния тканевых мукополисахаридов и гепарина в тучных клетках [20, 26]. Голубую -ортохромную окраску гранул дает несульфатированный (незрелый) гепарин; -метахроматичную (чернильно-фиолетовую) – более сульфатированный (созревающий); -метахроматичную (пурпурную) – сульфатированный (зрелый) гепарин [26, 101].
1) метод Фалька-Хилларпа в модификации Е. М. Крохиной применялся для избирательного выявления катехоламинов и серотонина [52, 173]. Срезы исследуемых органов инкубировались в параформальдегидной камере в течение 60 минут при температуре 80оС. Метод основан на конденсации моноаминов с формальдегидом с образованием флуоресцирующих соединений, при котором происходит цепь химических реакций: сначала катехоламины превращаются в 6,7-диокси-1,2,3,4-тетраизогидрохинон и 4,5,6-триокси-тетрагидроизохинолин, которые в результате дегидрирования превращаются в 3,4-дигидроизохинолины. Кето-таутомеры продуктов реакции образуют люминесцирующий комплекс, дающий изумрудно-зеленую флюоресценцию при облучении видимым сине-фиолетовым светом. 3,4–дигидро––карболин, который в подобных реакциях образуется из серотонина, дает желтое свечение. Полученные препараты рассматривались под люминесцентным микроскопом ЛЮМАМ–4 с длиной волны возбуждающего света 360 нм. Интенсивность люминесценции катехоламинов и серотонина замерялась с одного поля зрения, но с использованием разных светофильтров.
2) метод Кросса, Эвена, Роста для выявления гистаминсодержащих структур [153]. Метод определения гистамина в тканях основан на реакции паров ортофталевого альдегида с гистамином, в ходе которой образуются флюоресцирующие производные имидазолилэтиламина. По мнению авторов данного метода, при исследовании срезов под люминесцентным микроскопом образующийся комплексный продукт дает при большом содержании лимонно желтое, при среднем – зеленное, при малом – голубое свечение. Срезы обрабатывались в предварительно разогретой камере парами ортофталевого альдегида в термостате при температуре 100оС в течение 10 секунд. Затем срезы при той же температуре на 2 минуты помещались в другую камеру, содержащую пары воды. Далее срезы высушивались в термостате при температуре 70оС в течение 5 минут. Полученные препараты рассматривались под люминесцентным микроскопом ЛЮМАМ–4А с длиной волны возбуждающего света 360 нм.
3) метод цитоспектрофлуориметрии для идентификации и количественного измерения содержания катехоламинов, серотонина и гистамина в исследуемых структурах тимуса [41]. Для этого на люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ–4 была установлена дополнительная насадка ФМЭЛ-1А с выходным напряжением 900 В. Для определения серотонина использовался светофильтр №8 с длиной волны 525 нм, для гистамина – №7 с длиной волны 515 нм и для катехоламинов – фильтр №6 с длиной волны 480 нм. Показания снимались с табло усилителя У-5 в условных единицах флюоресценции (у. е.). 2.4. Иммуногистохимические методы исследования 1) метод выявления CD57-позитивных клеток, 2) метод выявления CD68-позитивных клеток. Для проведения исследования были использованы anti-CD57 и anti-CD68 моноклональные антитела [228]. Исследование проводилось на базе
Республиканского центра МЗРТ «Современные технологии в морфологической диагностике» с применением МКАТ и реактивов согласно рекомендации фирмы изготовителя «Дако» (Дания). После фиксации в 10% растворе нейтрального формалина материал обезвоживали в этаноле постепенно возрастающей концентрации и заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм готовились на парафиновом ротаторном микротоме МПС-2 и после депарафинирования и регидратации в этаноле нисходящей концентрации срезы органов погружали в восстанавливающий цитратный буфер (pH 6,0). Затем проводили высокотемпературную обработку прогреванием на водяной бане при 90 – 95С в течении 30 минут с целью демаскировки искомых антигенов в тканях. После ингибирования эндогенной пероксидазы 3% раствором перекиси водорода на метаноле проводили иммуногистохимическую реакцию методом трехэтапного непрямого иммуноферментного анализа с использованием первичных моноклональных антител (МКАТ) к гликопротеину CD57 (Clone NK-1) и к антигенному маркеру CD68 (Clone KP1) в разведении 1:50 согласно рекомендации фирмы-изготовителя (Dako, Дания). Визуализацию связавшихся первичных МКАТ проводили стандартным биотин-стрептавидин-пероксидазным методом с использованием набора LSAB-2 (Labeled Streptavidin Biotin System Peroxidase) [48]. Для оценки специфичности иммунного окрашивания в каждом случае делали отрицательный контроль (обработка вместо первичных моноклональных антител контрольными антителами), результатом чего было отсутствие специфического иммунного окрашивания.
