Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Понятие о нейроиммуноэндокринной системе и нейромедиаторах 11
1.1.1. Метаболизм катехоламинов 11
1.1.2. Метаболизм серотонина 14
1.1.3. Метаболизм гистамина 18
1.2. Морфо-физиологические особенности тимуса 19
1.2.1. Развитие и топография 19
1.2.2. Иннервация и кровоснабжение 30
1.2.3. Биоаминсодержащие структуры тимуса 32
1.3. Метаболизм хорионического гонадотропина 34
1.3.1. Физиологическая роль хорионического гонадотропина 34
1.3.2. Хорионический гонадотропин в медицинской практике 35
1.3.3. Иммунотропные эффекты гонадотропина 37
Глава 2. Материал и методы исследования 40
2.1. Материал исследования 40
2.2. Методы исследования 41
ГЛАВА 3. Собственные исследования 47
Структурно-функциональное состояние тимуса лабораторных мышей при введении хорионического гонадотропина 47
3.1. Морфологическая характеристика тимуса 47
3.2. Характеристика тучных клеток тимуса 50
3.3. Нейроаминсодержащие структуры тимуса 55
3.3.1. Катехоламинсодержащие структуры тимуса 55
3.3.2. Серотонинсодержащие структуры тимуса 62
3.3.3. Гистаминсодержащие структуры тимуса 66
3.3.4. Взаимоотношение содержания нейроаминов (КА, СТ, Г) в структурах тимуса мышей при воздействии ХГ з
3.4. Иммуногистохимия тимуса 82
3.4.1. СБ4-позитивные клетки тимуса 82
3.4.2. СБ8-позитивные клетки тимуса 84
3.4.3. Клеточная пролиферация в морфофункциональных зонах долек тимуса мышей 87
3.4.4. Иммуногистохимическая реакция на bcl-2 в морфофункциональных зонах долек тимуса мышей 90
3.4.5. Иммуногистохимическая реакция на р-53 в морфофункциональных зонах долек тимуса мышей 93
Обсуждение результатов исследования 98
Заключение 109
Выводы 111
Рекомендации 113
Список сокращений 114
Список литературы 115
Список иллюстративного материала
- Метаболизм серотонина
- Хорионический гонадотропин в медицинской практике
- Характеристика тучных клеток тимуса
- Иммуногистохимическая реакция на bcl-2 в морфофункциональных зонах долек тимуса мышей
Введение к работе
Актуальность
Изучение роли гормонов и иммунологических факторов при физиологических и патологических состояниях организма в последние годы приобретает большую актуальность, обусловленную большим количеством клинических проблем, связанных с нарушением гуморальной регуляции функционирования различных органов и тканей, а также недостаточным изучением этих процессов (Кветной И. М. и соавт., 2005; Пальцев М. А. и соавт., 2006; КорневаЕ. А. и соавт., 2012).
Несмотря на широкое применение хорионического гонадотропина (ХГ) в медицине, остаются малоизученными вопросы воздействия гормонов на функционирование клеток иммунной системы, процессы пролиферации и дифференцировки иммунокомпетентных клеток (Kuklina Е. М. et al., 2003).
В рамках этой проблемы несомненный интерес представляют вопросы состояния центрального органа иммунитета - тимуса - при введении хорионического гонадотропина, так как возможное влияние этого гормона на стуктурно-функциональные характеристики тимуса практически не исследованы. Для клиницистов важно знать закономерности, лежащие в основе иммунологических изменений в тимусе при действии ХГ, так как это может помочь при решении конкретных клинических задач. Хорионический гонадотропин обеспечивает формирование иммунологической толерантности при беременности, увеличивает процент CD3+ CD4+ Т-лимфоцитов в культуре клеток (Куклина Е.М., 2003; Ширшев С. В., Заморина С. А., 2011; 2013), способствует увеличению количества натуральных киллеров в культуре ткани (Заморина С. А., 2010), способствует созреванию и увеличению количества тучных клеток в печени (Солопаева И. М., 2010), однако его эффекты на различные клеточные типы тимуса мало исследованы. Это очень важно и в связи с тем, что на мембране лимфоцитов найдены рецепторы помимо ХГ и к половым гормонам, в том числе к эстрогенам (Кветной И. М, 2005).
Известно, что в тимусе происходит пролиферация, дифференцировка и апоптоз клеток, однако гуморальная регуляция этих процессов при введении хорионического гонадотропина мало изучена. В создании микроокружения Т-лимфоцитов тимуса значительная роль принадлежит макрофагам, дендритным и тучным клеткам, а также адренергическим нервным волокнам. Вместе с тем мы пока мало что знаем о том, как изменяются различные характеристики этих клеток и структур, например при наступлении беременности в условиях повышенной секреции ХГ. Известна, большая роль катехоламинов, серотонина и гистамина в регуляции разнообразных функций тимуса (Гордон Д. С, Сергеева В. Е., 1992; Сарилова И. Л., Сергеева В. Е., 2012). Ведущую роль в продукции нейроаминов занимают люминесцирующие гранулярные клетки между корковым и мозговым веществом, в накоплении - люминесцирующие гранулярные клетки
коркового вещества (Гордон Д. С. и соавт., 1982; Гурьянова Е. А., 2011), однако остаются неизученными вопросы содержания нейроаминов в структурах тимуса при длительном введении ХГ, механизмы их влияния на процессы пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток различных органов иммунной защиты.
