Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 61
Результаты собственных исследований
ГЛАВА 3. Морфологическое строение тканей тимуса в норме и в условиях гипоксии, обусловленной ВПС 74
3.1. Морфологические особенности строения тканей тимуса при гипоксии (синий тип ВПС) 74
3.2. Морфологические особенности строения тканей тимуса при гипоксии (белый тип ВПС) 94
3.3. Ультраструктурные особенности строения тканей тимуса при гипоксии, обусловленной разными типами ВПС 105
3.3.1. Ультраструктурные особенности строения тканей тимуса в норме и при гипоксии вызванной ВПС синего типа 105
3.3.2. Ультраструктурные особенности строения тканей тимуса при гипоксии, вызванной ВПС белого типа 120
3.4. Иммуногистохимическое исследование ретикулоэпителиальной стромы тимуса при ВПС разного типа 134
3.4.1. Иммуногистохимическое исследование ретикулоэпителиальной стромы тимуса при ВПС синего типа 136
3.4.2. Иммуногистохимическое исследование ретикулоэпителиальной стромы тимуса при ВПС белого типа 146
3.4.3. Оценка экспрессии молекул клеточной адгезии Е-кадгерина 156
3.5. Васкулогенез в тимусе при ВПС 164
3.5.1. Особенности экспрессии маркера CD34 при ВПС разного типа 164
3.5.2. Особенности экспрессии маркера CD31 в тимусе при ВПС разного типа 171
3.6. Иммуногистохимическая оценка пролиферативной активности (Ki-67) и внутритимической дифференцировки тимоцитов (CD3+) при ВПС разного типа 177
ГЛАВА 4. Оценка функциональных свойств тимуса в условиях гипоксии, обусловленной ВПС 186
4.1. Фенотипическое созревание тимоцитов у детей с разными типами ВПС 186
4.2. Особенности экспрессии транскрипционных факторов FOXP3
и RORt CD4+тимоцитами в зависимости от типов ВПС 188
4.3. Апоптоз тимоцитов при ВПС 192
4.4. Исследование функциональных свойств тимоцитов в условиях культивирования (in vitro) при ВПС разного типа 193
4.5. Дозозависимое действие соматотропного гормона (СТГ) и инсулиноподобного фактора роста 1(IGF-I) на пролиферацию и дифференцировку тимоцитов при ВПС 195
4.6. Эффекты функциональной активности тимоцитов, на фоне их стимуляции при ВПС разного типа 212
4.7. Определение содержания тимусных мигрантов в периферичекой крови у детей с ВПС разного типа 216
4.8. Оценка содержания в сыворотке крови гормона тимулина у детей с ВПС разного типа 218
ГЛАВА 5. Заключение 220
Практические рекомендации 247
Выводы 247
Список литературы
- Результаты собственных исследований
- Ультраструктурные особенности строения тканей тимуса при гипоксии, обусловленной разными типами ВПС
- Иммуногистохимическое исследование ретикулоэпителиальной стромы тимуса при ВПС белого типа
- Исследование функциональных свойств тимоцитов в условиях культивирования (in vitro) при ВПС разного типа
Результаты собственных исследований
Тимус покрыт соединительнотканной капсулой, от которой во внутрь отходят перегодки, разделяющие орган на дольки. В каждой дольке выделяют корковое, мозговое вещество и внутридольковые периваскулярные пространства.
Строма тимуса представлена трехмерной сетью, состоящей из ретикулоэпителиоцитов; между собой клетки соединены десмосомальными контактами. Эпителиальные ретикулоциты представляют собой гетерогенную популяцию клеток, отличающиеся морфологическими признаками, гистохимическими и ультрамикроскопическим особенностям [36, 87, 111, 112, 333]. В настоящее время существует несколько классификаций ретикулярных эпителиоцитов. По морфологическим признакам Anderson M., Venanzi Е. (2002) выделяют 2 типа: светлые и темные. По ультрамикроскопическим признакам строения [88], согласно классификации van de Wijngaert F. et.al (1984) и M. Kendall, et al. (1985), выделяют 6 типов ретикулярных эпителиоцитов. Так, клетки I типа прилежат к базальной мембране капсулы, сопровождают корковые перегородки (подкапсульный периваскулярный эпителий) и окружают периваскулярные простанства капилляров (периваскулярный эпителиоретикулоцит). Клетки имеют вытянутую или треугольную форму, образуя непрерывный слой на базальной мембране. Ядро у клеток овальной формы с инвагинациями, с наличием крупного ядрышка и умеренной маргинацией хроматина. В цитоплазме развита гранулярная эндоплазматическая сеть, содержатся пучки тонофиламентов, пиноцитозные пузырьки.
