Морфологическая характеристика реактивных изменений околоопухолевых участков слизистой оболочки желудка и регионарных лимфоузлов Томчук Олеся Николаевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Значение реактивных изменений в слизистой оболочки желудка и регионарных лимфоузлов при раке желудка (обзор литературы) 13

1.1. Микроокружение, как фактор опухолевой прогрессии 14

1.1.1. Роль ангиогенеза 14

1.1.2. Роль иммунных клеток 19

1.2. Реактивные изменения в ткани регионарных лимфоузлов в аспекте опухолевой прогрессии 24

1.4. Экспериментальное моделирование рака желудка 28

1.5. Роль нейрогуморальной регуляции в прогрессии злокачественных новообразований 31

Глава 2. Материалы и методы исследования 36

2.1. Общий объем проведенного исследования 36

2.2. Общая характеристика пациентов 36

2.3. Гистологические методы 37

2.4. Иммуногистохимические исследования 39

2.5. Экспериментальная модель рака желудка 41

2.6. Статистический анализ 43

Глава 3. Морфологическая характеристика особенностей ангиогенеза и реактивных изменений в околоопухолевых участках подслизистой основы слизистой оболочки желудка 44

3.1 Морфологическая характеристика лимфоидных фолликулов и очаговых лимфоидных инфильтратов в околоопухолевых участках слизистой оболочки желудка

3.2. Клинико-морфологическая характеристика лимфоидных фолликулов и очаговых лимфоидных инфильтратов в околоопухолевых участках слизистой оболочки желудка 60

Глава 4. Морфологическая характеристика особенностей ангиогенеза и реактивных изменений в регионарных лимфатических узлах 69

4.1. Морфологическая характеристика реактивных изменений регионарных лимфатических узлов 69

4.2. Клинико-морфологическая характеристика реактивных изменений регионарных лимфатических узлов 76

Глава 5. Экспериментальная модель рака желудка 94

5.1. Макро и микроскопическая картина опухолевых изменений в желудке

5.2. Морфологическая характеристика гипоталамуса в процессе экспериментального моделирования рака желудка 102

Заключение 108

Выводы 120

Список литературы

• Реактивные изменения в ткани регионарных лимфоузлов в аспекте опухолевой прогрессии
• Иммуногистохимические исследования
• Клинико-морфологическая характеристика лимфоидных фолликулов и очаговых лимфоидных инфильтратов в околоопухолевых участках слизистой оболочки желудка
• Морфологическая характеристика гипоталамуса в процессе экспериментального моделирования рака желудка

Введение к работе

Актуальность проблемы

Рак желудка (РЖ) является одним из самых распространенных злокачественных новообразований в мире. По данным М. Onoyama et all. в 2011г. эта патология по распространенности занимает 4 место в мире у мужчин и 5 место у женщин (Каприн А.Д. с соавт, 2015)

Хорошо известно, что прогноз при злокачественных новообразованиях определяется с одной стороны особенностями самой опухоли, а с другой - ее микроокружением или стромой (Yasuhiko Kitadai, 2010; Whiteside TL, 2008). Большое число авторов свидетельствует о важной роли опухоль-ассоциированных иммунных клеток в опухолевой прогрессии (Yan Не et al, 2014; М. Ammirante et al, 2010). Однако, следует отметить, что в большинстве исследований изучение роли иммунных клеток было связано с исследованием их плотности в строме опухоли и прилежащих тканях (Mantovani A., et al, 2006). В тоже время известно, что при РЖ на границе опухоли и прилежащей СОЖ часто наблюдаются очаговые иммунные инфильтраты различной степени выраженности. Морфологические особенности данных инфильтратов, их связь с клиническими характеристиками и прогнозом РЖ изучена недостаточно. Учитывая, что очаговые иммунные инфильтраты отражают выраженность воспалительных изменений на границе опухоли с окружающими тканями, там, где наиболее активно протекают процессы инвазивного роста и метастазирования, считаем, что их изучение перспективно как в фундаментальном, так и в клиническом аспектах.

При изучении роли воспаления в прогрессии злокачественных новообразований важно подчеркнуть, что воспалительные изменения носят не только местный, но и системный характер. Это проявляется реактивными изменениями в РЛУ и общей реакцией организма на воспаление. Большинство исследований патоморфологии РЛУ при злокачественных новообразованиях связано, в первую очередь, с выявлением в них метастазов (Winnard РТ. et al,

З

2008; Sharma R. et al, 2008). Однако в настоящее время крайне мало известно о морфологии РЛУ, характере реактивных изменений в них и особенностях ангиогенеза, связи отмеченных факторов с клиническими характеристиками и прогнозом РЖ. Учитывая, что изменения в желудке и РЛУ взаимосвязаны эти исследования представляют большой интерес.

