Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления об эмбриональном развитии эпителиальной выстилки маточно-влагалищного тракта в пренатальном периоде онтогенеза человека. Цитологическая картина области контакта эпителиев шейки матки в репродуктивном возрасте (обзор литературы) 16-52
1.1 Эмбриональные источники развития органов малого таза 16-20
1.2 Характеристика развития урогенитальной бластемы, парамезонефральных и мезонефральных протоков. 20-25
1.3 Участие мочеполового пространства в формировании маточно-влагалищного тракта 25-29
1.4 Характеристика эпителиальной выстилки
маточно-влагалищного тракта .29-33
1.5 Реактивные изменения эпителия шейки матки при кольпоскопической картине эктропиона и их диагностика 33-52
Глава 2. Материалы и методы исследования 53-67
2.1 Материалы исследования 53-59
2.2 Методы исследования 59-67
Глава 3. Результаты собственных исследований 68-121
3.1 Морфофункциональная характеристика гисто- и органогенеза маточно-влагалищного тракта человека в пренатальном периоде онтогенеза .68-115
3.1.1 Морфологическая, морфометрическая и гистохимическая характеристики производных урогенитальной бластемы с 4-й по 12-ю недели развития .68-79
3.1.1.1 Общая характеристика развития органов малого таза .68-73
3.1.1.2 Развитие парамезонефральных и мезонефральных протоков 74-75
3.1.1.3 Взаимодействия парамезонефральных и мезонефральных протоков с мочеполовым пространством 75-79
3.1.2 Морфологическая, морфометрическая и гистохимическая
характеристики эпителиальной выстилки маточно-влагалищного тракта с 13-й по 30-ю недели развития 79-98
3.2 Процессы пролиферации и дифференциации эпителиоцитов маточно влагалищного тракта в пренатальном периоде онтогенеза человека .99-115
3.2.1 Процессы пролиферации и дифференциации в гистогенезе эпителия парамезонефральных, мезонефральных протоков и мочеполового пространства с 4-й по 12-ю недели развития 99-106
3.2.2 Процессы пролиферации и дифференциации в гистогенезе эпителиальной выстилки маточно-влагалищного тракта с 13-й по 30-ю недели развития 106-115
3.3 Морфофункциональная характеристика, процессы пролиферации эпителиоцитов шейки матки в мазке на онкоцитологию у женщин репродуктивного возраста при кольпоскопической картине эктропиона 116-121
Глава 4. Обсуждение 122-128
Выводы 129-130
Практические рекомендации 131
Список сокращений .132
Список литературы
- Участие мочеполового пространства в формировании маточно-влагалищного тракта
- Реактивные изменения эпителия шейки матки при кольпоскопической картине эктропиона и их диагностика
- Морфологическая, морфометрическая и гистохимическая характеристики производных урогенитальной бластемы с 4-й по 12-ю недели развития
- Процессы пролиферации и дифференциации в гистогенезе эпителиальной выстилки маточно-влагалищного тракта с 13-й по 30-ю недели развития
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Основные этапы эмбриогенеза женской половой системы представлены в классических монографиях, написанных специалистами-эмбриологами и ставших уже библиографической редкостью (Пэттен Б.М., 1959; Кнорре А.Г., 1967; Волкова О.В., Пекарский М.И., 1976; Фалин Л.И., 1976). В классических гистологических исследованиях отмечается чрезвычайная сложность происходящих в ходе пренатального развития морфогенетических преобразований и механизмов регуляции женской половой системы (Волкова О.В., Боровая Т.Г.,1999). В этом кроется одна из причин существования многих противоречий и спорных вопросов по этой теме. К ним относятся, например, дискуссия о том, каким образом формируется «стык» морфологически и генетически различных эпителиев слизистой оболочки матки и влагалища, какова роль так называемых резервных клеток в возникновении патологических процессов женской репродуктивной системы, существуют ли генетически обусловленные предпосылки для развития доброкачественных и злокачественных заболеваний женской половой системы (Молдавская А.А., Федорова Н.Н., 2000; Валькович Э.И., 2003; Kurita T., 2011).
При разработке проблемных вопросов гистогенеза тканей с различными камбиальными свойствами применяют разные методологические и методические подходы (Хлопин Н.Г., 1946; Заварзин А.А., 1976; Данилов Р.К., 1994; Одинцова И.А., 2015). Вопросы пролиферации и дивергентной дифференцировки в эмбриональном и постнатальном гистогенезе, а также в реактивно измененных условиях у экспериментальных животных и человека успешно разрабатываются коллективами отечественных гистологических научных школ (Верин В.К., 2011; Данилов Р.К., Боровая Т.Г., 2011; Павлов А.В., 2011; Одинцова И.А., 2015; Гансбургский А.Н., 2015; Зашихин А.Л., 2015; Стадников А.А., 2015).
