Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Черепно-мозговая травма как медицинская и социальная проблема 13
1.2 Структурно-функциональные основы интегративно-пусковой деятельности мозга при черепно-мозговой травме 16
1.3 Структурные и функциональные изменения мозга при посттравматической эпилептизации 25
Глава 2. Материалы и методы исследования 32
2.1 Характеристика экспериментального материала 33
2.2 Экспериментальная модель тяжелой сочетанной черепно мозговой травмы 35
2.3 Морфологические методы исследования головного мозга 36
2.3.1 Светооптические исследования 37
2.3.2 Электронномикроскопические исследования 37
2.3.3 Иммуногистохимические исследования 38
2.4 Психоневрологические методы исследования 38
2.4.1 Методы оценки посттравматических судорог и инициации аудиогенных судорог 38
2.4.2 Методы оценки интегративной деятельности мозга 39
2.5 Методы статистического анализа полученных результатов 40
Глава 3. Структурно-функциональное состояние различных отделов головного мозга у крыс с высокой и низкой судорожной активностью после тяжелой сочетанной черепно-мозговой травмы 42
3.1 Сенсомоторная кора 46
3.2 Гиппокамп 50
3.3 Миндалевидное тело 56
3.4 Таламус 61
3.5 Кора мозжечка 63
Глава 4. Ультраструктурная характеристика клеток нервной ткани и межнейронных контактов у крыс с высокой и низкой судорожной активностью в посттравматическом периоде 67
4.1 Нейроны и нейроглия 67
4.2 Нервные отростки и синапсы 72
Глава 5. Изменение содержания p53 и bcl-2-позитивных нейронов в мозге у крыс с высокой и низкой судорожной активностью после тяжелой сочетанной черепно-мозговой травмы 83
Глава 6. Психоневрологический статус крыс с высокой и низкой судорожной активностью после тяжелой сочетанной черепно-мозговой травмы 89
6.1 Общее состояние и неврологический статус крыс 89
6.2 Поведенческая деятельность у крыс с высокой и низкой судорожной активностью 91
6.3 Нарушения долговременной памяти у крыс с различным уровнем судорожной активности 95
Глава 7. Обсуждение результатов исследования 99
Заключение 107
Выводы 111
Список сокращений и условных обозначений 113
Список литературы 114
- Структурно-функциональные основы интегративно-пусковой деятельности мозга при черепно-мозговой травме
- Сенсомоторная кора
- Нейроны и нейроглия
- Нарушения долговременной памяти у крыс с различным уровнем судорожной активности
Структурно-функциональные основы интегративно-пусковой деятельности мозга при черепно-мозговой травме
Мозг после ЧМТ является активным участником патологического процесса [28, 88]. Морфологические повреждения мозга вследствие механического воздействия во многом определяют характер и выраженность ЧМТ [ 51, 114, 137, 140]. Разобщение полушарий большого мозга, ствола и подкорковых структур при тяжелой ЧМТ лежит в основе многих неврологических и психических нарушений [3, 50].
При тяжелой ЧМТ особый интерес вызывают исследования перифокальной зоны (пенумбры) и мозга в целом (например, контрлатеральные отделы), а не некротические изменения ядра ушиба/размозжения головного мозга. В зоне пенумбры необратимым изменениям подвержены только часть нейронов, а остальные имеют признаки обратимой дистрофии и могут быть восстановлены при нормализации микроциркуляции [173]. В контрлатеральных отделах мозга имеются признаки компенсаторной и репаративной реорганизации нейронных сетей и межнейронных отношений [88].
В настоящее время происходит слияние различных методов структурной и физиологической нейровизуализации, 3D-графики, компьютерного анализа изображений, что существенно усиливает точность и объективность диагностики, получения информации на разных уровнях организации нервной ткани [65]. Это позволяет получить точное представление о структурно-функциональном состоянии всех зон ушиба, контрлатеральной области и неповрежденного мозга [119]. Показано, что в зоне контузии (очаг) и периконтузионной зоне (пенумбра) головного мозга происходят обширные нейрональные, астроглиальные и воспалительные изменения. При этом количественные характеристики биомаркеров очага и пенумбры значительно отличаются сразу после травмы и динамике посттравматического периода [173].
