Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. Сравнительная анатомическая и гистологическая характеристика толстой кишки у человека и мыши 11
2.2. Язвенный колит 16
2.3. Роль реакций врожденного и адаптивного иммунитета в патогенезе язвенного колита 25
2.4. Эпителиальный барьер толстой кишки в норме и при язвенном колите 28
2.5. Экспериментальные модели язвенного колита 51
2.6. Заключение к обзору литературы 64
3. Материалы и методы 65
3.1. Животные и дизайн эксперимента 65
3.2. Методы исследования 67
4. Результаты собственных исследований 76
4.1. Клинические проявления экспериментального острого и хронического колита 76
4.2. Морфологическая характеристика стенки ободочной кишки в норме и при экспериментальном остром и хроническом колите 81
4.3. Морфометрическое исследование распространенности язвенного и воспалительного процессов в разных отделах ободочной кишки при экспериментальном остром и хроническом колите 90
4.4. Морфометрическое исследование состава воспалительного инфильтрата в дистальном отделе ободочной кишки в норме и при экспериментальном остром и хроническом колите 94 4.5. Изменения продукции цитокинов в стенке медиального отдела ободочной при экспериментальном остром и хроническом колите 98
4.6. Изменения эпителиального барьера ободочной кишки при экспериментальном остром и хроническом колите 104
4.6.1. Ультраструктурное исследование поверхности эпителиальной выстилки ободочной кишки в норме и при экспериментальном остром и хроническом колите 104
4.6.2. Изменение числа энтероэндокринных клеток в разных отделах ободочной кишки в норме и при экспериментальном остром и хроническом колите 114
4.6.3. Морфологическое и морфометрическое исследование бокаловидных клеток в разных отделах ободочной кишки в норме и при экспериментальном остром и хроническом колите 118
4.6.4. Исследование экспрессии мРНК секреторного муцина Muc2 и трансмембранных муцинов Muc1, Muc3 и Muc13 в медиальном отделе ободочной кишки в норме и при экспериментальном остром и хроническом колите 132
4.6.5. Изменение экспрессии мРНК белков плотных контактов клаудинов CLDN2 и CLDN4 в медиальном отделе ободочной кишки в норме и при экспериментальном остром и хроническом колите 135
5. Обсуждение результатов исследования 138
6. Заключение 189
7. Выводы 192
8. Список сокращений и условных обозначений 194
9. Список литературы 198
- Роль реакций врожденного и адаптивного иммунитета в патогенезе язвенного колита
- Заключение к обзору литературы
- Морфометрическое исследование распространенности язвенного и воспалительного процессов в разных отделах ободочной кишки при экспериментальном остром и хроническом колите
- Морфологическое и морфометрическое исследование бокаловидных клеток в разных отделах ободочной кишки в норме и при экспериментальном остром и хроническом колите
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Проблема невынашивания беременности, частота которого стабильно высока и
составляет 12–27% клинически установленных беременностей, занимает одно из первых
мест в практическом акушерстве [Милованов А.П., Серова О.Ф., 2011; Kwak-Kim J. et al.,
2010]. Невынашивание беременности имеет полиэтиологический характер. Если раньше в
генезе самопроизвольных абортов преобладали генетические, анатомические и
гормональные нарушения, то в последнее десятилетие в числе других причин невынашивания ведущими становятся инфекционные и иммунологические [Соснова Е.А., 2011]. Более чем в 40% случаев причины потери беременности установить не удается, и по данным ряда исследований в 80% случаев они обусловлены нераспознанными нарушениями иммунной толерантности матери к плоду [Сидельникова В.М., Сухих Г.Т., 2011; Zenclussen A. et al. 2005; Zhou W.H. et al., 2008; Kwak-Kim J. et al., 2010].
Многочисленные данные указывают на то, что физиологическое течение
беременности в значительной степени определяется балансом субпопуляций CD4+-клеток и
цитокиновой сети, а дисбаланс Th1/Th2/Th17 и Т-регуляторных клеток лежит в основе
иммунозависимых репродуктивных потерь [Saito S. et al., 2010; Mor G. et al., 2011; Ziganshina
M.M., Krechetova L.V., Vanko L.V. et al., 2013; Ozkan Z.S. et al., 2015]. Для изучения
патогенеза невынашивания беременности, разработки профилактических и терапевтических
мер, направленных на ее сохранение, широко используют экспериментальные модели на
мышах, которые имеют сходные с человеком тип строения плаценты и маточно-
плацентарной области, характер материнского и плодного кровообращения [Nayak N.R.,
Giudice L.C. 2003; Lee K.Y., DeMayo F.J., 2004]. Известны экспериментальные модели
абортов, в которых резорбцию эмбрионов индуцировали введением провоспалительных
цитокинов [Shiraishi H. et al.,1996; Clark D. A. et al., 1998; Knackstedt M.K. et al., 2003; Jin L.P.