Согласно данным З.Н. Макиян (2010), врожденные пороки развития женских половых
органов составляют 14% всех врожденных аномалий, а становление и тканевая
дифференцировка женской половой системы протекают в неразрывной связи с выделительной
системой. Большинство исследователей признают факт сочетания аномалий развития матки и
влагалища с пороками развития или другой патологией мочевыделительной системы (Адамян
Л.В., Макиян З.Н., Богданова Е.А., 2001; Robboy S.J., Bernhardt P.F., 1994; Moore K.L., Persaud
T.V.N., 2002; Kurita T., 2008). Изучение разновидностей эпителиальных тканей с учетом
гистологических закономерностей вызывает интерес как у морфологов, так и у клиницистов
(Кобозева Н.В., Кузнецова М.Н., Гуркин Ю.А., 1981; Никитин А.И., 1997, 2006; Татарова Н.А.,
2011; Дубровина С.О., 2015).
Несмотря на имеющийся фактический материал, в научной литературе нет
однозначного мнения об особенностях развития клеточного материала урогенитальной бластемы, отсутствует характеристика процессов пролиферации и дифференцировки эпителия слизистой оболочки маточно-влагалищного тракта человека в различные периоды эмбриогенеза.
Выяснение гистогенетических основ развития эпителиальной выстилки органов женского полового тракта является актуальным не только в теоретическом, но и в практическом плане для грамотной и объективной микроскопической диагностики ее реактивных изменений.
Выводы некоторых современных авторов (Новик В.И., 2012; Malpica A., 2009) о тканевой природе «резервных клеток» и их полипотентных свойствах противоречат фундаментальному учению о генетической детерминации эмбриональных источников развития клеток и тканей у позвоночных и человека (Хлопин Н.Г., 1946). Требует дальнейшего исследования и уточнения процесс метаплазии. До настоящего времени спорным остается вопрос об участии в гистогенетических процессах такого явления как меторизис. Отсутствует комплексная характеристика основных закономерностей эмбрионального гистогенеза в эпителиальных тканях выстилки женского полового тракта, их взаимодействия и формирования границ и «стыка» и, как следствие, до сих пор не существует надежной программы ранней диагностики рака шейки матки (Нейштадт Э.Л., Крулевский В.А., 2012; Naucler P., Ryd W., 2007).
Одним из часто встречающихся реактивных состояний эпителия шейки матки является эктропион (Кудинов С.В. и соавт., 2007; Новик В.И., 2012). Согласно общепринятым сведениям, эктропион - это выпячивание во влагалище покровной ткани канала шейки матки, которая по своему виду и свойствам отличается от ткани, покрывающей видимую при обследовании акушерами-гинекологами шейку матки. Светооптическая характеристика и описание кольпоскопической картины эктропиона в общих чертах представлены в работах Г. Бауэр (2002), Б. Апгар, Г. Броцман, М. Шпицер (2012), но их трактовка механизмов формирования «псевдоэрозии» не всегда однозначна. В этой связи необходимо уточнение клеточного состава эпителиоцитов и гистологическая оценка реактивных изменений с учетом данных иммуноцитохимии.
Таким образом, имеется ряд спорных и малоисследованных вопросов по пролиферации,
дифференцировке и реактивности эпителиоцитов слизистой оболочки матки и влагалища,
изучение которых будет способствовать раскрытию сущности патологических процессов,
происходящих в эпителиальной выстилке указанных органов. Решение этих вопросов является
актуальным не только для теоретического понимания базисных процессов гистогенеза, но и
необходимо для уточнения механизмов дезадаптаций и патологических изменений генетически и морфологически различных эпителиальных тканей.
Цель работы: выявить морфофункциональные особенности гисто- и органогенеза маточно-влагалищного тракта у человека в пренатальном периоде онтогенеза и охарактеризовать реактивные изменения эпителия шейки матки при кольпоскопической картине эктропиона у женщин репродуктивного возраста.
Задачи исследования:
-
Уточнить основные процессы развития производных урогенитальной бластемы.
-
Охарактеризовать последовательное развитие эпителиальной выстилки маточно-влагалищного тракта человека в I, II и III триместрах беременности.
-
Оценить процессы пролиферации и дифференциации эпителиоцитов маточно-влагалищного тракта в пренатальном периоде онтогенеза человека.
-
Выявить реактивные изменения эпителиальной выстилки шейки матки в мазке на онкоцитологию при кольпоскопической картине эктропиона у женщин репродуктивного возраста.
Научная новизна работы
Впервые показано участие эпителиоцитов мочеполового пространства в формировании связи полости матки с внешней средой (с эпителиоцитами влагалища). Уточнены и охарактеризованы основные производные урогенитальной бластемы (мезонефральный проток и парамезонефральный проток) на ранних стадиях эмбриогенеза человека.
С помощью комплекса методов гистологического исследования (морфометрического, цитофотометрического, гистохимии, иммуногистохимии и иммуноцитохимии) впервые выявлены гистогенетические изменения клеток эпителиальной выстилки, происходящие при формировании маточно-влагалищного тракта в пренатальном периоде онтогенеза у человека.