Важно подчеркнуть, что наличие адекватной экспериментальной модели имеет большое значение в изучении механизмов желудочного канцерогенеза и разработке новых методов лечения этой патологии. При этом следует отметить, что если изучение реактивных изменений в опухоли и перитуморальнои области слизистой оболочки желудка возможно как в условиях эксперимента, так и в клинике, то изучение особенностей нейросекреторной регуляции, возможно лишь при экспериментальном моделировании. С учетом того, что нейросекреторная регуляция имеет важное значение, как при физиологических, так и патологических процессах и того, что в доступной литературе практически нет данных о характере морфологических изменений гипоталамо-гипофизарной системы при РЖ, эти исследования представляют большой интерес как с фундаментальной, так и с практической точки зрения.

Таким образом, с учетом вышесказанного, изучение морфологических особенностей очаговых лимфоидных инфильтратов на границе опухоли и прилежащей СОЖ, характера реактивных изменений и особенностей ангиогенеза в РЛУ, их связи с клиническими характеристиками и прогнозом РЖ, а также характера морфологических изменений гипоталамо-гипофизарной системы при РЖ явились темой настоящего исследования.

Цель исследования

Дать морфологическую характеристику особенностям реактивных изменений околоопухолевых участков СОЖ и РЛУ при РЖ.

Задачи исследования 1. Исследовать морфологические особенности очаговых лимфоидных инфильтратов в перитуморальнои области СОЖ.

1. Оценить морфологические особенности реактивных изменений и ангиогенеза в ткани РЛУ.

2. Установить связь реактивных изменений околоопухолевых участков СОЖ и РЛУ с клинико-морфологическими характеристиками и прогнозом РЖ.

3. В разработанной экспериментальной модели РЖ провести анализ особенностей ангиогенеза, воспаления и морфологических изменений гипоталамо-гипофизарной системы .

Научная новизна результатов исследования

Впервые изучены морфологические особенности реактивных изменений прилежащей к опухоли СОЖ и РЛУ и установлена их связь с клиническо-морфологическими характеристиками и прогнозом РЖ. Показано, что в основном очаговые лимфоидные инфильтраты были представлены CD20 В-лимфоцитами. Установлено, что множественные CD20 В-клеточные лимфоидные фолликулы в перитуморальной области СОЖ достоверно чаще наблюдались при низко или недифференцированном и перстневидно-клеточном РЖ (р=0,002), при диффузном типе РЖ (р=0,01) и их наличие было связано со снижением 3-х летней безрецидивной выживаемости с 77,3% до 41,7% (р=0,04). Впервые показано, что выраженные CD20 В-клеточные очаговые лимфоидные инфильтраты в перитуморальной области достоверно чаще наблюдались при размерах опухоли более 5 см (р=0,01), при диффузном типе РЖ (р=0,05), множественных метастазах (N2) в РЛУ (р=0,02), при наличии дилятированных капилляров в мозговом слое РЛУ (р=0,003) и были связаны со снижением безрецидивной выживаемости с 83,3% до 54,5%, р=0,07 и общей выживаемости со 100% до 72,7% (р=0,049).

При изучении морфологических особенностей РЛУ впервые установлено, что наиболее значимыми в прогностическом плане являются размер лимфоидных фолликулов и соотношения лимфоидных фолликулов с герминативными центрами и без. Показано, что размеры лимфоидных фолликулов больше 865 мкм в диаметре чаще наблюдались при диффузном

типе РЖ (р=0,07), при глубине инвазии, соответствующей ТЗ-4 стадии (р=0,04), при множественных полостных структур первого типа в строме опухоли (р=0,007) и при наличии дилятированных капилляров в собственной пластинке СОЖ (р=0,03). Увеличение размеров лимфоидных фолликулов больше 865 мкм было связано со снижением общей выживаемости с 91,7% до 71,4%, (р=0,11) и безрецидивной выживаемости с 87,5% до 42,9% (р=0,005). При изучении особенностей ангиогенеза в лимфоузлах выделено три типа микрососудов, отличающихся по морфологии и клинической значимости: микрососуды обычного строения, атипичные дилятированные капилляры и высокоэндотелиальные микрососуды. Впервые отмечено, что высокоэндотелиальные капилляры чаще наблюдаются при наличии выраженных очаговых CD20 В-клеточных лимфоидных инфильтратами в перитуморальной области (р=0,01). Наличие высокоэндотелиальных капилляров было связано со снижением 3-х летней безрецидивной выживаемости с 77,2% до 37,5%, (р=0,02) и общей - с 86,36% до 62,5% (р=0,1).

Впервые получена новая модель экспериментального РЖ (приоритетная справка № 2016117074 от 28.04.2016г.), индуцированного путем 2-х кратного введения взвеси карбоната кальция в смеси 0,4% раствора формальдегида и 0,4% раствора перекиси водорода белым беспородным крысам, и описаны особенности воспалительных изменений и ангиогенеза в СОЖ, а также морфологических изменений гипоталамо-гипофизарной системы при экспериментальном РЖ.

Научно-практическая значимость исследования

Установленные особенности реактивных изменений в СОЖ на границе с опухолью и в РЛУ могут быть использованы в практической работе патологоанатомов для уточнения прогноза РЖ и выработки оптимального плана лечения пациента.