Несмотря на то, что хорошо известны эффекты различных нейромедиаторов в регуляции иммунных реакций, возможная роль влияния ХГ на их секрецию различными клетками тимуса практически не исследована (Девойно Л. В., 1983; Идова Г. В., 2004).
Беременность сопровождается изменением содержания множества гормонов в организме, в том числе хорионического гонадотропина, поэтому ряд исследований посвящен вопросам состояния тимуса при беременности, (Олангин О. И., 2000; Fukayama М. et al., 1990; Bansal A. S. et al., 2012), однако в данных работах были исследованы в основном морфологические изменения в этом органе. В связи с этим комплексное изучение влияния хорионического гонадотропина на сроках 1, 2, 3, 4 недели на тимус представляется важным и актуальным в практическом и теоретическом аспектах.
Цель работы - изучение морфологической характеристики тимуса лабораторных мышей при введении хорионического гонадотропина через 1, 2, 3 и 4 недели.
Задачи исследования:
-
Изучить морфометрические изменения дольки тимуса лабораторных мышей, процессы пролиферации и апоптоза при внутримышечном введении хорионического гонадотропина в дозе 2 Международные единицы (МЕ)/животное 2 раза в неделю через 1, 2, 3 и 4 недели.
-
Сравнить количество и степень дегрануляции тучных клеток в тимусе, обеспеченность их биогенными аминами и кислыми мукополисахаридами при введении хорионического гонадотропина через 1, 2, 3, 4 недели.
-
Изучить распределение катехоламинов, серотонина и гистамина в биоаминосодержащих клетках коркового и мозгового вещества долек тимуса, адренергических нервах при введении хорионического гонадотропина через 1, 2, 3, 4 недели.
-
Исследовать количественное распределение CD4- и CD8-позитивных клеток в различных зонах дольки тимуса у лабораторных мышей при введении хорионического гонадотропина через 1, 2, 3, 4 недели.
5. Сравнить экспрессию белков-маркеров пролиферации (Ki-67),
апоптоза (р-53), а также антиапоптотического белка (bcl-2) в клетках тимуса
при введении хорионического гонадотропина через 1, 2, 3, 4 недели от
момента введения.
Научная новизна
Впервые при введении хорионического гонадотропина через 1, 2, 3, 4 недели воздействия показаны микроморфологические особенности долек тимуса (увеличение площади мозгового вещества долек тимуса), а также
увеличение количества тучных клеток в поле зрения, сопровождающееся усилением степени их метахромазии и дегрануляции у лабораторных мышей.
Нами выявлено, что введение хорионического гонадотропина в течение 4-х недель сопровождается увеличением интенсивности люминесценции гистамина в содержащих его клетках и уменьшение интенсивности люминесценции катехоламинов и серотонина в нейроаминосодержащих клетках и адренергических нервах, причем эти изменения имеют разнонаправленный характер.
Приоритетными являются данные о процессах дифференцировки Т-лимфоцитов (увеличении количества CD4+ - маркера Т-лимфоцитов-хелперов и CD8+ - маркера Т-лимфоцитов-киллеров клеток тимуса) под воздействием ХГ в течение 1, 2, 3, 4 недель.
Впервые показано, что введение хорионического гонадотропина в течение 1, 2, 3, 4 недель приводит к снижению пролиферативных процессов (Ki-67 - маркеров клеточной пролиферации) в корковом веществе долек тимуса мышей и запускает процессы дифференцировки клеток, о чем свидетельствует увеличение количества CD4+ и CD8+ клеток и экспрессия в клетках белка апоптоза р-53.
Теоретическое и практическое значение
Научные положения и выводы диссертационного исследования существенно расширяют представления о механизмах иммуномодулирующего действия хорионического гонадотропина и дополняют современные данные о состоянии структурно-функционального статуса тимуса лабораторных мышей в зависимости от сроков гормонального воздействия.
Результаты и практические рекомендации диссертационного исследования применяются в учебном процессе и могут быть использованы при написании учебных пособий по клеточной биологии, цитологии, гистологии, иммуноморфологии, а также при написании монографий по теоретической и репродуктивной медицине.
Особенный интерес эти данные представляют для врачей иммунологов, эндокринологов и гинекологов.
Реализация результатов исследований
Научные разработки и положения диссертационных исследований используются в учебном процессе ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И. Н. Ульянова», в работе бюджетного учреждения «Президентский перинатальный центр» Министерства здравоохранения и социального развития Чувашской Республики, бюджетного учреждения «Городская клиническая больница №1» Министерства здравоохранения и социального развития Чувашской Республики, АУ Чувашии «Институт усовершенствования врачей» Минздравсоцразвития Чувашии на кафедре терапии и семейной медицины.