Клетки II типа располагаются в субкапсулярной зоне, имеют звездчатую форму, округлые ядра, 1-2 ядрышка и малоконденсированный хроматин. В цитоплазме тонких отростков содержатся тонофиламенты, вакуоли, гранулярная эндоплазматическиа сеть, комплекс Гольджи, митохондрии, электронноплотные гранулы, диаметром до 100 нм. Ретикулярные эпителиоциты этого типа часто в своей цитоплазме содержат тимоциты; их отростки тесно прилегают к другим клеткам, формируя с ними комплексы. Полагают, что это клетки - няньки, создают оптимальное микроокружение для развития тимоцитов [292]. Одна клетка-нянька может окружать несколько сотен тимоцитов.
Клетки III типа имеют меньший объем цитоплазмы, чем клетки II типа, но более длинные отростки, в цитоплазме много тонофиламентов и митохондрий.
Клетки IV типа - темные клетки, встречающиеся в глубокой кортикальной и медуллярной зонах, имеют веретенообразную или треугольную форму и длинные отростки. Ядра у них овальные, диаметром составляет от 3 до 10 мкм; плотность хроматина неоднородна, цитоплазма богата тонофиламентами и митохондриями. В цитоплазме встречаются вакуоли, нередко липидные включения. Клетки V типа присутствуют в медуллярной зоне, сходны с клетками четвертого типа, но имеют большой объем цитоплазмы. Отростки частично редуцированы. В цитоплазме много полирибосом, хорошо развита гладкая и гранулярная эндоплазматическая сети, присутствуют вакуоли и единичные лизосомы.
Клетки VI типа встречаются преимущественно вокруг тимусных телец и участвуют в их образовании [213]. Они имеют полигональную форму, содержат крупное ядро, диаметром до 15 мкм, и маргинально расположенный конденсированный хромтин. В цитоплазме имеется много тонофиламентов, собирающихся в грубые пучки; в дальнейшем они могут подвергаться дегенеративным изменениям. Ранее клетки 1, 2, 3 и 6 типов (светлые) относили к клеткам эктодермального происхождения, а клетки 4 и 5 типов (темные) – к энтодермальному [36, 207, 228, 349]. Некоторые авторы, основываясь на результатах иммуногистохимических исследований, выделяют четыре типа эпителиальных клеток: субкапсулярные, кортикальные, медуллярные и клетки тимусных телец [278].
Существует также ряд функциональных классификаций, в основу которых положен уровень экспрессии молекул ГКГ. В частности, выделяют высокий уровень экспрессии - hi(gh) и низкий lo(w). Классифицируют также по секреции тимических гормонов, активности транскрипционного фактора Aire (аутоиммунный (Ai) регулятор (re)) и по другим молекулам [111, 140, 194]. В процессе своего становления эпителиальные клетки тимуса, соединяясь отростками с помощью десмосом, образуют трехмерный каркас в виде сети. В связи с этим их стали называть ретикулярными эпителиоцитами. Общими ультраструктурными признаками всех эпителиальных клеток является наличие в цитоплазме тонофиламентов и связей между клетками. Описаны филаменты двух типов: 1) промежуточные, толщиной 8-11 нм; 2) тонкие, толщиной 4-6 нм. Первые собираются в пучки тонофиламентов, связанные с десмосомами. Тонкие филаменты формируют субмембранную сеть и могут объединяться в пучки. Наиболее крупные пучки тонофиламентов имеются в клетках телец Гассаля, наименее – в клетках субкапсулярной зоны [207]. Качество сборки промежуточных филаментов влияет на механическую стабильность и целостность эпителия [167, 278].