В контузионном очаге выявляются петехиальные кровоизлияния, тромбоз, воспаление, нейрональный пикноз и астроглиоз, отек, вакуолизация нейропиля, аксональная деструкция (белое вещество) и различные дистрофические изменения. Протеомный анализ продемонстрировал измененный иммунный ответ, синаптическую и митохондриальную дисфункцию [173, 176]. Вышеназванные изменения присутствуют и в зоне пенумбры, но степень их выраженности отличается от таковой в зоне контузии. В пенумбре преобладают дистрофические и отечные изменения, активация микроглии, необратимо измененные пикноморфные нейроны, демиелинизация, астроглиоз и воспалительные изменения (таблица 1).
Таким образом, по данным G.Harish с соавт. [173], в зоне контузионного очага преобладают биомаркеры воспалительных и иммунных реакций, гемостаза и заживления ран, а в пенумбре - регуляции нейрогенеза, синтеза белков цитоскелета и белков везикул. В зоне контузионного очага происходит более выраженная, чем пенумбре, деструкция синаптических и митохондриальных белков. В этой зоне превалирует атрофия нейронов, некроз и диссоциация синаптических терминалей по светлому типу деструкции. Выявлены ишемические изменения перикарионов, перинейрональный отек и вакуолизация дендритов, что указывает на необратимые нарушения межнейронных связей. При этом происходит чрезмерная экспрессия синаптофизина (в 6,4 раза в зоне контузии и в 4,2 раза в зоне пенумбры), что свидетельствует об индуцированной травмой репарации нейронов и синаптогенезе. Структурно-функциональные нарушения при ЧМТ обусловлены первичными и вторичными повреждающими факторами [141, 198]. Первичные повреждения обусловлены прямым действием травмирующего фактора. В местах первичного повреждения возникают некроз ткани мозга, явления отека-набухания, нарушение целостность сосудистой стенки и тромбоз сосудов, нарушение структуры нейронов и глиальных клеток, синаптические разрывы. Очаг первичного повреждения окружен зоной пенумбры. В данной зоне нервные клетки хотя и жизнеспособны, но крайне чувствительны к действию вторичных повреждающих факторов [44].
Высокая смертность и инвалидизация после тяжелой ЧМТ заставляют ученых и клиницистов искать причину тяжелых вторичных повреждений мозга [66]. Установлено, что механизмы вторичного повреждения при ЧМТ обусловлены факторами, характерными для острой и хронической ишемии [68, 82, 141, 230]. Вторичные посттравматические повреждения мозга развиваются за счет повышения внутричерепного давления, снижения церебральной перфузии, очагов ишемии, вторичных кровоизлияний, апоптоза нейронов и глиальных клеток [3, 34] и происходят при участии комплекса механизмов, включающих эксайтотоксичность, метаболический ацидоз, оксидативный стресс, воспаление и апоптоз [44, 127, 128, 152, 163, 164, 170, 193, 195, 207, 231, 238, 245, 248].
В основе эксайтотоксического механизма лежит избыточное высвобождение глутамата (возбуждающий нейромедиатор) при ишемической деполяризации и повреждении синапсов на фоне недостаточности функции астроцитов [131, 134, 185]. В результате внеклеточное содержание глутамата увеличивается до критических значений, что приводит к гипервозбуждению нейронов и повышению внутриклеточного содержания ионов кальция и натрия [260]. Эти изменения связаны с быстрыми ионотропными рецепторами глутамата (агонисты - N-метил-D-аспарагиновая, альфа-амино-3-гидрокси-5-метил-4 19 изоксазол-пропионовая и каиновая кислоты). Гиперактивация рецепторов увеличивает уровень Ca2+ внутри клетки с активацией ферментов, что приводит к апоптозу и некрозу. При этом ключевыми механизмами является деполяризация и повреждение мембран, продукция бескислородных радикалов и клеточная токсичность. В отличие от ионотропных метаботропные рецепторы глутамата и тормозные нейромедиаторные системы играют нейропротекторную роль через антиапоптотическую сигнальную систему (bcl-2) и снижение возбудимости нейронов [144, 145, 169, 177, 180, 199, 204, 230, 244]. Фармакологическая коррекция рецепторных систем является потенциальным направлением нейропротекции и профилактики эпилептизации головного мозга после травмы [161, 234].