Впервые предложена гипотеза о формировании дисперсной клеточной системы, клетки
которой являются производными эпителия мочеполового пространства и включены в состав
эпителиальной выстилки маточно-влагалищного тракта.
С помощью модифицированного метода жидкостной цитологии комплексом
морфологических исследований охарактеризован клеточный состав шейки матки в мазках,
взятых с поверхности шейки матки и цервикального канала у женщин репродуктивного
возраста при кольпоскопической картине эктропиона.
Теоретическая и практическая значимость работы вытекает из решения вопросов о механизмах формирования взаимодействия генетически различных видов эпителиев в процессе развития эпителиальной выстилки органов женского полового тракта. Показано, что в формировании стыка двух генетически различных видов ткани принимают участие производные эпителия мочеполового синуса, ввиду чего процесс метаплазии нельзя считать окончательно доказанным.
Результаты исследования способствуют пониманию формирования механизмов врожденных пороков развития (ВПР) женского полового тракта, так как выявлено, что перегородка парамезонефральных протоков формирует будущий шеечный канал и на ранних сроках эмбрионального гистогенеза вносит свой вклад в феномен гетероморфии клеток в составе канала. Важное значение для понимания механизма ряда патологических состояний имеет тот факт, что клетки - производные мочеполового синуса, выделенные нами в дисперсную клеточную систему эпителия шейки матки, участвуют во взаимодействии двух генетически различных видов ткани.
Предложенный модифицированный метод жидкостной цитологии с элементами культивирования тканей способствует сохранению свойств клеток, взятых с поверхности шейки матки и цервикального канала и может быть использован в повседневной практике врачей для быстрой и точной постановки диагноза.
Показана целесообразность использования цитокератина 20 для изучения так называемых «резервных» клеток в мазке на онкоцитологию.
Положения, выносимые на защиту:
-
С 4-й по 12-ю недели эмбрионального развития человека происходит дифференцировка закладок органов женской половой системы. На ранних сроках гестации выделены следующие этапы гистогенеза маточно-влагалищного тракта: а) закладка (4-5 недель); б) кранио-каудальный рост эмбрионального материала (5-7 недель); в) выделение протоков из урогенитальной бластемы (7-8 недель); г) объединение парамезонефральных протоков и формирование перегородки (8-9 недель); д) региональное взаимодействие с дорсальной стенкой мочеполового пространства (10-12 недель); е) формирование анатомических взаимоотношений между органами малого таза (мочевой пузырь, прямая кишка) – 12-13 недель.
-
С 13-й по 20-ю недели эмбрионального развития мочеполовое пространство является
связующим звеном в развитии матки и влагалища и определяет градиент линейного
перемещения эпителиев маточно-влагалищного тракта. Гистогенетические процессы, происходящие в эпителиальной выстилке мочеполового пространства, протекают в тесном единстве с таковыми в эпителиальной выстилке парамезонефральных протоков и эпителии кожного типа формирующегося влагалища.
-
С 20-й по 25-ю недели мочеполовое пространство не обнаруживается. Между эпителием целомического происхождения и влагалищным эпителием обнаруживается переходная зона, эпителиоциты которой являются производными эпителиальной выстилки мочеполового пространства.
-
С 25-й по 30-ю недели развития формируется место контакта целомического эпителия с эпителием кожного типа. Под столбчатыми эпителиоцитами шейки матки в области «стыка» с влагалищным эпителием, а также на дне шеечных желез обнаруживаются клетки, которые являются производными эпителиальной выстилки мочеполового пространства.
-
При кольпоскопической картине эктропиона обнаруживается переходная зона, которая возникает за счет процессов пролиферации и дифференцировки эпителиоцитов, являющихся производными эпителиальной выстилки мочеполового пространства. Эпителиоциты переходной зоны экспрессируют цитокератин 20, что характерно для клеток эпителиальной выстилки мочеполового пространства. Эпителиальная выстилка маточно-влагалищного тракта по гистогенетическим свойствам является полидифферонной системой, которая включает в себя производные эпителия парамезонефральных протоков, эпителия кожного типа и эпителия мочеполового синуса.
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность проведенного научного исследования определяется достаточным объемом материала, высоким уровнем современных гистологических, цитологических, иммуногисто- и иммуноцитохимических методик, обработкой полученного материала методами статистического анализа.
Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на научно-практических
конференциях: II всероссийской конференции с международным участием «Профилактическая
медицина – 2012», секция кафедры акушерства, гинекологии и перинатологии СЗГМУ им. И.И.