Степень достоверности и апробация работы
Выбранная модель введения в организм хорионического гонадотропина соответствует поставленной цели диссертационного исследования. Для
получения экспериментального материала (гистопрепаратов, цифровых данных) использовалось сертифицированное оборудование. Примененные иммуногистохимические маркеры Ki-67, bcl-2, р-53 широко используются для оценки процессов апоптоза и пролиферации в тканях. Достоверность результатов проведенных экспериментов обеспечивалась адекватным подбором люминесцентно-гистохимических, иммуногистохимических методов исследования, а также использованием методов параметрической и непараметрической статистики для обработки полученного цифрового массива.
Основные научные положения, выводы и результаты работы доложены и обсуждены: на 44-й научной студенческой конференции (Чебоксары, 9-10 апреля 2010); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 80-летию факультета естествознания и дизайна среды (Чебоксары, 23 мая 2011); Всероссийской научной конференции с международным участием «Морфология в теории и практике» (Чебоксары, 22 ноября 2012); 86-й Всероссийской студенческой научной конференции памяти чл.-корр. АН РТ, проф. И. Г. Салихова (Казань, 23-24 апреля 2012); XIX Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммуннореабилитации (Нью-Йорк, 2012); XIX Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (ОАЭ, Дубай, 11-15 октября 2013); XVII заочной научной конференции Research Journal of International Studies (Екатеринбург, 2013); V Международном молодежном медицинском конгрессе (Санкт-Петербург, 4-6 декабря 2013); научно-практической конференции «Современные проблемы естественнонаучных исследований» (Чебоксары, 20 мая 2014); Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Чебоксары, 26 сентября 2014); Международной научно-практической конференции «Теоретические и прикладные проблемы современной науки и образования» (Курск, 27-28 марта 2015); расширенных заседаниях, кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И. Н. Ульянова» (Чебоксары, 16 октября 2014, 22 мая 2015).
Научные положения, выносимые на защиту:
-
Введение хорионического гонадотропина мышам на разных сроках приводит к увеличению количества и степени дегрануляции тучных клеток в тимусе, обеспеченности их биогенными аминами и кислыми мукополисахаридами, увеличению CD4+ и CD8+ клеток долек тимуса, при этом наряду с увеличением количества клеток, экспрессирующих белки-регуляторы апоптоза, происходит уменьшение количества клеток, экспрессирующих белок пролиферации.
-
Морфологические изменения в корковом и мозговом веществе долек тимуса на различных сроках от 1 до 4 недель воздействия хорионического гонадотропина сопровождаются увеличением содержания гистамина в
люминесцирующих клетках долек тимуса и уменьшением содержания катехоламинов и серотонина в биоаминосодержащих клетках и адренергических нервах, причем эти изменения имеют разнонаправленный характер в распределении между гистамином, с одной стороны, и катехоламинами, серотонином - с другой.
Публикации
Основные положения диссертационной работы отражены в 14 опубликованных работах, 7 из них (4 статьи и 3 публикации с тезисами докладов конференций) - в центральных периодических журналах «Аллергология и иммунология», «Фундаментальные исследования», «Международный научно-исследовательский журнал», «Вестник Чувашского университета», которые входят в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, определенных ВАК России.
Структура и объем диссертации
Метаболизм серотонина
Серотонин (5-окситриптамин) принадлежит к группе индолалкиламинов и образуется в результате биотрансформации триптофана с помощью фермента триптофан-5-гидроксилазы в специализированных клетках желудочно-кишечного тракта, костного мозга, центральной нервной системы [71]. Накопление медиатора происходит в энтерохромаффинных клетках, тромбоцитах, тучных клетках. Серотонин выполняет ведущую роль в иммунологических процессах, происходящих в организме, на уровне центральной нервной системы, и является иммуномо-дулятором [63]. Рецепторы к серотонину разделяются на виды: М-, D-, Т-рецепторы. В последние годы выделены подтипы серотониновых Т-рецепторов: 5-НТ-, 5-HTi-, 5-НТ2-. При активации серотонинергической системы биоамин соединяется с рецептором, расположенным на мембране, что приводит к активации синтеза цГМФ через внутриклеточный механизм. Инактивация серотонина осуществляется ферментативным путем при помощи фермента моноаминооксидазы и неферментативными путями при соединении его с фосфолипидами и мукополи-сахаридами, а также с помощью обратного поглощения его пресинаптической мембраной [35]. Фермент моноаминоксидаза, обеспечивающий инактивацию большей части серотонина, локализуется на внешних мембранах митохондрий и катализирует реакцию окисления серотонина в 5-оксииндолальдегид с освобождением аммиака. В метаболизме серотонина принимают участие цитохром С и цитохромоксидаза, церуллоплазмин. Промежуточным продуктом обмена серото-нина является мелатонин [71, 146].