Разработанный новый способ моделирования экспериментального РЖ позволяет через 4 месяца от начала внутрижелудочного введения белым

беспородным крысам смеси формальдегида и перекиси водорода эксперимента у 75% животных, а через 6 месяцев - у всех животных индуцировать злокачественные опухоли желудка с инвазией в подслизистую основу, мышечную, серозную оболочку, большой сальник, наличием опухолевых эмболов в сосудах и метастазов в РЛУ. Полученная экспериментальная модель может быть использована в научных лабораториях, занимающихся изучением механизмов прогрессии РЖ и поиском новых подходов к лечению этой патологии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Наличие выраженных CD20 В-клеточных очаговых инфильтратов, множественных лимфоидных фолликулов и лимфоидных фолликулов с атипией на границе СОЖ и опухоли связаны с неблагоприятными факторами прогноза и ухудшением 3-х летней общей и безрецидивной выживаемости больных.

2. Морфологическая картина реактивных изменений в РЛУ характеризуется большим разнообразием, которое выражается в различном соотношении мозгового и коркового вещества, количестве и локализации лимфоидных фолликулов, наличии и строении герминативных центров и мозговых синусов.

3. В РЛУ наблюдается три вида сосудов, отличающихся по морфологии и клинической значимости: микрососуды обычного строения, атипичные дилятированные капилляры и высокоэндотелиальные микрососуды.

4. Наиболее значимыми в прогностическом плане являются размеры и плотность лимфоидных фолликулов в РЛУ, отношение лимфоидных фолликулов с герминативными центрами к общему числу лимфоидных фолликулов и наличие высокоэндотелиальных капилляров.

5. Получена новая экспериментальная модель, позволяющая изучать механизмы прогрессии РЖ, связанные с эпителиально-мезенхимальной

трансформацией опухолевых клеток, активностью ангиогенеза и воспалительной инфильтрации СОЖ.

Соответствие паспорту специальности

Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология.

Степень достоверности и апробация результатов

Достаточный объем клинического материала, использование современных исследовательских методик и методов статистической обработки данных свидетельствуют о достоверности полученных результатов.

Основные результаты исследований доложены на следующих международных, Российских конференциях и съездах: IV и V Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения» (Санкт-Петербург, 2011г. и 2013г.); VI Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (г. Москва, 2011г и 2016г.); 64 Международной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы современной медицины» (г. Киев, 2010 г); XII всероссийской конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (г. Москва, 2013г); «7th Global Summit on Cancer Therapy» (Dubai 2015 г.); «4th international conference Cancer immunotherapy and immunomonitoring» (Ljubljana, 2015 г.).

Результаты исследования используются в педагогической и научной деятельности сотрудников кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии, кафедры патологической анатомии и кафедры лучевой диагностики, лучевой терапии и онкологии и ГБОУ ВПО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава России.

Апробации состоялись 201 года на заседании проблемной

комиссии по морфологии ГБУ ВПО ОрГМУ МЗ РФ.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 29 печатных работы, из них: 3 статьи в рецензируемых ВАК журналах, 1 статья в зарубежном журнале, 21 работа опубликована в материалах всероссийских и международных зарубежных конференций. Получена приоритетная справка на на изобретение №2016117074 от 28.04.2016г.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и состоит из введения и 8 глав: 1 глава - обзор литературы, 2 глава - материалы и методы, 3-8 главы-результаты собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 2 таблицами и 82 рисунками. Библиографический указатель включает 148 источников (28 отечественных и 120 зарубежных).

Реактивные изменения в ткани регионарных лимфоузлов в аспекте опухолевой прогрессии

Опухоль-ассоциированным иммунным клетка отводится важнейшая роль в опухолевой прогрессии, так как они, за счет различных цитокинов и хемокинов, опосредуют взаимодействие опухолевых клеток между собой и с элементами стромы (Jiang B. et al, 2013). Несмотря на то, что все исследователи отмечают повышение плотности иммунных клеток в ткани опухоли, мнения относительно их роли в опухолевой прогрессии довольно противоречивы. Ряд авторов свидетельствует о том, что высокая плотность опухоль-ассоциированных клеток может быть связана с их противоопухолевой активностью и является фактором благоприятного прогноза заболевания (Yan Не et al, 2014; M. Ammirante et al, 2010). Однако другие исследователи считают, что выраженная воспалительная инфильтрация стромы опухоли прилежащих тканей могут способствовать росту и метастазированию опухоли (Balkwill F., Mantovani A., 2001) за счет активации ангиогенеза, синтеза факторов роста, цитокинов, матриксных металлопротеиназ (ММР). Мы полагаем, что данные противоречия могут быть связаны с неоднородностью популяционного и субпопуляционного состава клеток системы иммунитета и многообразием продуктов их синтеза, а также со способностью клеток, в зависимости от степени зрелости и этапа роста опухоли, оказывать диаметрально противоположное действие. Наиболее часто в опухоли встречаются Т- и В-лимфоциты, нейтрофилы, макрофаги, а также ряд взаимодействующих с ними клеток (тучные клетки, эозинофилы). Рассмотрим данные о роли основных иммунных клеток в опухолевой прогрессии.