Мечникова (Санкт-Петербург, 2012); на III всероссийской конференции с международным
участием «Профилактическая медицина – 2013», секция кафедры акушерства, гинекологии и
перинатологии СЗГМУ им. И.И. Мечникова (Санкт-Петербург, 2013); на межвузовской
студенческой конференции с международным участием «Мечниковские чтения - 2014», секция
кафедры акушерства, гинекологии и перинатологии СЗГМУ им. И.И. Мечникова (Санкт-7
Петербург, 2014); на всероссийской конференции «Актуальные вопросы эмбриологии» (Санкт-
Петербург, Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова, 2014); конференции
«Актуальные проблемы морфологии: эмбриональный и репаративной гистогенез,
филогистогенез», посвященной 100-летию со дня рождения чл. - корр. АМН СССР А.Г. Кнорре (Санкт-Петербург, 2014); конференции « Учение о тканях. Гистогенез и регенерация» (Санкт-Петербург, Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова, кафедра гистологии с курсом эмбриологии, 2015). Результаты диссертации доложены и обсуждены на заседании кафедры акушерства, гинекологии, перинатологии и репродуктологии СЗГМУ имени И.И. Мечникова, протокол № 1 от 27.08.2014; на заседании кафедры гистологии с курсом эмбриологии Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова, протокол № 17 от 18.09.15.
Личное участие автора в получении результатов
Личное участие автора осуществлялось на всех этапах подготовки диссертационного исследования, начиная с его планирования, формулирования цели и задач исследования, определения алгоритма обследования, взятия материала и работы в научно-исследовательской лаборатории, статистической обработки и анализа полученных данных. Автор принимала непосредственное участие в подготовке пациенток, выполнении забора эмбриологического материала, в выполнении забора цитологического материала (мазков). Самостоятельно исследовала патологоанатомический материал на гистологических, цитофотометрических и иммуногисто- иммуноцитохимических установках и осуществляла обработку полученных данных согласно принципам доказательной медицины.
Внедрение результатов исследования
Результаты внедрены в учебный процесс кафедр: гистологии с курсом эмбриологии Федерального государственного бюджетного военного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны РФ (194175, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6) и кафедры акушерства и гинекологии имени С.Н. Давыдова ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» (191015, СПб., Кирочная ул., д. 41). Основные положения и практические рекомендации внедрены в клиническую работу Северо-Западного Лазерного центра (197101, СПб., Ковенский пер., д. 11).
Публикации
По теме диссертации опубликовано девять работ из них пять в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикаций основных результатов диссертаций на соискание ученой степени.
Структура и объем работы
Работа выполнена на 209 страницах компьютерного текста, состоит из введения, четырех глав диссертации, включая литературный обзор и результаты исследования, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и приложения. Диссертация содержит 10 таблиц и 98 рисунков. В библиографическом указателе приведены 165 источников, в том числе 95 зарубежных.
Участие мочеполового пространства в формировании маточно-влагалищного тракта
Органы малого таза и ткани, их образующие, развиваются из разных эмбриональных источников. Одним из наиболее сложным и малоизученных является вопрос о дифференциации эпителиальной выстилки некоторых производных клоаки и аллантоиса у человека.
Под клоакой подразумевают орган, образованный путем объединения заднего отдела пищеварительного тракта с мочеполовыми путями и необходимый для выделения из организма кала, мочи и половых продуктов (Блюмберг А.Ж., 1949). В клоаке выделяют три отдела: Coprodaeum, Urodaeum, Proctodeum. Анализ литературы свидетельствует, что вопрос о тканевой природе выстилки эмбриональной клоаки пока еще не может считаться окончательно решенным. Есть указания на то, что выстилку первых двух отделов считают энтодермальной, а выстилку третьего, более каудального отдела – эктодермальной (Sadler T.W., 2004). Большинство исследователей не учитывают строение клоаки в разных ее отделах и не обсуждают эмбриональные источники ее развития у человека. На ранних стадиях эмбриогенеза человека клоака в каудальном направлении слепо замкнута клоакальной мембраной (Фалин Л.И., 1976). Эта мембрана состоит снаружи из материала кожной эктодермы, а со стороны полости клоаки – из материала энтодермы (Данилов Р.К., Боровая Т.Г., 2003, Данилов Р.К., 2011).
На определенном этапе органогенеза клоаки возникает уроректальная складка, которая постепенно разделяет клоаку на вентральную часть (мочеполовой синус) и дорсальную – эмбриональную кишку (Sadler T.W., 1995, Boutin E.L., et.al., 1991). Имеются единичные исследования по развитию аноректальной перегородки (Wheeler P.G., et.al., 2001, He R. , et.al., 2004). Они посвящены порокам развития органов малого таза, в частности, аноректальной мальформации. Часть исследователей считает, что последняя обусловлена быстрым ростом уроректальной складки в эмбриогенезе человека (Draves C., et.al., 2004, Hynes P.J., et.al., 2004). Другая часть исследователей отдает ведущую роль морфогенетическим факторам, влияющим на клетки мезенхимального микроокружения уроректальной складки (RC-L NG, Matsumaru D., et.al., 2014). По мере дифференцировки эти клетки «координируют рост перегородки» в каудальном направлении (к клоакальной мембране). Однако исследователями не учитывается тот факт, что в этой области происходит тесное взаимодействие таких эмбриональных структур как желточный мешок, мочеполовой синус, задняя кишка и аллантоис. Все они тоже имеют мезенхимальные микроокружение. Авторами не делается акцент на эпителиальную выстилку этих органов и не обсуждаются вопросы взаимодействия разнородных эпителиев между собой.