Метаболический ацидоз, как механизм повреждения нейронов после ЧМТ, связан с недостаточностью функции митохондрий и накоплением лактата, приводящим к снижению рН внутри- и внеклеточной среды. Последнее стимулирует активацию протеолитических ферментов лизосом, изменяет работу ионных насосов [199, 220].
Механизмы оксидативного стресса связаны с появлением свободных радикалов кислорода в результате недостаточности функции митохондрий [211]. Этот процесс может быть усилен накоплением внутри митохондрий Ca2+. Образуются несколько видов кислорода (супероксидные ионы, свободные радикалы, перекиси, пероксинитрит). Все эти активные формы кислорода могут напрямую связываться с ДНК, изменяя ее структуру и вызывая повреждение клеток и усиление апоптоза [169, 193].
Важную роль в патогенезе ишемического повреждения головного мозга играют цитокины и клетки воспаления [166, 208, 235]. В ответ на травму мозг реагирует острым и длительным воспалительным процессом, который характеризуется отеком, быстрой активацией резидентных клеток (микроглии), выработкой провоспалительных медиаторов, инфильтрацией в ишемизированную ткань мозга различных типов воспалительных клеток [122, 123, 150, 166, 168, 183, 194, 203, 248]. Воспалительная реакция в мозге может быть острой, с преобладанием процессов разрушения поврежденной нервной ткани, и отдаленной репаративной [142, 166, 172, 182, 192, 194, 196, 203, 209, 217].
С воспалением при травме связан не только отек [248], но и ангиогенез [107]. В ответ на действие индукторов ангиогенеза активированные эндотелиальные клетки и их предшественники (прогениторные клетки) синтезируют ангиогенные молекулы (семейство сосудистых эндотелиальных факторов роста, семейство факторов роста фибробластов, трансформирующий фактор роста, фактор некроза опухоли и некоторые другие растворимые полипептиды), являющиеся эффективными регуляторами ангиогенеза [107].
Ингибиторы воспаления широкого спектра действия снижают степень повреждения нервной ткани у экспериментальных животных. Вместе с тем их клиническое применение требует дальнейшего изучения патогенетической роли воспаления при ЧМТ [230].
Сенсомоторная кора
При гистологическом исследовании во всех слоях сенсомоторной коры (СМК) у контрольных животных превалировали нормохромные нейроны с большим овальным или круглым ядром (рисунок 4а). Так, у контрольных животных в слое III СМК нормохромные нейроны составляли 96-98%. При этом общая численная плотность нейронов (ОЧПН) в СМК была 672,3 (588,4-784,2), а в слое V - 312,5 (256,0-326,7) на мм2 плоскости среза (таблица 4).
После травмы появлялось большое количество гиперхромных, гипохромных нейронов и клеток теней. Преобладали несморщенные гиперхромные нейроны (рисунок 4б, в). Вне крупных очагов травматического повреждения развивались типичные диффузно-очаговые ишемические изменения нейронов, нейронофагия (рисунок 4, 5, 6).
Среди реактивно измененных нейронов преобладали гиперхромные нейроны. Так в группе с низкой СА, через 1 сутки содержание гиперхромных нейронов в СМК составило 61,8% (95% ДИ: 51,5-71,3%) - 416,6 (338,2-465,3)/мм2. Среди них доминировали несморщенные нейроны - 62,5% (52,3-71,9%). В 1-й группе на протяжении последующих 30 суток после травмы только 35,0% (95% ДИ: 25,7-45,2%) гиперхромных нейронов в СМК, образовавшихся в раннем периоде, подвергалось необратимой деструкции и элиминации. Остальные нейроны частично сохранялись в виде сморщенных клеток с гомогенизацией ядра и цитоплазмы или восстанавливались до нормохромных. При этом, за счет всех механизмов необратимого повреждения (ранний колликвационный, поздний коагуляционный некроз, апоптоз и фагоцитоз) ОЧПН нейронов в слое III СМК через 30 суток снижалась до 506,1 (445,2-538,5)/мм2, на 24,7%, а в слое V - на 14,5% (таблица 4).