Лимфоциты с супрессорной активностью (CD4+ Т-хелперы). В настоящее время выделяют ТЫ и Th2 и Treg CD4 T-лимфоциты. При этом известно, что ТЫ- лимфоциты обладают противоопухолевой активностью. В свою очередь, Тп2-лимфоциты, индуцируя продукцию антител B-лимфоцитами и секрецию цитокинов IL-4, IL-5, IL-10 and IL-13, способствуют опухолевой прогрессии (Sallusto F. et al, 1998; Viola A. et al, 2006). Макрофаги, активированные Т1і2-лимфоцитами, в отличие от активированных ТЫ, способствуют росту и прогрессии опухоли за счет секреции цитокина IL-10 (BalkwillF.Etal,2001).

Среди CD4+ Т-лимфоцитов особое место отводится Т-регулирующим (T-reg) лимфоцитам с фенотипом CD4+CD25+FOXP3+. Они способствуют развитию аутоиммунитета, подавляют противоопухолевый иммунитет, инициируют опухолевый рост (Sakaguchi S, et al, 2010). Данные клетки встречаются у онкологических больных в периферической крови, опухолевом микроокружении, в ткани опухоли. Наибольшая их концентрация наблюдается в ткани периферических лимфоузлов (Mizukami Y.,2008; Curiel T. J., 2004). Увеличение количества T-reg лимфоцитов в ткани опухоли происходит за счет активного их привлечения опухоль-инфильтрирующими макрофагами или за счет генерации de novo, путем конверсии CD4+ лимфоцитов (Yang Z. Z. et al, 2009). Высокое содержание T-reg в строме опухоли и регионарных лимфатических узлов связано с более низкими показателями выживаемости больных злокачественными новообразованиями, в том числе и раком желудка (Копо K. et al, 2006; Mizukami Y. et al, 2008; Perrone G. et al, 2008; Shen Z. et al, 2010).

Цитотоксические CD8+ Т-лимфоциты обладают цитотоксической активностью по отношению к опухоли (Negus R.P. et al, 1997). При многих злокачественных новообразованиях высокое содержание в опухоли CD8 и высокие значения отношения CD8/CD4 коррелировали с лучшим прогнозом, по сравнению с больными с низким содержанием в опухоли CD8 и отношением CD8/CD4 (De Jong R.A. et al, 2009, Sato E. et al, 2005), в том числе и при раке желудка (Shen Z. et al, 2010).

Помимо цитотоксических CD8+ T-лимфоцитов в ткани опухоли обнаруживаюмся CD8+ T-reg лимфоциты. Их высокое содержание в строме опухоли и регионарных лимфатических узлов было связано с более низкими показателями выживаемости больных раком желудка (Koпо K. et al, 2006; Mizukami Y. et al, 2008; Perrone G. et al, 2008; Shen Z. et al, 2010).

Опухолъ-ассоциированные макрофаги. Функции макромагов связаны c презентацией антигенов, фагоцитозом, цитотоксичностью, регуляцией активности многих клеток (Fritzsching B. et al, 2011). При определенных условиях макрофаги могут поляризоваться в две субпопуляции: Ml и М2. Активация макрофагов Ml связана с продуктами жизнедеятельности бактерий. Эти клетки активно участвуют в защите как против микроорганизмов, так и опухолевых клеток. М-1 активно продуцируют IL-12 и IL-23 и отличаются низким уровнем секреции IL-10. В отличие от М-1, М-2 связаны с синтезом VEGF, эпидермального фактора роста (EGF), фактора роста опухоли в (TGFP), IL-8, IL-10 и активацией опухолевого роста (Mantovani, A. et al, 2004; Gordon, S., 2003; Mosser,D. M.,2003).

Большинство опухоль инфильтрирующих макрофагов являются сходными по функциям с М2 (Solinas G. et al, 2009). За счет активации ангиогенеза и пролиферативных процессов они играют важную роль при заживлении ран. При раке молочной железы, яичника, фолликулярной лимфомы (Sica A., 2006; Pollard JW, 2004; Mantovani A, 2008), а также при раке желудка (Haas M. et al, 2009; Ayari C. et al, 2009) высокая плотность М2 макрофагов в строме опухоли была связана с более распространенной стадией заболевания и плохим прогнозом.

В-лимфоциты в отличие от Т-лимфоцитов, являются основными участниками гуморального иммунитета. В организме человека они образуются в результате гемопоэза, который происходит в крастном костном мозге, затем поступают в кровь, неся на своей поверхности молекулы иммуноглобулинов. Из крови они направляются в периферические иммунные органы и заселяют их В-зависимые зоны. В данных зонах происходит активация В-лимфоцитов за счет взаимодействия с антигенами. После активации часть В-лимфоцитов возращается обратно в кровь, откуда попадает в различные органы, особенно в очаги воспаления.

Различают следующие типы зрелых В-лимфоцитов (Кременецкая А.М. c соавт, 1998):

Собственно В-клетки. Они представлены неактивированными В-лимфоцитами, не контактировавшими с антигенами. Являются полиспецифичными и имеют слабое сродство ко многим антигенам.

В-клетки памяти — долгоживущие клетки, которые обеспечивают быструю пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов в плазмоциты при повторном контакте с антигенами. Данные клетки могут жить в течении нескольких лет не делясь и не участвуя в рециркуляции.