На определенном этапе эмбриогенеза аллантоис с мочеполовым синусом объединяются (Кнорре А.Г., 1971). Клоака анатомически является частью единого зачатка кишечной трубки, аллантоис же образуется как вентральный вырост заднего отдела кишечной трубки. Поэтому, несмотря на отчетливо выраженный эпидермальный характер переходного эпителия мочевого пузыря, подавляющее большинство гистологов и эмбриологов продолжают до настоящего времени считать его развивающимся из энтодермы, как это сказано в ряде фундаментальных монографий (Пэттен Б.М., 1959, Кнорре А.Г., 1967, Волкова О.В., Пекарский М.И., 1976).
Выдающийся отечественный гистолог Николай Григорьевич Хлопин отмечает, что переходный эпителий мочеполового синуса часто «сближают» с эпителием кожи (эпидермисом), (Хлопин Н.Г., 1947). Позднее высказано предположение, что он возникает вследствие меторизиса эпидермального материала в клоаку и далее - в вольфовы протоки зародыша (Branda C.S., Dymecki S.M., 2004). Это приводит к смещению границы зачатка кожной эктодермы, он захватывает зоны, в которых развиваются так называемые переходные эпителии. Однако у переходного эпителия мочевыводящих путей и у других эпителиев, развивающихся из одного источника, есть и определенно неэпидермальные черты.
По мнению отечественных авторов (Борисов И.Н, Дунаев П.В., Бажанов А.Н., 1986), переходный эпителий развивается из вольфовых протоков, аллантоиса и части мочеполового синуса. Второй и третий зачаток близки друг к другу как производные клоаки. Это дает возможность предполагать, что переходный эпителий вначале возник в какой-то более узкой зоне (возможно, в мочевом пузыре), а затем распространился и занял более обширную площадь.
Аллантоис у птиц, как известно, развивается первоначально в виде мешковидного выпячивания вентральной стенки задней кишки. Отмечено, что на стадии 5-6 суток инкубации эпителий проксимальных частей аллантоиса (урахуса) в разных участках имеет неодинаковое строение (Хилова Ю.К., 1966). На сагиттальных срезах передняя (т.е. обращенная к переднему концу зародыша) стенка везде однослойная, а задняя стенка толще, причем толщина ее неравномерна. В одних участках она состоит из одного слоя клеток, в других участках клетки образуют 2-3 слоя. Указанные соотношения наводят на мысль, что первоначальное выпячивание клоакальной стенки, являющееся зачатком аллантоиса, возникает в том участке вентральной стенки клоаки, до которого доходит врастание эпидермального материала, оттесняющего энтодермальный эпителий кпереди (Carlson B.M., 1999).
Эпителий аллантоиса обнаруживает резкие отличия от кишечного эпителия и, напротив, черты сходства с некоторыми представителями эпидермального тканевого типа. (Кнорре А.Г., 1971, Лобко П.И, 1983). Большинство авторов рассматривают образование аллантоиса как выпячивание вентральной стенки задней кишки (Молдавская А.А., 2006, Yu J., Carroll T.J., McMahon A.P., 2002). Согласно другой точке зрения, аллантоис по времени возникает раньше задней кишки и не является ее производным, а представляет собой выпячивание энтодермы, располагающееся книзу и кзади от предпочки (Gossler A., 2002). Переднюю стенку аллантоиса образует зародышевая энтодерма, а в образовании его задней стенки принимает участие внезародышевая энтодерма.
Реактивные изменения эпителия шейки матки при кольпоскопической картине эктропиона и их диагностика
Руководствовались рекомендациями и протоколами Д.Э. Коржевского, О.В. Кирик, М.Н. Карпенко, и др., (2012). Методика заключалась в следующем: после регидратации срезов проводилось тепловое демаскирование. Препараты также помещали в цитратный буфер, затем в паровую баню в течение 40 мин при температуре 93-96 С. После того как препараты извлекали за паровой бани в течение 20-25 мин срезы остывали. Затем производилась обработка в 3% растворе перекиси водорода в течение 10 мин. После ополаскивания в дистиллированной воде и обработки в фосфатном буфере в каждом в течение 10 мин, на препараты наносили раствор протеин блока и оставляли в течение 10 мин.
Затем наносили первичные антитела в разведении 1:100 и помещали препараты в водяную баню. Время инкубации составляло 30 мин при комнатной температуре. После промывки в течение 10 мин в фосфатном буфере наносили вторичные антитела (Polyclonal Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP, Dako, США) в течение 30 мин при комнатной температуре в условиях паровой бани. Затем препараты промывали в рабочем буфере в течение 10 мин. Далее производилась обработка раствором хромогена – под контролем микроскопа в зависимости от интенсивности окрашивания и метки, как правило, 1 мин. Раствор хромогена смывали перекисью водорода и в зависимости от условий и визуализации производили докраску гематоксилином Майера с подсинением в щелочной воде. Далее - обезвоживание и заключение в бальзам.