В группе крыс с высокой СА через 1 сутки после травмы содержание гиперхромных нейронов в СМК составило 68,5% (95% ДИ: 58,5-77,4%). Как и в 1-й группе преобладали несморщенные гиперхромные нейроны. Однако, высокая СА, вероятно, препятствовала их восстановлению в отдаленном посттравматическом периоде. В результате через 30 суток после ТСЧМТ в слое III СМК элиминации подвергалось 45,5% (95% ДИ: 35,5-55,8%) гиперхромных нейронов, на 10% больше чем в 1-й группе. При этом ОЧПН нейронов в слое III СМК снижалась до 454,5 (401,4-469,3)/мм2, на 32,4%, а в слое V - на 20,2%, и это было больше, чем у крыс с низкой СА в остром периоде (таблица 4).
Нейроглиальные взаимоотношения в перифокальных зонах характеризовались увеличением количества единичных или групп астроцитов около патологически измененных нейронов (рисунок 6).
Нейроглиальный индекс (НГИ) в неокортексе через 3 суток увеличивался (Манн-Уитни, p 0,01) до 2,8 (95% ДИ: 2,5-3,1), в контроле 1,5 (95% ДИ: 1,2-1,9). Уменьшение ОЧПН сопровождалось сначала увеличением НГИ (через 3, 7, 14 суток), а затем - снижением этого показателя через 21, 30 суток, но контрольного уровня НГИ не достигал (1,6 против 2,2 в контроле).
Таким образом, в сенсомоторной коре обеих групп животных после ТСЧМТ не только в очагах ушибов, но и в перифокальных зонах происходило необратимое разрушение части нейронов в результате включения повреждающих механизмов вторичной (обусловленной микроциркуляторными нарушениями) ишемии. Однако, при высокой СА после травмы, реализующейся появлением в раннем периоде судорог (гипервозбуждение, дополнительный выброс глутамата), в слое III СМК деструкции в зоне вторичного повреждения подвергалось 32,4%, в слое V - 20,2% нейронов, а у животных с низкой СА, соответственно, 24,7 и 14,5% пирамидных нейронов. Различия были статистически значимые. Кроме того, по нашим данным, у крыс с высокой СА чаще встречались крупные сложноорганизованные очаги ушиба неокортекса. Можно предположить, что в совокупности подобные изменения цитоархитектоники оказывали влияние на посттравматическую реорганизацию корково-корковых и корково-подкорковых взаимоотношений. Полагаем, что у крыс с высокой СА подобная реорганизация более существенно влияла на изменения интегративно-пусковой деятельности неокортекса и способствовала образованию патологических гипервозбуждающих систем головного мозга. Реакция нейроглии на повреждение сводилась к активации астроцитов для обеспечения фагоцитоза необратимо поврежденных (сморщенные гиперхромные нейроны), и защиты сохранившихся частично поврежденных (гипохромные, несморщенные гиперхромные) нейронов.
Нейроны и нейроглия
Во всех изученных отделах головного мозга выраженность и характер реактивных, деструктивных и компенсаторно-восстановительных изменений нейронов в обеих группах животных отличались в разные сроки после травмы.
Через 1-3 суток наблюдались структурные проявления гидропической дистрофии: появление в цитоплазме нейронов вакуолей, разрушенных митохондрий, эндоплазматического ретикулума (рисунок 18). Выявлялись разные морфотипы гиперхромных нейронов с высокой степенью осмиофилии (рисунок 19, 20 и 21).
В отдаленном посттравматическом периоде выявлялось большое количество нейронов с признаками недостаточности санирующих внутриклеточных механизмов. В цитоплазме накапливались осмиофильные продукты распада органелл (остаточные тельца) (рисунок 22). После травмы во всех изученных отделах головного мозга отмечались признаки отека-набухания одних глиоцитов (рисунок 23) и активации других глиоцитов (рисунок 24). В результате отека-набухания увеличивался объем отростков астроцитов, происходила вакуолизация цитоплазмы (рисунок 23).