Плазматические клетки — способны секретировать растворимые антитела и являются последним этапом дифференцировки активированных антигеном В-клеток. Представляют собой большие клетки с эксцентрично расположенным ядром и развитым синтетическим аппаратом. Являются короткоживущими клетками (2-3 дня) и быстро элиминируются при отсутствии антигена, вызвавшего иммунный ответ.

В последнее время установлено наличие В-регулирующих клеток (В-reg), презентирующих CD5+CD19+. Впервые термин В-reg лимфоцит был введен Mizoguchi et al. для описания В-клеток, которые оказали супрессивное действие на течение воспалительного заболевания кишечника (Mizoguchi, E., 2000, 2002). Они синтезируют ИЛ-6, ИЛ-10, ИФН-гамма, TGF- в (Harris DP., 2000; Tian J. et al 2001). Особое влияние на воспаление они оказывают за счет синтеза ИЛ-10, который способен сдерживать воспалительные реакции. Также В-reg лимфоциты являются источником аутореактивных антител, участвующих в развитии аутоиммунных заболеваний, например системной красной волчанки (Wang W., 2015), ревматоидного артрита (Flores-Borja F., 2013), рассеянного склероза (Michel L., 2014), воспалительных заболеваниях кишечника (Ока A, 2014), паразитарных и инфекционных заболевания, включая туберкулез (Li X., 2012).

Следует отметить, что роль В-лимфоцитов в опухолевой прогрессии изучена недостаточно, а имеющиеся данные противоречивы. Ряд исследований свидетельствует о том, что повышение плотности В-лимфоцитов в опухоли является прогностически благоприятным признаком, который связан со специфическим противоопухолевым иммунитетом (Claudia Mauri, 2012). Другие авторы показали, что при наличии в ткани опухоли В и Т-лимфоцитов отдаленные результаты лечения были лучше, чем у пациентов у которых в ткани опухоли находились только В-лимфоциты или только Т-лимфоциты (Milne K, 2009, А1-Shibli KI, et al, 2008). В тоже время, в других исследованиях было отмечено, что повышение плотности опухоль-инфильтрирующих В-лимфоцитов коррелирует с ухудшением результатов лечения пациентов со злокачественными новообразованиями, с быстрым ростом и метастазированием опухолей (Brad H. Nelson, 2010; Milne, K. et al, 2009).

Следует отметить, что в большинстве работ, связанных с изучением роли опухоль-инфильтрирующих иммунных клеток, проводилось определение их плотности в строме опухоли и прилежащих тканей (Yan Не et al, 2014). В тоже время, известно, что при раке желудка на границе опухоли и прилежащей слизистой оболочке желудка часто наблюдаются очаговые иммунные инфильтраты различной степени выраженности. Морфологические особенности клеток данных инфильтратов, их связь с клиническими характеристиками и прогнозом рака желудка изучена недостаточно. Учитывая, что очаговые иммунные инфильтраты отражают выраженность воспалительных изменений на границе опухоли с окружающими тканями, там, где наиболее активно протекают процессы инвазивного роста и метастазирования считаем, что их изучение перспективно как в фундаментальном, так и в клиническом аспектах.

Иммуногистохимические исследования

При оценке экспрессии CD4, CD8, CD20, CD68 учитывались особенности локализации презентирующих клеток и их плотность в лимфоидных фолликулах и инфильтратах в собственной пластинке слизистой оболочки желудка и в регионарных лимфоузлах. В зависимости от локализации и количества иммунных клеток были выделены следующие 4 варианта их распределения: отсутствовали; располагались по периферии фолликула (краевая экспрессия); располагались по всей площади фолликула (диффузная экспрессия); образовывали диффузные лимфоидные инфильтраты на границе с опухолью.

Плотность и особенности морфологии сосудов изучали с использованием маркера к CD34. Плотность микрососудов в околоопухолевых участках слизистой оболочки желудка и регионарных лимфоузлах оценивали в точках «максимальной васкуляризации» при увеличении х400 в пяти полях зрения, путем подсчета суммарного количества капилляров и отдельных клеток, экспрессирующих CD34 на условную единицу площади (Goddard J.C. et al, 2002). Количество «полостных» структур первого типа в строме опухоли определяли по структурам с частичной эндотелиальной выстилкой при увеличении х200 (нет, единичные - не более 2-х в поле зрения и множественные - более 2-х сосудов в поле зрения). В лимфоузлах оценивали наличие атипичных дилятированных капилляров и высокоэндотелиальных микрососудов.

В эксперименте оценку экспрессии цитокератина использовали для определения дифференцировки эпителиальных клеток, гладкомышечного актина - для определения наличия микрофиламентов в клетках. Для оценки присутствия мезенхимальной дифференцировки клеток использовался белок промежуточных филаментов клетки виментин.