Контроль: препараты с положительным контролем антител эпителиоциты прямой кишки (цитокератин 10), эпителиоциты кожи (CK-cocktail) и эпителиоциты мочевого пузыря (цитокератин 20). Отрицательный контроль антител: вместо первичных антител в соответствующих пунктах протокола производилась обработка на срезы 1,0% раствора бычьего сывороточного альбумина в фосфатном буфере. Методика обработки - выше описанная, параллельно с препаратами первой серии.
Для количественного определения гликогена, ДНК-фуксина,
суммарного белка и меченых клеток препараты подвергали гистохимической обработке одновременно для получения сравниваемых данных. Определение содержания и оптической плотности ДНК-фуксина, белка и гликогена проводили с помощью цитофотометра. Конструкция прибора удовлетворяет требованиям к оптической и электронной частям цитофотометра. Сюда входят следующие основные узлы: Микроскоп МИКМЕД – 5, стабилизаторы, лампа накаливания, усилитель постоянного тока, камера DSM150, микрометр ЛОМО, светооптические линзы фирмы ЛОМО.
Маркировка эпителиоцитов заключалась в присвоении порядкового номера (рис.2); для перевода значений в условные измерительные единицы использовалась морфометрическая решетка.
В препаратах определяли следующие параметры: диаметр парамезонефрального и мезонефрального протоков, их ветвление; характеристику эпителиальной выстилки канальцев; размер и форму клеток (A-больший диаметр клеток; В-меньший диаметр клеток), эпителиальной выстилки маточно-влагалищного тракта, диаметр и размер их ядер (A больший диаметр ядер; В-меньший диаметр ядер), ядерно цитоплазматическое соотношение (Я-ЦС), площадь клеток (S) и их ядер, фактор формы. Также анализировали морфометрические параметры клеток микроокружения.
В работе использована лицензионная программа PhotoM 1.21, с помощью которой производили основные измерения (диаметры клеток и их ядре, площадь клеток и их ядер, Я-ЦС и т.д.), в том числе измерения оптической плотности (D) цитоплазмы клеток и ядер клеток.
Статистическую обработку параметров производили согласно рекомендациям Г.Г. Автандилова (2006) с оценкой среднего арифметического (X), дисперсии, стандартного, среднего квадратического отклонения (5(a)), стандартной ошибки (Sx), коэффициента вариации (СV) и относительной ошибки ( т).
Полученные данные рассчитывали в лицензионной программе Excel-97, установленной на рабочем компьютере кафедры гистологии с курсом эмбриологии ВМедА имени СМ. Кирова (Санкт-Петербург). Проверку полученных результатов осуществляли в лицензионной программе Statistica 6.0, установленной на рабочем компьютере на кафедре статистики и информатика СЗГМУ имени И.И. Мечникова.
Для проведения расчетов использовались следующие основные параметры (Автандилов Г.Г., 2006): Оптическая плотность D= Lg— = LgФ0- LgФ (1) Переход от оптической плотности к содержанию веществ в образце требует введение параметра - площади объекта исследования. Тогда содержание равно А= D х S (2) где D - оптическая плотность, S - площадь сечения объекта. Для расчета содержания вещества необходимо измерить площадь для вытянутых ядер: S=-х А х В (3) где А - большой, В - малый диаметры. Среднее квадратичное, или стандартное, отклонение S= F - (4) где р - вероятность появления события, определенная в опыте, S - его стандартное отклонение, n - число наблюдений. Число наблюдений (п), необходимое для анализа при заданной вероятности (р), вычисляется: п= т (5) рК1-р) При р=0.1 (10%) число наблюдений необходимое для нормального распределения, равно 100. Заданной надежности в 95% соответствует доверительный интервал (X±1,96S). Для оценки достоверности разницы результатов в контроле и в опыте используются критерии Стьюдента. Степень достоверности различий вычисляется по формуле:
Морфологическая, морфометрическая и гистохимическая характеристики производных урогенитальной бластемы с 4-й по 12-ю недели развития
Так при анализе гистограмм: гиперплоидные клетки, относящиеся к классу 3n, обнаруживаются до 12 недель развития (рис.37-49). На 10-11 недели развития возникает небольшая популяция ядер эпителиоцитов относящихся к классу 4 n (см. рис. 45-46). Полученные данные в сопоставлении иммуногистохимических реакций и цитофотометрических реакций свидетельствуют о постоянном увеличении пролиферативной активности в двух протоках, однако последняя в гистогенезе эпителиоцитов парамезонефрального протока превышает таковую в сравнении с процессом пролиферации в эпителиоцитах мезонефрального протока. В то же время на 10-11-й неделях формируется гистограмма, включающая все классы по среднему содержанию ДНК в ядрах эпителиоцитов (2n, 3n, 4n), что совпадает с высоким индексом мечения на белок клеточной пролиферации Ki67 (см. рис. 45-48, рис. 50). Это можно объяснить общей закономерностью, которая характеризует процессы пролиферации и дифференцировки в клетках. Последняя заключается в постоянном увеличении длительности клеточного цикла. Сопоставление плотности суммарного белка в цитоплазме эпителиоцитов парамезонефрального и мезонефрального протоков выявляет следующие закономерности развития. При закладке парамезонефральных и дифференцировке мезонефральных протоков на 4-5-неделях развития оптическая плотность суммарного белка в цитоплазме эпителиоцитов парамезонефральных протоков меньше на 50% (рис. 49). И в дальнейшем до 8-9-й недели эта тенденция сохраняется, но имеет волнообразный характер. С 9-10-й недели развития оптическая плотность в эпителиоцитах двух протоков выравнивается. В целом с 4-5-й недели и по 9-неделю развития оптическая плотность суммарного белка в цитоплазме эпителиоцитов парамезонефральных протоков повышается на 25% от исходной плотности; тогда как в эпителиоцитах мезонефральных протоков оптическая плотность волнообразно изменяется и существенно не отличается на изученных стадиях эмбриогенеза (с 4-й по 12-ю недели).