Серотонин проникает в геном, депрессирует строго определенные участки ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), стимулируя их кодировать синтез веществ, пригодных играть роль настоящего носителя именно этого амина. Наличие серотонина в ядрах лимфоцитоподобных предшественников и в ядрах малых саф-ранинофильных зернистых тучных клеток зарегистрировано гистохимической ар-гентаффинной реакцией Массона-Фонтаны на серотонин и в люминесцентно-гистохимической реакции Фалька на моноамины [36, 95, 142].
При изучении свойств серотонина выявлен широкий спектр воздействий на иммунологические процессы [35, 57]. В результате экспериментов обнаружено, что амин оказывает влияние на активность структур тимуса, вызывая в малых дозах пролиферацию лимфоцитов в мозговом веществе тимусных долек, увеличивает число телец Гассаля, способствует появлению плазматических клеток в преме-дуллярной зоне. Серотонин вытесняет норадреналин из тканевых резервов, что показывает конкурентные взаимоотношения медиторов, подавляет захват норад-реналина нервными окончаниями и кровяными пластинками. При контакте организма с антигеном серотонин вызывает угнетение первичного иммунного ответа, нарушение формирования иммунной памяти, уменьшение числа иммунокомпе-тентных клеток в тканях и органах. В экспериментах с трансплантацией сердца доказана супрессия иммунного ответа при введении предшественника серотонина - 5-окситриптамина. Аналогичные изменения под влиянием серотонина происходят в функционировании антителообразующие клетки. Серотонин оказывает стимулирующее влияние на NK-клетки (натуральные киллеры) у старых крыс-самок. В развитии аллергического статуса организма лежит недостаточность се-ротонинпродуцирующей функции клеток диффузной эндокринной системы в им-мунокомпетентных органах. В. Е. Сергеева, Д. С. Гордон (1992), изучая серото-нинсодержащие клетки в тимусе, пришли к выводу, что люминесцирующие гранулярные клетки, обнаруженные при помощи люминесцентно-гистохимической методики, выявляющей серотонин, относятся к клеткам диффузной эндокринной системы и некоторая их часть обладает свойствами макрофагов. В тимусе фракционным центрифугированием с помощью моноклональных антител к мелатони-ну выделены клетки диффузной эндокринной системы [71].
При антигенных воздействиях в организме резко угнетается серотонинпро-дуцирующая активность клеток в органах иммунитета. В ходе первичного иммунного ответа и в тимусе, и в селезенке снижалось среднее количество клеток, содержащих серотонин. При вторичном иммунном ответе количество серотонин-содержащих клеток вновь возрастало, причем в тимусе такое увеличение даже превышало исходные показатели. При вторичном иммунном ответе, когда возникает необходимость ограничения иммунной реакции, количество клеток, продуцирующих соматотропный гормон, снижается, а количество мелатонинпродуци-рующих апудоцитов возрастает [71].
Известно, что серотонин способен подавлять развитие иммунного ответа за счет избирательной активации Т- и В-лимфоцитов. В тимусе они находятся, по мнению Н. Т. Райхлина с соавт. (1993), в мозговой зоне дольки, где сосредоточена основная масса серотонинпродуцирующих клеток.
В тимусе выявлены клетки, иммунореактивные к серотонину, мелатонину, соматотропному гормону [9, 71, 142, 182].
В плазме иммунизацированных растворимым антигеном крыс при повторном контакте в течение 30 минут с антигеном в плазме выявлено повышенное содержание серотонина в плазме. Отмечены биохимические и морфологические сдвиги с ранних минут антигенных воздействий. Уровень серотонина в плазме возрастает в несколько раз уже через минуту после введения антигена, возвращаясь к норме в течение последующих 4-5 минут. Наблюдаются изменения в клетках, депонирующих серотонин. Введение сенсибилизированным крысам антигена вызывает изменения в перитонеальных тучных клетках, являющихся депо серотонина. Изменения при антигенных воздействиях имеют сходства с реакциями, возникающими при истощении запасов серотонина [46].
Снижение уровня активности серотонинергической системы в центральной нервной системе, как и введение агонистов дофамина, вызывает стимуляцию им 17 муногенеза у крыс. Стимуляция иммунологических процессов - является дофа-минзависимой и осуществляется через тимус, угнетение иммуногенеза серотони-ном осуществляется через надпочечники [46, 80, 81].
При введении ингибиторов моноаминооксидазы повышается уровень серо-тонина в центральной нервной системе, от чего падает свободная диффузия серо-тонина и увеличивается содержание серотонина в пулах. Снижение синтеза серо-тонина связано с активацией дофаминергической системы. [83].
Серотонин реализует свое иммунодепрессивное действие через систему гипоталамус-гипофиз-надпочечники. В экспериментах с адреналэктомией установлена стимуляция иммуногенеза, которая связана с активацией миграции стволовых клеток из костного мозга и усилением функции Т-хелперов. Изучение в динамике серотонинобеспеченности при физиологической беременности у мышей показало преобладание серотонина в отличие от катехоламинов в люминесци-рующих гранулярных клетках коркового и мозгового вещества долек тимуса [107]. Изучение распределения серотонина в тимусе выявило наличие высоких концентраций амина в тучных клетках и очень низкие концентрации его в микроокружении тучных клеток [19].