Для активных астроцитов было характерно увеличение числа митохондрий, элементов цитоплазматической сети, полисом и лизосом. Кроме того, вокруг поврежденных нейронов происходило локальное увеличение количества мелких астроцитов, что свидетельствовало о пролиферации этих клеток (рисунок 23). Максимальное количество пролифелирующих астроцитов выявлялось через 3 и 7 суток после травмы в зонах скопления ишемически измененных нейронов (рисунок 24).
Нарушения долговременной памяти у крыс с различным уровнем судорожной активности
У животных, перенесших ТСЧМТ, наблюдались расстройства памяти (таблица 19). Через 1 сутки память у крыс как 1-й, так и 2-й групп была снижена, но более значимо у крыс с высокой СА. В этой группе крыс в 8,6 раз чаще наблюдалась достоверно значимая утрата выработанного условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ), время пребывания в безопасном отсеке составляло 11,6% от контрольных значений. У крыс с низкой СА сохранность памяти были в 1,8 раза выше, чем во 2-й группе (таблица 19).
Через 3 суток после травмы крысы с низкой и высокой СА в 2,2 и 3,5 раза соответственно чаще забывали об опасности, чем контрольные животные (таблица 19).
Через 7 суток произошло дальнейшее ухудшение памятного следа (в 1 -й группе на 24,2% во 2-й группе на 29,3%), более значимое, чем естественное угасание навыка в контроле (7,6%). Через 14 суток ослабление памяти более интенсивно происходило во 2-й группе, где показатели УРПИ в сравнении предыдущим сроком уменьшились почти в 2 раза (в 1-й группе и в контроле в 1,2 раза).
Через 30 суток после моделирования ТСЧМТ у крыс с высокой С А произошла полная утрата воспроизведения УРПИ (таблица 19). Крысы с низкой С А частично сохраняли память. Показатели отсроченного воспроизведения энграмм УРПИ у них в 2,5 раза превышали аналогичные во 2-й группе, хотя составляли лишь 43,7% от контрольных значений.
Время максимального снижения УРПИ совпадало с уменьшением общей численной плотности нейронов (ОЧПН) в гиппокампе и сенсомоторной коре и было более значимо у животных с высокой СА, у которых обнаружена прямая корреляционная связь: УРПИ – ОЧПН сенсомоторной коры (r=0,54, р = 0,01), УРПИ – ОЧПН поля СА1 гиппокампа (r 0,79, р 0,001), УРПИ – ОЧПН поля СА3 гиппокампа (r 0,64, р 0,008).
В результате проведенных исследований когнитивных функций мозга выявлено, что поведенческая деятельность крыс с разной судорожной активностью мозга после перенесенной ТСЧМТ характеризовалась выраженными нарушениями ее составляющих. Дефицит поведенческих реакций был наиболее значим в 1 сутки посттравматического периода и особенно у крыс с высокой СА. В динамике ТСЧМТ различия поведенческих расстройств между группами с низкой и высокой СА увеличивались и достигали максимальной выраженности в период поздних осложнений ТСЧМТ. Так, при отсутствии судорожных параксизмов у крыс через 7 суток после травмы восстановилась исследовательская деятельность, в то время как её уровень у животных с высокой СА был существенно снижен и через 30 суток ТСЧМТ. Несмотря на то, что в обеих группах нарушения в эмоциональной сфере выявлялись до конца срока наблюдения, при отсутствии судорожного синдрома уровень тревожности крыс в открытом поле в период отдаленных последствий травмы был ниже.
ТСЧМТ оказывала разрушительное действие на память, проявляющееся в форме дефектов фиксации памятного следа, ускорения процессов угасания выработанного условного рефлекса пассивного избегания. Динамика изменений памяти совпадала с динамикой поведенческих возможностей по реализации моторной и исследовательских программ, динамикой повреждения мозговых структур, отвечающих за реализацию когнитивных функций. Наличие судорожных параксизмов в посттравматическом периоде оказывали значимое влияние на изменение мнестических функций мозга. Расстройства функции памяти были более выражены у крыс с высокой СА. У крыс с низкой СА процессы восстановления функций высших отделов мозга протекали более интенсивно.