Ультраструктурные особенности строения тканей тимуса при гипоксии, обусловленной разными типами ВПС
Культивирование осуществляли в пластиковых круглодонных 96-луночных планшетах (Медполимер, Санкт-Петербург). Каждая культура содержала 2105 клеток в 0,2 мл забуференной культуральной среде. Последнюю готовили ex tempore на основе среды 199 (ПанЭко, Россия) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Reanal, Венгрия), 10 мМ HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N -2-этансульфоновая кислота, Sigma, США), 100 мкг/мл гентамицина сульфата (KRKA, Словения) и 10% сыворотки крови плодов коровы (жидкая стерильная, Биолот, Россия). рН среды доводили NaОН до 7,4. Культивирование осуществляли во влажной атмосфере с 5% СО2 при 370С. Через 72 ч проводили подсчет клеток в камере Горяева. Клетки окрашивали 0,2% трипановым синим и подсчитывали количество живых (неокрашенных) и неживых (с повреждённой мембраной и потому окрашенных) клеток.
Пролиферативная активность тимоцитов. Для культивирования использовали микрометод Kruit J.P. et al. (1986) и Goldschmidt L. et al. (1992). Культивирование осуществляли в пластиковых круглодонных 96-луночных планшетах (Медполимер, Санкт-Петербург). Каждая культура содержала 2105 клеток в 0,2 мл полной культуральной среды (106 клеток на 1 мл). Последнюю готовили ex tempore на основе среды 199 (ПанЭко, Россия) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Reanal, Венгрия), 10 мМ HEPES ((N-2-гидроксиэтилпиперазин-N -2-этансульфоновая кислота, Sigma, США), 100 мкг/мл гентамицина сульфата (KRKA, Словения) и 10% сыворотки крови плодов коровы (жидкая стерильная, Биолот, Россия). Показатели рН среды доводили NaОН до 7,4 и стерилизовали ее фильтрованием через фильтры диаметром пор 0,45 мкм (Jet Biofil, Китай). В качестве Т-клеточного митогена использовали Кон А (Concanavalin A from Canavalin ensiformis, Sigma, США) в концентрациях 40, 20, 10, 5 и 2,5 мкг/мл. В ряд проб вносили интерлейкин-2 (Sigma, США) в концентрации 100 IU/мл. Для оценки пролиферативного ответа лимфоцитов в культуры вносили инсулиноподобный фактор роста-I (IGF-I) (Sigma, США) в концентрациях: супрафизиолгическая - 10-7М, физиологическая - 10-8М и субфизиологическая 10-9 М [178, 261, 279, 326], соматотропин (СТГ) (Sigma, США): супрафизиологическая - 10-8 и 10-9М, физиологическая -10-10 М [279, 326]. Все исследования сопровождались постановкой контролей – 1) пробы без гормональных препаратов и митогенов; 2) пробы только с внесением митогенов. Все пробы ставили в повторах.
Культивирование клеток осуществляли во влажной атмосфере с 5% СО2 при 370С для Кон А в течение 72 ч. За 18 ч до окончания культивирования в каждую лунку вносили по 2 мкКи 3H-метилтимидина (ОАО «Всерегиональное объединение «Изотоп», Москва). Содержимое каждой лунки последовательно осаждали на нитроцеллюлозные фильтры (Millipore, США) с диаметром пор 0,45 мкм при давлении вакуумного насоса 0,5-1,0 атм., промывая каждую лунку 0,85% раствором хлорида натрия не менее 4-5 раз. Затем фильтры последовательно промывали для удаления, не связавшегося тимидина 5 мл 0,85% раствором NaCl, 5 мл охлажденной до 40С 5% раствором трихлоруксусной кислоты и 5 мл 0,85% раствором NaCl. После высушивания фильтров определяли радиоактивность проб на жидкостном сцинтилляционном счетчике «Wallac 1414 WinSpectral DSA Guardian» (США) в отделе радиоизотопных исследований лаборатории биохимии развития микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН. При подсчете использовали сцинтилляционную жидкость следующего состава: 4 г ППО (2,5 дифенилоксазол), 0,05 г ПОПОП (1,4-бис[5-фенил-2-оксазолил]-бензол), 900 мл толуола для спектроскопии, 100 мл 96% этанола. Результаты выражали в имп/мин.