Хорионический гонадотропин в медицинской практике
Окраска гематоксилином и эозином применялась для общей гистологи ческой характеристики структур тимуса [99, 126].
Линейные морфометрические измерения морфофункциональных зон тимуса, измерения площадей коркового и мозгового вещества долек, а также количественные морфометрические измерения интенсивности мембранных и цито-плазматических иммуногистохимических реакций выполнены с применением демо-версии программы «Sigma Scan Pro 5.0».
Для контроля состояния кислых мукополисахаридов в тучных клетках тимуса, а также определения степени их дегрануляции срезы окрашивались по-лихромным толуидиновым синим по Унна [56, 114].
Люминесцентно-гистохимический метод Фалька-Хилларпа в модификации Е. М. Крохиной [83, 85, 102, 220]. Этот метод применяется для выявления в структурах тимуса биогенных аминов: катехоламинов и серотонина. Срезы тимуса инкубировались в камере в парах формальдегида в течение 60 минут при температуре 80 градусов. Люминесцентный метод основан на реакции моноаминов с формальдегидом, в ходе которой образуются флуоресцирующие соединения. При этом происходит цепь химических реакций, в результате которых с начала катехоламины превращаются в 6,7-диокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин и 4,6,7-триокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин, а затем в процессе дегидрогенизации из них образуются флуоресцирующие соединения -3,4-дигидроизохинолины. При просматривании препаратов под люминесцентным микроскопом с использованием запирающегося фильтра низкие концентрации флуоресцирующих соединений визуализируются изумрудно-зеленым цветом, высокие - желтым цветом. Карболины, которые в данных реакциях образуется из серотонина, дают желтое свечение. При проведении модифицированной лю-минесцентно-гистохимической методики высушивание срезов осуществлялось в воздушной среде, что исключало деструкцию тканей. Микроскопия препаратов тимуса производилась под люминесцентным микроскопом ЛЮМАМ-4 с длиной света 360 нм.
Люминесцентно-гистохимический метод Кросса, Эвена, Роста [102, 216]. Данный метод применяется для выявления клеток, содержащих гистамин.
Для выражения количественных уровней катехоламинов, серотонина и гистамина в микроструктурах тимуса использовался метод цитоспектрофлуори метрии [68, 82]. Анализ проводился с помощью люминесцентной фотометриче ской насадки ФМЭЛ-1А с выходным напряжением 900 В. Ультрафиолетовые лучи проходили через специальное отверстие - зонд диаметром 0,5 мм и попадал на изучаемые структуры препарата. Обратной ток света направлялся на интер ференционный фильтр с конкретной длиной волны. Для выявления интенсивно сти люминесценции катехоламинов использовался фильтр № 6, имеющий длину волны 480 нм, свечение серотонина идентифицировалось с помощью свето фильтра № 8, имеющего длину волны 525 нм. Интенсивность люминесценции регистрировалась в условных единицах по шкале усиливающего прибора с со противлением 1,5x10 Ом.
Интенсивность люминесценции нейроаминов измерялась в следующих структурах: ЛГК на границе коркового и мозгового вещества, ЛГК коркового вещества, в лимфоцитах коркового и мозгового вещества долек тимуса, тучных клетках и в варикозных расширениях адренергических нервных волокон.
Для получения представления об интенсивности синтеза, распада или задержки серотонина в клетках использовался серотониновый индекс (соотношение серотонина и катехоламинов). Когда значение серотонинового индекса больше 1, можно говорить о преобладании в клетке серотонина. При значении серотонинового индекса меньше 1 преобладают катехоламины [10, 93]. . Корреляционный анализ. Коэффициент корреляции показывал законо мерности распределения аминов в микроструктурах тимуса. Подсчитаны абсо лютные значения коэффициента корреляции: при значении коэффициента мень ше 0,3, то связь в паре слабая; 0,31 - 0,69 - умеренная; 0,70-1,0 - связь в паре сильная [84, 174]. Отрицательные корреляции указывают на то, что одна клетка отдает медиатор другой клетке; положительные корреляции говорят об одно временном получении вещества обеими структурами из внешнего источника [167, 168]. Коэффициент корреляции высчитывается по следующей формуле: к =ух-ух= ( - ) (/-/) (1) ХУ а у л/1 - )2-1(/-/)2 где к - коэффициент корреляции, х и у - сопоставляемые величины, х и у среднее арифметическое соответствующей величины. 7. Иммуногистохимический метод для выявления СБ4-клеток [292]. 8. Иммуногистохимический метод для выявления СБ8-клеток [266]. Срезы обрабатывались по стандартному протоколу: сначала подавлялась пероксидазная активность путем инкубации срезов в 3% растворе Н202в течение 30 мин с последующей промывкой 0,1М фосфатным буфером. Для блока неспецифического связывания срезы выдерживались в течение 60 минут в 10% козьей сыворотке, после чего к ним были добавлены первые антитела к белкам CD4, CD8 на 18 ч при температуре 4 С. В качестве вторых антител были использованы антивидовые антииммуноглобулиновые биотилированные антитела. С целью выявления биотиновой метки срезы обрабатывались авидин-пероксидазным соединением. Метод основан на высоком сродстве авидина к биотину. Перокси-дазную активность проявляли в инкубационной среде с диаминобензидином. В результате ферментативной реакции субстрат превращался в нерастворимый продукт коричневого цвета, совпадающий по локализации с местонахождением белков в конкретных реакциях. Препараты анализировались под световым микроскопом Микмед. Произведен подсчет CD4- и СБ8-позитивных клеток в 10 по 44 лях зрения. Статистическая обработка данных производилась с применением критерия Стъюдента.