Экспериментальная часть работы выполнена на базе кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии. Экспериментальная модель рака желудка разработана на белых беспородных крысах самцах (n=41) массой 180 - 250 г, из которых 36 были подопытные, а 5 - контрольные. В подопытной группе животных разделяли на 3 подгруппы. Содержание животных и эксперименты осуществляли согласно «Правилам проведения работ с использованием лабораторных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Животным первой подгруппы (n=12) каждые две недели, в 1 и 3 день, с помощью желудочного зонда per os вводили по 1,0 мл взвеси карбоната кальция в 0,4% растворе формальдегида и 0,4% раствора перекиси водорода в отношении 1:1 на протяжении 6 месяцев. Взвесь готовилась из расчета 0,05 г карбоната кальция на 1 мл 40% раствора формальдегида при комнатной температуре и вводилась в течение 15 минут от момента смешивания растворов. Животным второй подгруппы (n=12) аналогичным образом вводили указанную смесь и одновременно внутримышечно - по 0,5 мкг окситоцина (J. Frayne, D. Townsed, H.D. Nicolson). В третьей группе животных (n=12) взвесь карбоната кальция в 0,4% растворе формальдегида и 0,4% раствора перекиси водорода вводилась дважды в 1 и 3 день эксперимента. Контролем служили 5 интактных крыс, находившихся на обычном пищевом и водном режиме.

Через 3 месяца после 2-го введения взвеси от явлений интоксикации погибли 4 крысы из первой подгруппы. Через 5 мес. от начала эксперимента, после наркотизации парами эфира, выведены из эксперимента первые 3 крыс (1 из первой подгруппы, 2 - из второй), еще 3 крысы были выведены из эксперимента через 6,5 месяцев (1 из первой подгруппы, 2 - из второй), через 8 месяцев от начала из эксперимента были выведены 4 крыс из первой и 4 крысы из второй подгруппы, остальные (2 крысы из первой, 4 из второй подгруппы и 5 контрольных) - через 9,5 мес. Первые 6 крыс из 3 подгруппы были декапитированы через 4 месяца от начала эксперимента. Оставшиеся животные (6 крыс) - через 6 месяцев. После наркотизации животных парами эфира выполняли лапаротомию, острым путем извлекали желудок и вскрыв черепную коробку -гипоталамус. Желудок вскрывали по большой кривизне и изучали макроскопически. Препараты преджелудка, тела, пилорического отдела желудка и гипоталамуса исследовали гистологически с использованием световой микроскопии. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином Майера и эозином и иммуногистохимически с использованием антител к цитокератину 20, гладкомышечному актину и виментину. При изучении препаратов изучали гистологическую структуру опухоли и устанавливали в соответствии с Международной гистологической классификацией опухолей пищевода и желудка (World Health Organization Classification of Tumours, 1999).

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0. Сравнение показателей между группами проводили параметрическим и непараметрическими методами (LSD Test и Mann-Whitney тесты). Соответствие анализируемых параметров закону нормального распределения оценивали по значениям тестов Колмогорова-Смирнова и Уилксона-Гехана. Взаимосвязь между различными показателями определяли, используя параметрический метод (Pearson) и непараметрические методы (ранговой корреляции по Spearman и гамма). Достоверность различий частот признаков в изучаемых группах оценивали с помощью критерия f. Анализ общей и безрецидивной 3-х летней выживаемости выполняли по методу Каплана-Майера (Kaplan-Meier). Сравнение показателей выживаемости между группами больных проводили с использованием Long-Rank теста. Различия между показателями считали достоверными при p 0,05.

Клинико-морфологическая характеристика лимфоидных фолликулов и очаговых лимфоидных инфильтратов в околоопухолевых участках слизистой оболочки желудка

При изучении особенностей ангиогенеза установлено, что большинство сосудов в прилежащей к опухоли слизистой оболочки желудка было представлено капиллярами диаметром 7-40 мкм, обычного строения. Ядра выстилающих эндотелиальных клеток темные, уплощенной формы. Цитоплазма равномерно окрашивалась маркером CD34. Средняя плотность микрососудов в околоопухолевых участках слизистой оболочки желудка составила 62,6+6,7 на условную единицу площади (медиана 60).

Кроме описанных сосудов, в собственной пластинке слизистой оболочки желудка и подслизистой основе слизистой оболочки желудка, наблюдались дилятированные капилляры, размером от 40 до 200 и более мкм (105,3+70,8 мкм), часто неправильной формы (рис 3.18). Эндотелиальные клетки, выстилающие данные сосуды, имели крупные светлые ядра округлой или овальной формы с нежно-сетчатой структурой хроматина, характерной для бластных клеток рис. Экспрессия CD34 в описанных клетках была слабо выраженной или отсутствовала. В просвете дилятированных капилляров собственной пластинки часто наблюдались форменные элементы крови, в подслизистой основе слизистой оболочки желудка - содержимое преимущественно отсутствовало. Дилятированные капилляры в подслизистой основе слизистой оболочки желудка были выявлены в 49%, в собственной пластинке слизистой оболочки желудка в 58,2% случаев.