Иммуногистохимические методы исследования
Необходимо отметить, что нахождение двух контрольных групп мышей в условиях постоянного затемнения приводит к увеличению свечения гистамина в исследуемых клетках в 1,3 (p 0,001) по сравнению с контрольными животными, содержавшимися в условиях естественного освещения.
Поступление мелатонина в течение 2 недель в условиях естественного освещения приводит к снижению интенсивности люминесценции гистамина в ЛГК на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса мышей в 1,2 раза (p 0,05), а в условиях постоянного затемнения – в 1,3 раза (p 0,001). Более значительные изменения интенсивности свечения гистамина отмечаются в ЛГК на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса мышей, получавших мелатонин в течение месяца в условиях постоянного затемнения, где значения изучаемого параметра снижаются в 1,6 (p 0,001) по сравнению с мышами 4-й контрольной группы.
Таким образом, ЛГК тимуса, независимо от их расположения, реагируют на поступление мелатонина в различных световых условиях снижением интенсивности свечения в них гистамина. ЛГК дольки тимуса контрольных мышей на условия постоянного затемнения реагируют увеличением в них гистамина.
В лимфоцитах коркового и мозгового вещества дольки тимуса поступление мелатонина, независимо от сроков и условий освещения, приводит к снижению интенсивности свечения гистамина (Рисунки 23, 24). В лимфоцитах коркового вещества дольки тимуса мышей, получавших мелатонин в условиях естественного освещения, выявляется снижение интенсивности свечения гистамина в 2 раза (p 0,001) на сроке 2 недель эксперимента, в 1,7 раза – на 4-й неделе поступления гормона (p 0,001) по отношению к контрольным животным. У мышей, получавших гормон в условиях постоянного затемнения в течение 2 недель, наблюдается схожая картина, где уровень интенсивности свечения гистамина снизился в 1,7 раза (p 0,001) по сравнению со 2-й контрольной группой. Более выраженное снижение интенсивности люминесценции гистамина в лимфоцитах коркового вещества дольки выявляется на 4 неделе поступления гормона в условиях постоянного затемнения, где он достигает 3,90±0,38 усл. ед., что в 3 раза ниже (p 0,001), чем показатель контрольных мышей.
Двухнедельное введение гормона опытным мышам в различных условиях освещения снижает интенсивность люминесценции гистамина в лимфоцитах мозгового вещества дольки 1,7 раза (p 0,001), а четырехнедельное введение гормона в условиях затемнения – в 3 раза (p 0,001) по сравнению с контрольными животными. У мышей, получавших мелатонин в течение 4 недель в условиях естественного освещения, уровень интенсивности гистамина в лимфоцитах мозгового вещества дольки снизился до 4,60±0,27 усл. ед. против 6,00±0,40 усл. ед. у контрольных животных (p 0,05).
Необходимо отметить, что содержание контрольных животных в условиях постоянного затемнения приводит к увеличению интенсивности свечения гистамина в лимфоцитах мозгового вещества долек тимуса в 1,7 раза (срок эксперимента 2 недели, p 0,001) и в 1,5 раза (срок эксперимента 4 недели, p 0,001) по сравнению с экспериментальными мышами, находившимися в условиях естественного освещения, а в лимфоцитах коркового вещества долек тимуса 1,3 раза (p 0,001) соответственно.