Иммуногистохимические методы для выявления CD8+ и CD4+ были проведены в лаборатории на базе патологоанатомического отделения ГАУЗ «Республиканская клиническая больница Министерства здравоохранения Республики Татарстан».
Иммуногистохимические исследования для выявления Ki-67, bcl-2 и р-53 проводили в соответствии со стандартными протоколами на базе патологоанатомического отделения БУ «Республиканский клинический онкологический диспансер» Минздравсоцразвития Чувашской Республики. Срезы тимуса толщиной 3 мкм наносили на предметные стекла, обработанные L-polysine, которые высушивали при комнатной температуре в течение суток. Окрашивание проводили ручным и аппаратным способами с использованием иммуногистохимиче-ских автоконтейнеров AUTOSTAINER-360 (THERMO, Великобритания) и Leica BOND-MAX (Германия).
Характеристика тучных клеток тимуса
Через 1 неделю после введения ХГ у мышей опытной группы, по сравнению с интактной группой, наблюдается увеличение числа пролиферирующих клеток в корковом веществе в 1,3 раза (р 0,001), в мозговом веществе - в 1,4 раза (р 0,05). После двух недель введения ХГ экспрессия Кі-67 в мозговом веществе долек тимуса мышей обеих групп сопоставима, а в корковом веществе происходит статистически значимое ее уменьшение под воздействием гормона. Обращает на себя внимание тот факт, что в последующие две недели введения ХГ количество экспрессирующих Ki-67 клеток заметно снижается в обеих структурно-функциональных зонах, причем в большей степени это снижение выражено в корковом веществе долек тимуса (Таблица 8).
Таким образом, введение хорионического гонадотропина обуславливает снижение пролиферативной активности клеток, как в корковом так и в мозговом веществах долек тимуса, за исключением 1- недельного срока эксперимента. Поступление ХГ в течение 2, 3, 4 недель приводит к снижению экспрессии белка Ki-67 клетками мозгового и коркового вещества долек тимуса мышей, что влияет на процессы дифференцировки Т-лимфоцитов.
Иммуногистохимическая реакция с использованием антител к белку-супрессору апоптоза bcl-2 позволила нам выявить в дольках тимуса клетки, экс-прессирующие этот белок. Известно, что антиапоптотический белок bcl-2 локализуется на мембранах. Экспрессия этого белка возрастает при высокой интенсивности клеточного деления. Клетки, экспрессирующие белок bcl-2, овальной формы, располагаются скоплениями в корковом веществе долек тимуса. Цитоплазма-тическая их мембрана и цитоплазма окрашиваются в коричневый цвет с разной степенью интенсивности (Рисунок 27). Корковое вещество доли
Тимус мышей. Вс1-2- позитивные клетки в корковом и мозговом веществах долек тимус, ув. Х400. Микроскоп Leica DM4000B. У интактных животных мышей в тимусе нами отмечены различия в экспрессии белка bcl-2 в различных морфофункциональных зонах: в корковом веществе обнаруживается 6,2±1,3 клетки в поле зрения (при увеличении х400), в то время как в мозговом веществе долек тимуса они нами не выявлены. При введении ХГ в течение 1 недели количество этих клеток возрастает до 7,3±0,6 штук в поле зрения. Максимальное число изучаемых клеток фиксируется на 2-недельном сроке введения ХГ и составляет 9,1 ±0,5 штук в поле зрения. В последующем количество клеток, экспрессирующих белок bcl-2, возвращается к исходному уровню и составляет 6,1±0,4 и 6,2±0,3 клеток в поле зрения для сроков введения ХГ 3 и 4 недели соответственно. В мозговом веществе долек тимуса выявляются единичные bcl-2- позитивные клетки при введении ХГ в течении 3 недель.