Полостные структуры первого типа (Сеньчукова М.А. с соавт, 2014), были представлены образованиями с частичной эндотелиальной выстилкой, клетки которой неравномерно окрашивались маркером CD34 и имели неровную поверхность с множеством цитоплазматических отростков, в просвете которых наблюдались опухолевые эмболы (рис 3.19). Данные структуры отсутствовали в 40,3% случаев, были единичными - в 25,4% и множественными - в 34,3%. При наличии полостных структур первого типа в исследованных препаратах одновременно наблюдались полостные структуры без эндотелиальной выстилки и кровеносные сосуды с опухолевыми эмболами в просвете.

Полостные структуры второго типа определяли по наличию характерного ячеистого строения соединительнотканного матрикса по инвазивному краю опухоли (рис 3.20). Некоторые структуры имели эндотелиальную выстилку, слабо окрашивающуюся CD34. Полостные структуры второго типа были выявлены у 47,1% пациентов.

г. Рис 3.20. Полостные структуры второго типа (1) в собственной пластинке слизистой оболочки желудка и подслизистой основе слизистой оболочки желудка. Окраска гематоксилин Майера и эозин. Увеличение окуляр хЮ, объектив х40.

Проведенный анализ показал, что количество лимфоидных фолликулов коррелировало с площадью синусов регионарных лимфоузлов (гамма=-0,387, р=0,04), с отношением числа лимфоидных фолликулов с герминативными центрами к числу лимфоидным фолликулам без герминативных центров (r=-0,403, р=0,03) и с общей 3-х летней выживаемостью (гамма=-0,436, р=0,03). При множественных лимфоидных фолликулах и лимфоидных инфильтратах синусы в лимфоузлах были сохранены значительно реже, чем при их отсутствии или единичных (в 33,3% и 60,9% случаев, соответственно, р=0,09). При множественных лимфоидных фолликулах и инфильтратах отношение числа лимфоидных фолликулов с герминативными центрами к числу лимфоидным фолликулам без герминативных центров было ниже, чем при их отсутствии или единичных (0,36+0,23 и 0,48+0,16, р=0,06). При множественных лимфоидных фолликулах и инфильтратах отмечена тенденция к снижению общей 3-х летней выживаемости с 89,7% до 74,1% (р=0,08).

При наличии герминативных центров в лимфоидных фолликулах в слизистой оболочке желудка отрицательно коррелировало с наличием полостных структур первого типа в строме опухоли (гамма=-0,429, р=0,01). При наличии герминативных центров в лимфоидных фолликулах полостные структуры первого типа в строме опухоли определялись реже, чем при их отсутствии (в 40% и 62,2%, соответственно, р=0,07).

Экспрессия CD4 Т-лимфоцитов и CD68 макрофагов в лимфоидных фолликулах и инфильтратах не была связана с особенностями ангиогенеза, клиническими характеристиками и прогнозом рака желудка.

Экспрессия CD8 Т-лимфоцитов коррелировала с локализацией опухоли (гамма=-0,545, р=0,03) и количеством CD20 В-клеточных лимфоидных фолликулов в околоопухолевых участках слизистой оболочки желудка (гамма=0,926, р=0,0006). Как показано на рисунке 3.21, краевая экспрессия CD8 наиболее часто наблюдалась при отсутствии и единичных лимфоидных фолликулах (в 75% и 41,7% случаев, соответственно, при отсутствии или единичных лимфоидных фолликулах и при множественных лимфоидных фолликулах), тогда как, диффузная экспрессия и CD8 лимфоидные инфильтраты - при множественных лимфоидных фолликулах (диффузная экспрессия - в 25% и 41,6%, и лимфоидные инфильтраты - в 0% и 16,6% случаев, соответственно, при отсутствии или единичных лимфоидных фолликулах и при множественных лимфоидных фолликулах, р=0,002).

Морфологическая характеристика гипоталамуса в процессе экспериментального моделирования рака желудка

В настоящее время в структуре онкологической заболеваемости, как в мире, так и в России, рак желудка входит в пятерку самых распространенных злокачественных новообразований. Основной причиной смерти является поздняя диагностика заболевания. Из-за отсутствия клинических проявлений на ранних стадиях заболевания диагноз ставится уже при наличии распространенного опухолевого процесса. В связи с этим, изучении механизмов опухолевого роста и метастазирования будет способствовать не только ранней диагностике, но и улучшению отдаленных результатов лечения данной патологии.

Известно, что опухолевое микроокружение, опухоль-ассоциированные иммунные клетки, вновь образованные сосуды в опухоли, фибробласты, тучные клетки играют важную роль в инвазии и метастазировании злокачественных новообразований. (Chan J.K., et.all, 2005, Maltby S. et all, 2009, Чехун В.Ф., 2013). При этом, опухоль-ассоциированные иммунные клетки и сосуды являются основными структурными элементами стромы, напрямую связанными с процессам инвазии и метастазирования. Следует отметить, что имеющиеся данные о роли опухоль-ассоциированных иммунных клеток в опухолевой прогрессии довольно противоречивы. Ряд авторов свидетельствует о том, что высокая плотность опухоль-ассоциированных клеток может быть связана с их противоопухолевой активностью и является фактором благоприятного прогноза заболевания (Yan Не et al, 2014). Однако другие исследователи считают, что выраженная воспалительная инфильтрация стромы опухоли прилежащих тканей могут способствовать росту и метастазированию опухоли за счет активации ангиогенеза, синтеза факторов роста, цитокинов, матриксных металлопротеиназ (ММР). Мы полагаем, что данные противоречия могут быть связаны с неоднородностью популяционного и субпопуляционного состава иммунных клеток, многообразием продуктов их синтеза, а также способностью клеток, в зависимости от степени зрелости и этапа роста опухоли, оказывать диаметрально противоположное действие.