Таким образом, сопоставляя процессы пролиферации и дифференцировки в двух протоках, можно сделать следующие выводы: на 4-5-й неделе эпителиоциты парамезонефральных протоков «более активны» по показателю пролиферации по сравнению с эпителиоцитами мезонефральных протоков, но менее дифференцированы по суммарному белку в цитоплазме этих эпителиоцитов. В дальнейшем, с 7-й по 12-ю недели, развития эпителиоциты мезонефрального протока постепенно увеличивают свою пролиферативную активность, в то же время сохраняя на относительно стабильном уровне оптическую плотность суммарного белка, что характеризует стационарную фазу эмбрионального гистогенеза (оптическое соотношение среднего содержания ДНК и синтеза специфических белков уравновешены). В парамезонефральных протоках наблюдается иная картина в те же сроки развития. По мере дифференцировки пролиферативная активность в эпителиоцитах парамезонефральных протоков увеличивается, превышая пролиферативную активность в эпителиоцитах мезонефральных протоков в 2 раза. Тем не менее, оптическая плотность суммарного белка сохраняется на стабильном уровне. Иными словами высокая пролиферативная активность эпителиоцитов парамезонефральных протоков существенно не отражается на стабильных показателях уровня дифференцировки эпителиоцитов по суммарному белку в цитоплазме на сроке до 12-недели развития.
Наряду с дифференцировкой эпителиоцитов парамезонефрального и мезонефрального протоков изучены процессы пролиферации в других органах малого таза, а также ближайшего микроокружения этих протоков (рис.51). Так, в урогенитальной бластеме содержится около 80,45% иммунопозитивных клеток; клетки разнообразной формы и величины. В мезотелии, покрывающем гонаду, и в зоне формирующегося мозгового вещества яичника (на границе с первичной почкой) обнаруживается почти 100% иммунопозитивных клеток.
В зависимости от локализации эпителиоцитов мочеполового пространства распределение иммунопозитивных клеток имеет следующие различия: клетки вентральной стенки синуса включают меньшее количество иммунопозитивных ядер - 40,12%, в то время как клетки дорсальной стенки содержат 64,29% иммунопозитивных ядер (рис.51). При этом индекс метки на белок ядерной пролиферации Ki67 распределен равномерно в базальном, парабазальном и поверхностном слоях мочеполового пространства. Внешняя оболочка содержит веретеновидные клетки, которые циркулярно располагаются вокруг синуса, обнаруживается большое количество иммунопозитивных клеток. При дальнейшем анализе, согласно изученным стадиям развития (с 4-й по 12-ю недели), пролиферативная активность в эпителиоцитах мочеполового пространства меняется незначительно.
Эпителиоциты закладки прямой кишки обнаруживают метку Ki-67 в 17,43% клеток. Внешняя оболочка содержит веретеновидные клетки, которые циркулярно располагаются вокруг прямой кишки, обнаруживается умеренное количество иммунопозитивных клеток. На 6-7-й неделе развития обнаруживается максимальная пролиферативная активность эпителиоцитов, которая составляет 70,12% меченых клеток. К концу первого триместра последний показатель уменьшается примерно в 2 раза и равен 40,12% клеток.
При сопоставлении индекса метки парамезонефральных протоков и мезонефральных протоков обнаруживаются следующие закономерности – в ПМП обнаруживается 20,12% меченых клеток, в МНП - 4,17% меченых клеток. При этом микроокружение парамезонефрального протока почти полностью имеет метку - 99,12%, в то время как микроокружение мезонефрального протока содержит лишь 21,54% меченых ядер.