Интенсивность люминесценции гистамина в лимфоцитах мозгового вещества долек тимуса экспериментальных мышей, усл. ед. – p 0,05, – p 0,001. Таким образом, поступление мелатонина в организм лабораторных мышей, независимо от сроков и условий освещения, приводит к снижению интенсивности свечения гистамина во всех содержащих его клетках дольки тимуса: ЛГК коркового вещества, ЛГК на границе коркового и мозгового вещества долек, лимфоцитах коркового и мозгового вещества долек.
Пребывание контрольных мышей в условиях постоянного затемнения отражается на гистаминсодержащих клетках тимуса (ЛГК коркового вещества, ЛГК на границе коркового и мозгового вещества долек, лимфоцитах коркового и мозгового вещества долек) противоположным образом: в них интенсивность свечения гистамина возрастает вне зависимости от длительности условий затемнения.
Люминесцентно-гистохимический метод Фалька-Хилларпа в модификации Е. М. Крохиной позволил выявить клетки, содержащие серотонин и катехоламины, в тимусе мышей опытных и контрольных групп. На границе коркового и мозгового вещества долек располагаются в один – два ряда люминесцирующие гранулярные клетки (ЛГК на границе коркового и мозгового вещества долек), которые окружают мозговое вещество долек тимуса непрерывным ободком (Рисунки 25, 26). Клетки имеют крупные размеры и полигональную форму, содержат желтовато-белые гранулы различной величины, содержащие катехоламины, серотонин [78]. По периферии коркового вещества долек тимуса видны небольшие беспорядочно располагающиеся люминесцирующие гранулярные клетки (ЛГК коркового вещества) с мелкими гранулами зеленовато-желтого свечения в цитоплазме (Рисунок 27, 28). Между ярко светящимися люминесцирующими гранулярными клетками тимуса располагаются лимфоциты коркового и мозгового вещества долек.
Морфофункциональная реакция биоаминсодержащих структур тимуса экспериментальных животных
Поступление мелатонина, независимо от длительности и условий освещения, приводит к уменьшению свечения гистамина в биоаминсодержащих клетках тимусной дольки, что наиболее выражено при постоянном затемнении. Факт снижения содержания гистамина указывает на ослабление его иммуносупрессорного действия на клетки тимуса. Основным источником гистамина в организме являются тучные клетки [324, 343]. Снижение содержания данного биоамина в иммунокомпетентных клетках тимуса мышей, получавших мелатонин в течение 2 или 4 недель в условиях различного освещения, может быть связано со снижением дегрануляции тучных клеток.
Пребывание контрольных мышей в условиях постоянного затемнения отражается на гистаминсодержащих клетках тимуса противоположным образом, то есть в них интенсивность свечения гистамина возрастает, что связано с усиленной дегрануляцией тучных клеток и выходом биогенного амина, что подтверждается в нашем исследовании.
Серотонин в большом количестве определяется в тимусе, особенно в макрофагах на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса [78]. Серотонин проявляет митогенное действие и регулирует пролиферативную активность эпителиальных, эндотелиальных и лимфоидных клеток [87]. Известно, что избыток серотонина свидетельствует об иммуносупрессии [2], высокие концентрации данного биоамина подавляют пролиферативную активность Т-лимфоцитов [83]. В работах Kut J. L. et al. (1992) и Young M. R. et al. (1993) показали дозозависимый эффект экзогенного серотонина: низкие дозы обеспечивали активирующее влияние на Т-лимфоциты, в то время как высокие концентрации подавляли функции клеток. Катехоламины обладают модулирующим действием на иммунную систему. Путем стимуляции адренорецепторов катехоламины оказывают воздействие на миграцию, циркуляцию и пролиферацию лимфоцитов, определяют синтез цитокинов и активность клеток лимфоидного ряда [37].