Следует отметить, что в большинстве работ, связанных с изучением роли опухоль-инфильтрирующих иммунных клеток в опухолевой прогрессии, проводилось определение их плотности в строме опухоли и прилежащих тканях (Yan Не et al, 2014). В тоже время, известно, что в прилежащей к опухоли слизистой оболочке желудка часто наблюдаются лимфоидные фолликулы и очаговые инфильтраты иммунных клеток, роль которых в прогрессии рака желудка практически не изучена.

В настоящем исследовании было изучено количество и клеточный состав лимфоидных фолликулов и выраженность очаговых воспалительных инфильтратов на границе опухоли и слизистой оболочки желудка. Изучение клеточного состава показало, что количество и распределение иммунных клеток в лимфоидных фолликулах и очаговых инфильтратах отличается в зависимости от их вида. При этом, CD4 Т-лимфоциты в лимфоидных фолликулах наиболее часто располагались диффузно (в 14,3%, 28,6% и 57,1%, соответственно, отсутствовали, располагались по периферии и диффузно); CD8 Т-лимфоциты - по периферии лимфоидных фолликулов (в 55,5% и 33,3%, соответственно, располагались по периферии и диффузнои CD68 макрофаги располагались по периферии лимфоидных фолликулов в 83,3% случаев и диффузно - в 16,7%, в лимфоидных инфильтратах встречались в 45,6% случаев. CD8 и CD68 иммунные инфильтраты наблюдались в 11,1% и 45,6% случаев, соответственно.

Подавляющее большинство лимфоидных фолликулов и очаговых лимфоидных инфильтратов было образовано CD20 В-лимфоцитами. Однако в некоторых случаях встречались фолликулы не экспрессирующие маркер (в 21,4%). Ряд фолликулов имели атипичные герминативные центры, неправильной формы, расположенные эксцентрично. Экспрессия CD20 в них отсутствовала.

Проведенный анализ показал, что наибольшее прогностическое значение было отмечено для CD20 В-клеточных лимфоидных фолликулов и CD20 В-клеточных лимфоидных инфильтратов в околоопухолевых участках слизистой оболочки желудка. Количество лимфоидных фолликулов было связано со степенью дифференцировки (р=0,0006) и гистологическим типом опухоли (р=0,0007), наличием полостных структур второго типа в околоопухолевых участках слизистой оболочки желудка (р=0,002), площадью мозговых синусов в регионарных лимфатических узлах (р=0,005) и безрецидивной выживаемостью (р=0,003). Множественные лимфоидные фолликулы наиболее часто наблюдались при низко или недифференцированном и перстневидно-клеточном раке желудка в 58,3%, 42,8%, 25% и 0%, соответственно, при перстневидно-клеточном раке желудка, низкодифференцированной, умеренно дифференцированной и высокодифференцированной аденокарциноме, р=0,02). Их наличие было связано со снижением 3-х летней безрецидивной выживаемостью с 77,3% до 41,7% (р=0,04).

В свою очередь, выраженность очаговых лимфоидных инфильтратов в околоопухолевых участках слизистой оболочки желудка была связана с размерами опухоли (р=0,001), гистологическим типом (р=0,005), с наличием метастазов в регионарных лимфоузлах (р=0,02), глубиной инвазии опухоли (р=0,009), наличием полостных структур второго типа (р=0,04), наличием дилятированных капилляров в паракортикальной области регионарных лимфатических узлов (р=0,0004), общей (р=0,004) и безрецидивной выживаемостью (р=0,01). Выраженные очаговые лимфоидные инфильтраты чаще наблюдались при размерах опухоли более 5 см (в 0%, 60% и 81,25% случаев, соответственно в опухолях до 2х см, от 2 до 5 и более 5 см, р=0,01), при диффузном типе рж (в 46,6% и 78,9%, соответственно при кишечном и диффузном типе рж , р=0,05), при глубине инвазии опухоли ТЗ-4 (в 45,5% и 73,9%, соотв при Т1-2 т ТЗ-4, р=0,1), при множественных метастазах (N2) в регионарные лимфоузлы (в 56,3%, 33,3% и 91,7%, соответственно, при N0, N1 и N2, р=0,02), при наличии полостных структур второго типа (в 52,9% и 76,5%, соответственно, при их отсутствии и наличии, р=0,15), при наличии дилятированных капилляров в мозг слое (в 46,1% и 100%, соответственно при их наличии и отсутствии, р=0,003). Их наличие было связано со снижением 3-х летней безрецидивной выживаемостью с 83,3% до 54,5%, р=0,07 и общей выживаемости со 100% до 72,7%, р=0,049.