Для оценки поликлональной тимусзависимой продукции цитокинов культивирование тимоцитов с КонА 5 мкг/мл осуществляли в аналогичных условиях в течение 72 ч. Определение концентрации цитокинов в супернатантах культур клеток проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием универсальных коммерческих тест-систем предназначенных для определения цитокинов в биологических жидкостях и в сывороке крови, согласно инструкции производителя (Интерферон гамма, Вектор-Бест, Россия; «Интерлейкин 4», Вектор-Бест, Россия; Интерлейкин 10, Вектор-Бест, Россия; Интерлейкин 17, Вектор-Бест, Россия).
Исследование периферической крови 2.3.1 Определение Т-рецепторных эксцизионных колец (ТРЕК) Выделение ДНК проводили из 1 мл цельной крови с использованием набора реагентов «KR-012» фирмы “OMNIX” (Россия), согласно инструкции производителя. Генетический материал хранился при –20оС до момента использования. Общую концентрацию ДНК и степень ее контаминации белком определяли спектрофотометрически на длинах волн 260 и 280 нм (UVmini 1240 “Shimadzu”, Япония). Расчет осуществляли на основе соответствующих коэффициентов экстинкции общепринятым методом [245].
Стандартный калибровочный образец. С целью стандартизации метода получен калибровочный образец ДНК (концентрация 275 мкг/мл, соотношение показателей светопоглощения на длинах волн 260 и 280 нм – 1,91). Калибратор являлся смесью ДНК, полученной от добровольных доноров составляющие группу сравнения.
ПЦР в реальном времени. Для расчета количества TРЭК применяли математический метод 2-Ct [238]. В качестве референса [344] использована геномная последовательность -актина (набор 401846 – -actin control reagents, “Applied Biosystems”, США). Амплификация целевого и референсного генов проводилась раздельно
Иммуногистохимическое исследование ретикулоэпителиальной стромы тимуса при ВПС белого типа
Таким образом, в тимусе при ВПС синего типа уже с ранних сроков исследования, и сохраняясь до 11 мес, нарастает процесс значительных морфологических изменений. На фоне циркуляторной гипоксии в органе на 1 месяце определяются признаки нарушения кровообращения с явлениями полнокровия кровеносных сосудах, очагов кровоизлияний и диапедеза эритроцитов в окружающие ткани. В течение всех месяцев наблюдения в корковом веществе дольки тимуса имеется снижение содержания тимоцитов с постепенным накоплением их в мозговом веществе (табл. 3). Возможно, что скопление тимоцитов вызвано замедлением поступления их в кровоток на фоне дисфункции сосудов кортико-медуллярной зоны.
На 1 мес. в междольковых перегородках тимуса определяется жировая ткань, которая значительно увеличивается в объеме к 11 мес, часто распространяясь в дольку вместе с соединительнотканными элементами. В тимусе повсюду определяюся клетки - производные мезенхимы. Активно идет развитие фибробластов, количество которых уже с 1 мес. достоверно превышает уровень контроля, оставаясь высоким до 11 мес. Очевидно, развитие фибробластов идет за счет имеющегося резерва прогениторных клеток, выселения их малодифференцированных форм из междольковых перегородок, в частности и из жировой ткани. Фибробласты врастают в дольку и нередко замещают собой определенные площади субкапсуллярной зоны. В пределах глубоких слоёв коркового вещества фибробласты интенсивно накапливаются с 6 мес и к 11 мес их уровень увеличиватся на 90% (р0,05) по сравнению с контролем. Клетками фибробластического дифферона может быть индуцирована также экспрессия гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF). Все это, возможно, и стимулирует миграцию макрофагов в тимус. Их количество в корковом веществе на протяжении всего возрастного периода было в 1,7 раза выше, чем в группе контроля.
Особое внимание обращает на себя изменение состояния эпителиальной стромы. Уже с 1 мес. в корковом веществе идет формирование тимусных телец и кроме того во всех его зонах имеются признаки дистрофического изменения ретикулоэпителиоцитов. К 11 мес. имеется значительная гибель этих клеток с формированием зон клеточного опустошения. К этому возрасту верифицируется усиление развития ДК (S-100+), что провоцирует, на наш взгляд, появление апоптозоустойчивых тимоцитов. Можно предположить, что причиной увеличения в корковом веществе апоптозоустойчивых тимоцитов послужило также нарушение структуры ретикулярных волокон гемато-тимического барьера в кортико-медуллярной зоне. Формирующиеся в результате этого очаги повреждения этого барьера на границе коркового и мозгового вещества, очевидно, благоприятствуют миграции зрелых апоптозоустойчивых лимфоцитов из мозговой части дольки в корковое вещество. Это может являться дополнительным фактором, т.к. апоптозоустойчивые лимфоциты накапливаются уже с 1 месяца, а значительные разрывы ретикулярных волокон верифицируются позднее.