et al., 2004], липополисахарида [Robertson S.A. et al., 2007; Friebe A. et al., 2011],
синтетической двухцепочечной РНК (poly I:C), имитирующей вирусную инфекцию [Lin Y. et
al., 2005] и другие. Наиболее близкой к невынашиванию беременности неустановленного
генеза у человека является модель спонтанных абортов, развивающихся при оплодотворении
самок линии CBA/J (H-2k) самцами линии DBA/2 (H-2d), отличающимися по антигенам
главного комплекса гистосовместимости. В отсутствие неблагоприятных экзогенных
факторов уровень эмбриональных потерь в данной модели составляет до 30%, тогда как при
других комбинациях линий – около 10% [Clark D.A. et al, 1986; Chaouat G. et al., 1990; Jin
L.P. et al., 2004]. На экспериментальных моделях показана роль материнских клеток
врожденного и адаптивного иммунитета в развитии и прерывании беременности [Jin L.P. et
al., 2004; Zenclussen A.C. et al., 2005; Blois S. M. et al., 2007 и др.], однако эти данные
относятся, главным образом, к области иммунологии репродукции. Интерпретация
результатов, полученных разными авторами, осложняется различием линий мышей и
вариантов беременности (сингенная или аллогенная), объектов, методов и сроков
исследования. Для дальнейшего изучения иммунологических механизмов ранних потерь
беременности необходимо стандартизованное сравнительное исследование
морфофункциональных изменений органов иммунной системы на моделях физиологически протекающей беременности, спонтанных абортов и иммунозависимого невынашивания, обусловленного четко определенным иммуномодулирующим триггером.
Известно, что компонент пептидогликана клеточной стенки бактерий
мурамилдипептид (МДП), связываясь с рецептором NOD2, запускает NF-B сигнальный
путь [Inohara N. et al, 2003; Athi-Morales V. et al., 2008] и стимулирует продукцию
провоспалительных цитокинов Th1-клетками и макрофагами [Калюжин О.В. с соавт., 2002,
2003, 2008]. Исходя из иммуномодулирующих свойств МДП и данных об индукции абортов
после введения экзогенных цитокинов ИФН- и ФНО- [Clark D.A. et al. 1998], мы
предположили, что синтетический иммуномодулятор -гептилгликозид мурамилдипептида
(С7МДП) способен потенцировать резорбцию эмбрионов и, следовательно, может быть
использован для моделирования иммунозависимого невынашивания беременности.
Возможность модуляции гликозидами МДП материнского иммунного ответа в направлении
Th1 является перспективной для расшифровки иммунологических механизмов
невынашивания беременности.
Степень разработанности темы исследования
На известных экспериментальных моделях аллогенной физиологической
беременности, спонтанных и индуцированных абортов морфологическое исследование тимуса и селезенки у самок с низкой и высокой частотой резорбции эмбрионов не проводилось, а структура плаценты была охарактеризована фрагментарно лишь в отдельных работах [Boyson J.E. et al., 2006; Girardi G. et al., 2006; Redecha P. et al., 2009]. В связи с этим разработка оригинальной воспроизводимой модели иммунозависимого невынашивания беременности и исследование морфофункциональных изменений органов иммунной системы и плаценты, определяющих развитие или прерывание беременности, являются актуальными научными задачами.
Цель исследования - изучение морфофункциональных изменений тимуса, селезенки и плаценты у самок мышей при физиологической беременности, высокой частоте спонтанных абортов и после воздействия иммуномодулятора -гептилгликозида мурамилдипептида (С7МДП) на материнский организм в ранние сроки гестации.
Задачи исследования:
1. Оценить влияние -гептилгликозида мурамилдипептида (С7МДП) на уровень
эмбриональных потерь у самок мышей на моделях физиологической беременности
(CBA Balb/c) и спонтанных абортов (CBADBA/2).
-
Провести сравнительное исследование динамики морфологических изменений тимуса самок мышей СВА при физиологической беременности, спонтанных, индуцированных и потенцированных С7МДП абортах.
-
Сравнить динамику морфологических изменений селезенки самок мышей СВА при физиологической беременности, спонтанных, индуцированных и потенцированных С7МДП абортах.
-
Определить пролиферативную активность клеток селезенки самок CBA ex vivo и их реакцию на антигены аллогенных самцов Balb/c и DBA/2 в смешанной культуре лимфоцитов при физиологической беременности, спонтанных, индуцированных и потенцированных С7МДП абортах.
5. Оценить продукцию лимфоцитами селезенки самок CBA ex vivo цитокинов,
характеризующих функцию Т-хелперов 1 типа (Th1), Th2, Th17, T-регуляторных клеток и
моноцитов/макрофагов, при физиологической беременности, спонтанных, индуцированных
и потенцированных абортах.