Процессы пролиферации и дифференциации в гистогенезе эпителиальной выстилки маточно-влагалищного тракта с 13-й по 30-ю недели развития
Морфологическое исследование показало, что эпителиальная выстилка мочеполового пространства, формируя инвагинацию в сторону объединенных парамезонефральных протоков, участвует во взаимодействии двух видов эпителия: целомического эпителия с эпителием кожной эктодермы. Участие эпителиоцитов мочеполового пространства в формировании эпителиальной выстилки шеечного канала приводит к процессу гетероморфии клеточного состава в структуре последней. Наибольшая степень гетероморфии шеечного эпителия обнаруживается на 15-16-й неделях развития. В процессе развития к 20-25-й неделям происходит постепенная трансформация клеточного состава эпителиальной выстилки маточно-шеечного канала, которая заключается в уменьшении степени гетероморфии и уменьшении, соответственно, длины формирующегося шеечного канала. При этом ведущим клеточным диффероном становятся столбчатые эпителиоциты шейки матки. В то же время в структуре эпителиальной выстилки последней обнаруживаются отдельные клетки, концентрация которых в области «стыка» с эпителием кожного типа увеличивается, так формируется узкая «переходная зона». Последняя постепенно сужается до 2-3-х клеток, которые располагаются на базальной мембране эпителия, на границе целомического эпителия с кожным эпителием. Следует подчеркнуть, что клетки не переходят в зону расположения эпителия кожного типа, а находятся в зоне локализации цервикального эпителия. Кроме того, клетки дисперсно располагаются по каналу шейки матки и маточных желез в базальной части эпителиальной выстилки. В клинической практике их относят к «резервным» клеткам шейки матки (ВОЗ, 2008; Апгар Б., Броцман Г., Шпицер М., 2012), которые в реактивных условиях могут претерпевать дифференцировку с появлением признаков многослойности эпителия.
Как производные мочеполового пространства, клетки сохраняют свою детерминацию. Так, в эмбриогенезе возникает дисперсный клеточный дифферон в составе эпителиальной выстилки шейки матки. Следовательно, с позиции клеточно-дифферонной организации тканей базальные эпителиоциты можно отнести к клеточному дифферону ведущего столбчатого эпителия шейки матки, а последний - к полидифферонной ткани, имеющей генетически разные и детерминированные источники развития. В клинических условиях изменения зоны трансформации являются результатом процессов пролиферации и дифференциации базальных эпителиоцитов (появление комплекса «резервных» клеток). В итоге они формируют многослойный эпителий (эпителий переходной зоны шейки матки), имеющий иной источник развития, чем эпителий кожного типа.
Нами проанализированы цитологические картины мазков с поверхности слизистой оболочки шейки матки и цервикального канала у женщин репродуктивного возраста. Полученные данные свидетельствуют, что в процессах взаимодействия многослойного плоского эпителия и цилиндрического эпителия шейки матки активно участвуют клетки дисперсной клеточной системы (син: «резервные клетки», «метапластические клетки», Нейштадт Э.Л., Крулевский В.А., 2012). Учитывая пролиферативную активность последних, можно предположить, что дисперсная клеточная система определяет градиент перемещения эпителиев шейки матки внутрь и наружу по отношению к цервикальному каналу.
Полученные нами данные свидетельствуют, что эти клетки являются производными мочеполового синуса. Эти эпителиоциты сходны по морфологии с клетками эпителия кожного типа, но отличаются от такового эпителия генетически. Таким образом, мы обнаруживаем участие клеток дисперсной клеточной системы во взаимодействии двух генетически разных видов эпителиев: целомического эпителия и эктодермального эпителия. Сложившиеся эмбриональные, гистогенетические процессы лежат в основе формирования контакта этих эпителиев в области шейки матки у женщин репродуктивного возраста.
Кроме того, клетки дисперсной клеточной системы интенсивно метятся реакцией на цитоплазматический белок цитокератин 20. Указанный факт отличает эти клетки от клеток многослойного плоского эпителия и цилиндрического эпителия. Ввиду этого сложно предположить возможность трансформации этих клеток в различные диффероны, в частности, в эпителиоциты кожного типа и в то же время в эпителиоциты целомического типа. Указанный выше процесс лежит в основе «метаплазии», которая, по данным литературы, рассматривается как механизм взаимодействия эпителиев шейки матки в онтогенезе человека (Титмушш Э., Адамс, К., 2009), а источником развития метапластического плоского эпителия являются «резервные» клетки (Нейштадт Э.Л., Крулевский В.А., 2012). Полученные в ходе исследования данные входят в противоречие с этим фактом.
Полученные данные морфологического исследования свидетельствуют, что источником развития дисперсной клеточной системы, названной нами так с учетом характера локализации клеток в эпителиальной выстилке шейки матки является мочеполовое пространство. В постнатальном онтогенезе человека эта дисперсная клеточная система также обнаруживается в клетках, выделенных при получении мазков с поверхности шейки матки и цервикального канала. Соответственно эти клетки являются производными «эмбрионального» мочеполового синуса. Рассматривая теоретические основы взаимоотношения генетически разнородных тканей, следует отдать предпочтение теории меторизиса и частного проявления общебиологического процесса в области «стыка» эпителиев шейки матки в виде «метористической модуляции», а в случае патологии «метористического эксцесса» (Кнорре А.Г., 1971).