В нашем исследовании изменение содержания серотонина и катехоламинов в люминесцирующих гранулярных клетках на границе коркового и мозгового вещества, а также коркового вещества тимусной дольки носит однонаправленный характер, вектор которого зависит от длительности поступления гормона и световых условий, в которых содержались животные.
Однонаправленное изменение уровней свечения серотонина и катехоламинов в люминесцирующих структурах тимуса наблюдалось в серии экспериментов Сергеевой В. Е., Гордон Д. С. (1992) как реакция на введение асцитной опухоли и при хроническом введении АКТГ1-24 [62].
В нашем исследовании однонаправленность изменений свечения серотонина и катехоламинов в люминесцирующих гранулярных клетках тимуса также подтверждается установившимися прямыми сильными корреляционным связями между интенсивностью свечения данных биоаминов.
Показатели интенсивности люминесценции серотонина в люминесцирующих гранулярных клетках долек в 2-3 раза выше, чем в лимфоцитах коркового и мозгового вещества долек тимуса, как у контрольных, так и у опытных мышей, что свидетельствует о том, что при поступлении мелатонина у люминесцирующих гранулярных клеток сохраняется функция депонирования этого нейромедиаторного биогенного амина.
Поступление мелатонина в течение 4 недель в условиях естественного освещения приводит к увеличению люминесценции серотонина и катехоламинов в люминесцирующих гранулярных клетках коркового вещества и на границе коркового и мозгового вещества дольки, а поступление в условиях постоянного затемнения – к снижению свечения данных биоаминов.
Известно, что при нехватке гистамина, последний может замещаться серотонином [155], чем также может обусловливаться повышение уровня свечения серотонина в гранулярных люминесцирующих клетках коркового вещества и на границе коркового и мозгового вещества дольки мышей, получавших мелатонин в условиях естественного освещения в течение 4 недель.
В лимфоцитах мозгового вещества, гранулярных люминесцирующих клетках коркового вещества и на границе коркового и мозгового вещества дольки мышей, получавших мелатонин в течение 4 недель в условиях естественного освещения, регистрируется сопряженное с серотонином увеличение свечения катехоламинов. Повышение обеспеченности структур тимуса катехоламинами можно рассматривать как стимуляцию иммунных процессов, так как известно, что катехоламины способны усиливать пролиферативную активность лимфоцитов [83].
Наблюдаемое в нашем исследовании снижение свечения серотонина и катехоламинов в гранулярных люминесцирующих клетках коркового вещества и гранулярных люминесцирующих клетках на границе коркового и мозгового вещества дольки мышей, получавших мелатонин в течение 4 недель в условиях постоянного затемнения, возможно, связано с постепенным снижением функции аминопродукции люминесцирующими клетками или повышенной утилизацией серотонина клетками-продуцентами экстрапинеального мелатонина (тучные клетки, натуральные киллеры), количество которых значительно больше в тимусе мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения, по сравнению с количеством данных клеток в тимусе мышей, находившихся в условиях естественного освещения.
Результаты, полученные в ходе эксперимента, показывают, что изменение условий светового режима оказывает влияние на иммунные клетки тимуса по-разному. В условиях поступления экзогенного мелатонина характер световых условий оказывает более выраженное действие на клетки тимуса, ответственные за осуществление реакций врожденного иммунитета (макрофаги, натуральные киллеры, тучные клетки), чем на клетки, отвечающие за формирование адаптивного иммунитета (CD1а- и CD3-позитивные клетки).
Как известно, основной мишенью мелатонина являются Т-лимфоциты, которые проявляют зависимость от гормона в большей степени, нежели В-лимфоциты, макрофаги. Предполагается, что различные клетки иммунной системы имеют разные нейроэндокринные синхронизаторы [58]. Этим может объясняться большая степень влияния световых условий на макрофаги, натуральные киллеры и тучные клетки, чем на Т-лимфоциты, биоритмы которых находятся в четкой зависимости от экзогенного мелатонина. И мы это продемонстрировали.