Введение к работе
Актуальность проблемы.
Данная работа посвящена проблеме изменения фенотипа опухолевых клеток, выживающих в токсичном микроокружении и характеризующихся феноменом множественной лекарственной устойчивости (МЛУ).
Одним из важнейших механизмов лекарственной устойчивости (как в культуре клеток, так и в клиническом материале) является активный выброс токсичного агента из клетки во внеклеточную среду. На сегодняшний день известно три основных белка, осуществляющих транспорт лекарственных веществ из клеток млекопитающих во внеклеточную среду: Р-гликопротеин (Pgp) (Beck et al., 1991) , MRP (multidrug resistance protein) (Cole et al., 1993) и LRP (lung resistance protein) (Schepcr et al., 1993). Наиболее хорошо охарактеризованным механизмом МЛУ является пшерэкспрессия Pgp - продукта гена MDR1. Pgp - высококонсервативный трансмембранный белок с молекулярной массой 170-190 kDa (Endicott et al., 1989). Pgp локализован на плазматической мембране, иммуноцитохимическими методами также определяется в местах синтеза белка (Willingham et al., 1987).
Известно, что клетки с гаперэкенрессией Pgp характеризуются изменением фенотипа, по сравнению с исходными клетками (Bidler ct al., 1981, 1994). Это выражается в изменении морфологии (Абдряшитов и др., 1989), увеличении степени дифференцировки (Stromskaya et al., 1995), снижении опухолеродности (Абдряшитов и др., 1989; Biedler et al., 1994) и метастатического потенциала клеток (Shtil et al., 1994). Такие фенотипические изменения сопровождаются не только изменением в экспрессии генов дифференцировки, но и реорганизацией различных клеточных структур: элементов цитоскелета (Абдряшитов и др., 1989; Erokhina et al., 1994; Нага ct al., 1995), адгезивных свойств клеток (Biedler et al., 1994), межклеточных контактов (Абдряшитов и др., 1989), а также изменениями в состоянии элементов вакуолярной системы (Bobichon et al., 1992, 1996).
Локализация в большом количестве на плазматической мембране крупного интегрального белка, каким является Pgp, приводит к изменению архитектуры и
свойств мембраны (Sinicrope ct al, 1992). Как известно, между плазматической мембраной, элементами цитоскелета и вакуолярной системой существует тесная структурно-функциональная связь. Закономерно предположить, что при изменении характеристик плазматической мембраны клеток, выживших в токсичном окружении, может происходить реорганизация различных клеточных структур, и прежде всего элементов цитоскелета, как наиболее тесно ассоциированных с плазматической мембраной.
Мы также предполагаем, что изменения фенотипа клеток с гиперэкспрессией Pgp могут быть неслучайны и с точки зрения поддержания "резистентного" статуса клеток. Показано, что элементы вакуолярной системы (аппарат Гольджи и везикулы) могут участвовать в накоплении антрациклинов в клетках с гиперэкспрессией Pgp (Molinary et al., 1995; Siedel et al., 1995). Некоторыми авторами найдена корреляция между экспрессией белков промежуточных филаментов и уровнем резистентности клеток (Bauman et al., 1994; Conforti ct al., 1995). Возможно, что участие элементов вакуолярной системы и цитоскелета играет немаловажную роль в обеспечении механизмов МЛУ, наряду с гиперэкспрессией Pgp. Таким образом, необходимо комплексное исследование элементов цитоскелета и вакуолярной системы в клетках с гиперэкспрессией Pgp. Цель и основные задачи работы.
Имеющиеся в литературе данные об изменении клеточных структур при развитии Pgp-опосредоваішой МЛУ получены на разных клеточных линиях и, как правило, при очень высоких уровнях устойчивости (в сотни и тысячи раз). Нам представляется, что особенно важно выявить возможные изменения различных клеточных характеристик (элементов цитоскелета и вакуолярной системы) на низких (начальных) уровнях развития МЛУ, так как они являются клинически значимыми и определяют дальнейшее развитие опухоли. На сегодняшний день не существует работ, представляющих собой комплексный анализ различных клеточных элементов и структур на первых этапах развития МЛУ, обусловленной пшерэкспрессией Pgp, также как и друїими белками-транспортёрами.
13 связи с этим, основной целью данной работы является: проанализировать остояние различных элементов цитоскелста и вакуолярной системы клетки на ачальных этапах развития множественной лекарственной устойчивости, ібусловленной пгаерэкспрессией Pgp.
Для решения этой цели были поставлены конкретные задачи: .. Изучить состояние актинового цитоскелета. '.. Исследовать распределение микротрубочек :
общей сети микротрубочек;
тирозилированных микротрубочек;
ацетилированных микротрубочек;
і. Исследовать распределение промежуточных (виментиновых) филаментов; . Проанализировать состояние структуры аппарата Гольджи. >. Изучить локализацию везикул с низким значением рН. І. Исследовать процессы внутриклеточного транспорта. . Изучить влияние брефелдина A (BFA) на:
структуру аппарата Гольджи;
локализацию везикул с низким значением рН.
Научная новизна результатов исследования. В результате проведённых экспериментов нами впервые показано, что ыжившие в токсичном окружении опухолевые клетки не только приобретают тожественную лекарственную устойчивость, опосредованную гиперэкспрессией gp, но фактически представляют собой морфологически новый тип клеток. Уже па ервых этапах возникновения и становления Pgp-зависимой МЛУ происходит яачительная перестройка элементов цитоскелета и вакуолярной системы езистентных клеток. Обнаружено, что при одинаковой выживаемости исходных леток и клеток с гапсрэкспрессией Pgp в среде с брефелдином А, структура ппарата Гольджи нечувствительна к действию брефелдина А в клетках с иперэкспрсссией Pgp. Полученные данные позволяют полагать, что данные
изменения не являются случайными и важны для выживания опухолевых клеток в среде, содержащей токсичные вещества.
Научно-практическое значение работы.
Выявленные изменения элементов цитоскелета и вакуолярной системы при сравнении чувствительных и резистентных опухолевых клеток могут быть характерны не только для клеток злокачественных новообразований, но и для нормальных клеток при их выживании в токсичном окружении. Эти наблюдения дают новые сведения относительно особенностей фенотипической изменчивости клеток млекопитающих, переживших стрессорныс воздействия и клсточпых механизмов этой изменчивости.
Понимание ультраструктурных отличий исходных опухолевых клеток от их резистентных потомков может способствовать поиску новых мишеней для проведения химиотерапии.
Апробация работы.
Результаты работы были представлены на симпозиуме "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 1992); на конференции но генетике соматических клеток в культуре (Москва, 1993); на международном симпозиуме "Биологическая подвижность" (Пущино, 1994); на международном симпозиуме "Цитоскелет и функция клетки" (Cold Spring Harbor, USA, 1995); на международном конгрессе по противоопухолевым препаратам (Paris, France, 1996); на международной конференции ISOBM (San Diego, USA, 1996); на 1-ом съезде онкологов стран СНГ (Москва, 1996); на международном симпозиуме по лекарственной устойчивости (Berlin, Germany, 1997); на заседании кафедры цитологии и гистологии биологического факультета МГУ.
Объем и структура диссертации.