Таким образом, гипоксия на фоне ВПС синего типа сильно влияет на морфологический субстрат тимуса. На фоне сосудистого расстройства в корковом веществе идёт активация клеток мезенхимного происхождения, обеспечивая процессы адаптивной или заместительной регенерации. Наиболее активно себя проявили фибробласты, макрофаги и дендритные клетки. Гипоксия влияет на качественный и количественный их состав, что может негативно влиять на весь процесс развития и дифференцировки тимоцитов.
В тимусах у детей 1 месяца жизни в междольковых прослойках дольки тимуса кровеносные сосуды умеренно расширены и заполнены клетками крови. Эндотелий увеличен в объеме и выбухает в просвет сосуда, создавая неровность выстилки. К 11 мес. в сосудах определяются застойные явления. Стенки сосудов отечны, с явлениями расслоения. В этих участках часто выявляются тучные клетки. Они лежат поодиночке, располагаясь вокруг дольки, а также периваскулярно. Макрофаги (CD68+) с 1 месяца формируют небольшие диффузные скопления (рис. 31), а к 11 месяцу имеются уже крупные группы клеток, заполняющие собой значительную часть междольковых прослоек. В течение всех сроков наблюдения около сосудов и между макрофагами диффузно располагаются ДК (S-100+). Рисунок 31. Скопление макрофагов CD68+ в междольковых прослойках. Возраст 1 месяц. Ув. Х1000.
С 6 месяца в междольковых прослойках появляются также адипоциты (vimentin+), скапливаясь по 2-3 клетки. Они часто формируют суопления в участках, переходящих в корковые перегородки. К 11 месяцу междольковые прослойки становятся шире, жировой ткани в них образуется больше; формируются достаточно крупные скопления адипоцитов (рис. 32).
Рисунок 32. Крупные скопления адипоцитов (vimentin+) в междольковых перегородках (МДП). Возраст 11 месяцев. Ув. Х1000. На 6 месяце из междольковых прослойек в дольку местами врастает соединительная ткань. В субкапсульной зоне отмечается скопление фибробластов и макрофагов. Здесь же между тимоцитами, группами по 2-3 клетки, залегают и ДК(S-100+). Своими отростками они тесно контактируют с различными клетками этой зоны (рис. 33). Вдоль капсулы долек тимуса залегают поодиночке тучные клетки. Иногда они находятся в контакте с тимоцитами.
Исследование функциональных свойств тимоцитов в условиях культивирования (in vitro) при ВПС разного типа
Выраженный характер гипоксии (синий тип ВПС) к 11 месяцу вызывает некробиотические изменения в значительном числе эпителиальных клеток стромы, тимоцитов и эндотелиальных клеток. Обращает особое внимание на себя, что уже с 1 месяца, ультраструктурные изменения имелись в ретикулоэпителиоцитах; степень выраженности которых усиливается к 11 месяцу. Аналогичное заключение можно сделать и в отношении сосудов тимуса. Ультраструктурные изменения их проявились в дистрофически измененяющихся эндотелиоцитах, отеке и нарушении целостности базальной мембраны. Часто капилляры окружаются перицитами, также имеющиеся структурные изменения. В результате тимоциты, как транзиторная популяция клеток, попадая в тимус и, вступая в межклеточный контакт (не всегда с полноценным микроокружением) меняются. Не получая соответствующих сигналов и необходмых стимулирующих факторов от эпителиальных клеток стромы. В тимоцитах, особенно при синем типе ВПС, наступают изменения, сопряженные с их гибелью. Появляются участки клеточной и тканевой деструкции. Это потенцирует активность макрофагов и фибробластов, синтезирующих коллагеновые волокна. Последние в большом количестве накапливаются к 11 мес., располагаясь преимущественно периваскулярно, или вклиниваются между клетками коркового вещества, замещая постепенно специализированные ткани тимуса.