Таким образом, введение хорионического гонадотропина стимулирует экспрессию белка-супрессора апоптоза bcl-2 как в структурах коркового, так и мозгового вещества долек тимуса мышей. Иммуногистохимическая реакция на р-53 в морфофункциональных зонах долек тимуса мышей
Ядерный белок р-53 осуществляет контроль за состоянием ДНК, появление этого белка в гистологических препаратах указывает на запуск апоптоза. Иммуногистохимическая реакция с использованием антител к маркеру апоптоза белку р-53 позволила нам выявить клетки с коричневой окраской цитоплазмы и цито-плазматической мембраны разной степени интенсивности. Экспрессия белка апоптоза р-53 имеет различия в корковом и мозговом веществах долек тимуса (Рисунок 28). Количество р-53 клеток неодинаково в тимусе экспериментальных мышей (Таблица 9). Таблица 9 - Количество р-53 клеток в поле зрения в морфофункциональных зонах долек тимуса экспериментальных мышей
Количество р-53 в корковом веществе долек тимуса, ед. в п. зр. Количество р-53 в мозговом веществе долек тимуса, ед. в п. зр.
В корковом веществе у интактных животных количество клеток, экспрес-сирующих белок р-53, составляет 3,8±0,3 штук в поле зрения (при увеличении х400). Через одну неделю после введения ХГ количество р-53 позитивных клеток незначительно снижается до 3,6±0,5 штук в поле зрения. Через две недели воздействия количество клеток, экспрессирующих р-53, резко увеличивается, достигая до 12,0±0,9 штук в поле зрения. Эта тенденция сохраняется через три и четыре недели поступления ХГ (18,2±0,8 и 25,2±1,3 штук в поле зрения соответственно).
Экспрессия белка апоптоза р-53 в клетках мозгового вещества долек тимуса у интактных животных и на сроке введения ХГ в течение 1 недели нами не зафиксирована. Через 2 недели после введения ХГ в мозговом веществе долек тимуса появляются р-53 позитивные клетки - 6,7±0,4 штук в поле зрения. Однако в дальнейшие сроки эксперимента их количество постепенно снижается (Рисунок 28). Корковое вещество доли
Тимус мыши. Позитивная реакция к р-53 в клетках коркового и мозгового вещества долек. Иммуногистохимическая реакция с р-53, ув. Х400. Микроскоп Leica DM4000B Обращает на себя внимание тот факт что, начиная со второй недели введения хорионического гонадотропина, характер изменения количества клеток в корковом и мозговом веществе долек тимуса приобретает разнонаправленный характер.
Таким образом, имеет место прямая зависимость между сроком введения хорионического гонадотропина и количеством клеток, экспрессирующих белок р-53 в корковом веществе долек тимуса мышей.
Иммуногистохимическая реакция на bcl-2 в морфофункциональных зонах долек тимуса мышей
Наблюдается снижение числа пролиферирующих клеток, экспрессирующих Кі-67 в корковом веществе долек тимуса, пропорционально сроку введения ХГ. Так, на 2-й, 3-й, 4-й неделях индекс пролиферации составил в группе опытных мышей 40,8±2,0; 33,5±1,8 и 27,3±1,9, в то время как у интактных мышей он составил 54,2±2,4; 51,3 2,0 и 56,1±2,7 соответственно (р 0,05).
Снижение процессов пролиферации лимфоцитов в корковом веществе долек тимуса при введении хорионического гонадотропина через 1, 2, 3, 4 недели, возможно, связано с глюкокортикоидными гормонами или с процессами, затрагивающими симпатоадреналовую систему [63, 81, 233].
При введении ХГ в течение 1, 2, 3, 4 недель запускаются процессы диффе-ренцировки Т-лимфоцитов при непосредственном участии тучных клеток и адре-нергических нервов, обеспечивающих дольку тимуса нейромедиаторными биогенными аминами. Кроме того усиливается экспрессия белков апоптоза р-53 в клетках коркового вещества долек тимуса.
Роли рецепторов к адреналину, в частности (32-адренорецептору, в развитии CD4+ лимфоцитов посвящена обстоятельная работа W. N. Kin, V. М. Sanders (2006). Они смоделировали иммунный ответ in vitro и пришли к заключению, что максимальное приближение результатов опытов к процессам, происходящим в живом организме, наблюдается при добавлении в среды культивирования норад-реналина.
Получается, что ученые разных стран, независимо друг от друга, отводят норадреналину в микроокружении лимфоцитов ведущую роль в становлении и развитии иммунного ответа. Этому вопросу уделено внимание и в работе М. А. Самотруевой и соавторов (2009).
Кроме того, имеется непосредственная связь между катехоламинергической иннервацией и экспрессией белков апоптоза: при обеднении иннервации синтез белков р-53 в нейронах гипотоламуса усиливается [164]. Также имеет место усиление экспрессии антиапоптозных белков в клетках под влиянием снижения концентрации катехоламинов в их микроокружении [178]. То, что уменьшение содержания в тканях норадреналина соседствует со снижением эффективности репарации ДНК, показано и в работе В. Н. Анисимова (2008).