В то же время на фоне структурно изменяющихся клеток в дольках тимуса обеих групп имеются зоны, где выявляются клетки с неизменённым внутриклеточным аппаратом. В цитоплазме таких клеток органоиды находятся в состоянии полной функциональной активности, что в какой-то степени обеспечивает в тимусе поддержание процессов внутритимической дифференцировки. Со временем количество таких участков уменьшается, что выражено в более поздние сроки, особенно при ВПС синего типа.
Иммуногистохимическое исследование ретикулоэпителиальной стромы тимуса при ВПС разного типа В норме строма тимуса представлена трехмерной сетью, состоящей из ретикулоэпителиоцитов; между собой клетки соединены десмосомами. Эпителиальные ретикулоциты тимуса – это гетерогенная популяция клеток, отличающаяся по, морфологическим признакам, гистохимическим и ультрамикроскопическим особенностям [36, 88, 112, 334].
По набору в цитоплазме кератиновых полипептидов ретикулоэпителиоциты хорошо различимы, что важно для определения их локализации и выполняемой функции. С целью изучения стромального компонента тимуса использовали панцитокератин (PanCK), включающий в себя широкий спектр кератинов, специфически реагирующих с нейтральными и кислыми кератинами эпителиальных клеток. Целостность эпителиальной сети оценили по результатам кластерного анализа, состоящего из площади экспрессии кератинов, количества кластеров и эпителиальных объектов, входящих в кластеры.
В тимусе контрольной группы на этапах постнатального онтогенеза, положительно окрашенная эпителиальная строма на PanCK в корковом веществе формирует трехмерный каркас. Соединяясь отростками, клетки создают сеть, в ячейках которой располагаются развивающиеся тимоциты (рис. 74). PanCK - это общий кератин (К) включающий большое семейство кератинов. В его состав входят также кератины, специфичные для тимусных ретикулоэпителиальных клеток: К5 и К8. Помимо этого, имеется экспрессия парного кератина 8/18, позволяющая определить его локализацию в дольках тимуса. В контроле эпителиальная строма в корковом веществе имеет позитивное окрашивание к PanCK и к К5, К8/18. Здесь клетки формируют диффузные группы скоплений (рис. 75).
Экспрессия кератинов в ретикулоэпителиоцитах коркового вещества (КВ) дольки тимуса: а) экспрессия К 8/18; б) экспрессия К5 в мозговом веществе (МВ) и вдоль корковых перегородок (КП). Тимус группы контроля. Ув.Х400.
Клетки входят в состав кластеров и формируют скопление на границе с мозговым веществом. В этой зоне К8/18+ клетки, соединяясь отростками, формируют густую сеть. В свою очередь, К5+ предпочтительно локализуется в участках прилежащих к базальной мембране в клетках субкапсулярной зоны и в мозговом веществе долек тимуса (рис.75).
В тимусах группы ВПС синего типа в течение всего возрастного периода экспрессия PanCK снижена, наиболее выражено на 11 месяце (табл.11). С 1 месяца в субкапсуллярной зоне коркового вещества, положительно окрашенные клетки выявляются в составе подкапсульного эпителия, формируя непрерывный пласт. К 11 месяцу в этой части дольки экспрессия PanCK является слабой и преимущественно верифицируется в одиночно лежащих клетках. В некоторых дольках имеются только позитивно окрашенные фрагменты ретикулоэпителиоцитов. В некотрых дольках клетки подкапсульного эпителия обособляются и лежат поодиночке, нарушая целостность эпителиального пласта.
В глубокой части коркового вещества в 1-й месяц жизни доля площади ретикулоэпителиальных клеток становится на 44% ниже, в сравнении с контролем; в дольках достоверно снижается и количество кластеров (табл. 11). Позитивно окрашенные клетки нередко формируют изолированные группы. В зоне глубокой коры клетки теряют связи между собою, отростки клеток выпрямляются, сеть разрушается (рис. 76). К 6 мес. экспрессия PanCK становится меньше, в результате чего занимаемая площадь ретикулоэпителиоцитами, по отношению к контролю, снижается на 65% (р0,001). К этому сроку количество кластеров становится ещё меньше (табл. 11). Состоят они из меньшего количества позитивно окрашенных объектов (PanCK+). Все чаще в корковом веществе долек регистрируются одиночно лежащие эпителиальные клетки и их фрагменты (рис. 76).