Равновесие между процессами пролиферации, дифференцировки и апоптоза является ключевым в нормальном функционировании клеток. Поступление ХГ приводит к увеличению экспрессии белка р-53 в клетках коркового вещества долек тимуса прямо пропорционально сроку воздействия ХГ. Так, на 2-й, 3-й, 4-й неделях введения ХГ количество клеток, экспрессирующих маркер апоптоза р-53 в корковом веществе долек тимуса, в поле зрения составляет 12,0±0,9; 18,2±0,8 и 25,2±1,3 клеток соответственно, в то время как у мышей интактной группы это количество составляет 3,8±0,3 клетки в поле зрения. Заметим, что на протяжении всего срока эксперимента интенсивность люминесценции катехоламинов в структурах тимусной дольки мышей опытных групп снижена по сравнению с интакт-ными животными.
Найти связь серотонинэргической системы состояния с экспрессией клетками антиапоптотических белков предпринимали попытки Е. В. Баблюк и соавт. (2014), однако результаты не показали однозначного характера, как и в нашем исследовании.
Известно, что ХГ обладает иммуносупрессирующими свойствами в отношении пролиферации лимфоцитов [62]. Развитие иммунной толерантности при введении ХГ в концентрации, соответствующей первому триместру беременности, увеличивало количество Т-регуляторных (Treg) лимфоцитов в культуре CD4+-лимфоцитов, уменьшало субпопуляцию интерлейкин-17-продуцирующих лимфоцитов (ТЫ7), повышало активность индол-2, 3-диоксигеназы в моноцитах.
В нашем исследовании отмечено снижение экспресии маркера пролиферации Ki-67. Возможно, наблюдаемое нами влияние тучных клеток и макрофагов на состояние Т-лимфоцитов связано с иммуносупрессивным влиянием гормона ХГ [163].
Наличие в тимусе клеток со строго специализированными функциями обусловливает сложные нейроимммунные реакции при воздействии ХГ в течение 1, 2, 3, 4 недель, выявленные нами иммуногистохимическими методами.
Ряд исследований доказал, что активация иммунной системы опосредована цитокинами [108]. Большинство цитокинов продуцируется активированными Т-лимфоцитами. Некоторые интерлейкины регулируют рост и дифференцировку лимфоцитов. Интерлейкин-2 продуцируется СБ4+-Т-клетками и в гораздо меньшей степени СБ8+-Т-клетками [173]. Возможно, обнаруженное нами увеличение клеток в мозговом веществе связано с влиянием ИЛ-2, выделяемого лимфоцитами тимуса. Учитывая значительное увеличение лимфоцитов в мозговом веществе долек тимуса мышей с введением ХГ, можно подтвердить, что лимфоциты более чувствительны к стимулирующему влиянию интерлейкина-2. Стимулирующее влияние ХГ и ИЛ-2 в отношении натуральных киллерных Т-клеток отмечено С.А. Замориной и соавт. (2010).
Сведения о том, что ХГ является индуктором фенотипического созревания Т-лимфоцитов, подтверждаются нашим исследованием: увеличивается количество CD4+ и CD8+ клеток во всех морфофункциональных зонах тимуса мышей-самок.
В тимусе при введении ХГ отмечено увеличение количества CD4+-лимфоцитов и усиление продукции ими интерлейкина-4 [184]. Можно предположить, что уменьшение количества моноаминсодержащих люминесцирующих макрофагов при введении ХГ связано с влиянием интерлейкина, выделяемого Т-лимфоцитами. Интерлейкины, выделяемые лимфоцитами, могут стимулировать рост и дифференцировку Т-клеток.
Увеличение количества Т-клеток, эозинофильных клеток в тимусе при введении ХГ отмечено И. М. Солопаевой (2013). Дифференцировка Т-хелперов про 108 исходит за счет селективного апоптоза. Данный факт отмечен в нашей работе. При иммуногистохимическом окрашивании препаратов тимуса с применением маркера р-53 выявлено усиление апоптоза.
В нашем исследовании ослабление нейромедиаторного воздействия приводит к модуляции функции лимфоцитов и тучных клеток. Можно предположить, что накопление дифференцированных форм лимфоцитов в тимусе связано с влиянием серотонина (серотониновый индекс больше 1 при введении ХГ).
Следовательно, можно предположить, что уменьшение количества моно-аминсодержащих ЛГК, усиление экспрессии маркера апоптоза в тимусе связано с деятельностью тучных клеток и выделением ими цитокинов. Цитокины, накапливающиеся в тимусе после введения ХГ, возможно, стимулируют приток тучных клеток в железу. Механизмы этих взаимоотношений сложные. Наблюдаемые нами иммуногистохимические изменения в дольке тимуса при введении ХГ можно связать с действием биологически активных веществ тучных клеток.
Наши данные, полученные при введении ХГ в течение 1, 2, 3, 4 недель на живом организме, подтверждают сведения, полученные в экспериментах in vitro, и это свидетельствует о том, что методологический подход, выбранный нами (как модель эксперимента, так и методы исследования), является адекватным