6. Охарактеризованть морфофункциональное состояние плаценты жизнеспособных плодов у самок мышей СВА при физиологической беременности, спонтанных, индуцированных и потенцированных С7МДП абортах.
Объект и предмет исследования – органы иммунной системы и плацента самок мышей со спонтанными и индуцированными абортами.
Теоретической и методологической базой диссертации послужили научные работы и методические рекомендации отечественных и зарубежных авторов в области иммунологии беременности, морфологии плаценты и органов иммунной системы экспериментальных животных.
Информационной базой исследования явились монографические научные источники, статьи в рецензируемых научных журналах, материалы конференций соответствующей научной тематики.
Диссертация соответствует паспорту научной специальности 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология согласно пунктам 1,2,5,6,7.
Научная новизна исследования:
Впервые изучено влияние иммуномодулятора С7МДП на уровень эмбриональных потерь при физиологически протекающей аллогенной беременности (самки линии CBA, оплодотворенные самцами линии Balb/c) и беременности с высоким уровнем спонтанных абортов (самки CBA, оплодотворенные самцами DBA/2). Установлено, что введение иммуномодулятора в ранние сроки гестации втрое увеличивает частоту резорбции эмбрионов по сравнению с физиологической беременностью.
Показано, что у самок с индуцированными и потенцированными абортами по сравнению с физиологической беременностью и спонтанными абортами усиливается выраженность акцидентальной инволюции тимуса, в селезенке развивается гиперплазия Т-зависимой зоны, в плаценте жизнеспособных плодов выявляются морфологические признаки плацентарной недостаточности.
При спонтанных, индуцированных и потенцированных абортах по сравнению с физиологической беременностью на 8-й день гестации ниже уровень продукции ИФН- и выше – противовоспалительных (ИЛ-4, ИЛ-10) и провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-17). Интенсивная продукция широкого спектра провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-17, ИФН-, ФНО-) сохраняется до 14-го дня беременности.
Теоретическая и практическая значимость исследования:
Полученные экспериментальные данные о морфофункциональных изменениях органов иммунной системы и продукции про- и противовоспалительных цитокинов при спонтанных, индуцированных и потенцированных С7МДП абортах вносят существенный вклад в понимание механизмов иммунозависимого невынашивания беременности.
Разработанные оригинальные воспроизводимые модели индуцированных и потенцированных абортов могут найти применение в доклинической оценке безопасности и эффективности фармакологических средств, планируемых к применению во время беременности.
Экстраполяция на человека данных о морфофункциональном состоянии органов иммунной системы и плаценты при индуцированных абортах с учетом более длительной беременности представляет интерес для акушеров-гинекологов и аллергологов-иммунологов при выявлении иммунологических нарушений, являющихся причиной привычного невынашивания.
Полученные данные об изменениях органов иммунной системы и плаценты после иммуностимулирующего воздействия на материнский организм в ранние сроки беременности могут быть использованы в преподавании иммунологии репродукции, гистологии и цитологии в медицинских и биологических высших учебных заведениях, а также при проведении научных исследований.
Методология и методы исследования:
Методологическую и теоретическую основу исследования составили работы отечественных и зарубежных исследователей в области изучения иммунологии репродукции, функциональной морфологии органов иммунной системы и репродукции человека и животных. В работе были использованы теоретические и экспериментальные методы: общенаучные (описательный, сравнительный, моделирование, статистическая обработка) и специальные (цитологические, гистологические, морфометрические, культуральные, проточная цитофлуориметрия, радиоизотопный анализ).
Положения, выносимые на защиту:
1. Внутрибрюшинное введение иммуномодулятора -гептилгликозида мурамилдипептида
(С7МДП) самкам мышей линии СВА, оплодотворенных самцами линии Balb/c, в ранние
сроки гестации является воспроизводимым способом моделирования иммунозависимого
невынашивания беременности с высоким уровнем эмбриональных потерь.
2. При индуцированных и потенцированных С7МДП абортах по сравнению с
физиологически протекающей беременностью более выражены акцидентальная инволюция
тимуса и гиперплазия Т-зависимой зоны селезенки, повышена пролиферативная активность
лимфоцитов селезенки и снижена их реакция на отцовские антигены, длительно сохраняется
интенсивная продукция провоспалительных цитокинов.
3. В плаценте жизнеспособных плодов у самок с абортами, индуцированными и
потенцированными С7МДП, выявлены морфологические признаки плацентарной
дисфункции: истончение и прерывистость слоя гигантских клеток, снижение объемной доли
плодных сосудов, увеличение трофобласта и дисциркуляторные нарушения в лабиринте.
Степень достоверности и апробация работы
Достоверность полученных данных обусловлена достаточным количеством экспериментальных групп и объемом данных для каждой экспериментальной группы, воспроизводимостью результатов при повторении экспериментов, использованием адекватных методов исследования, современной приборной и программной базы, корректным статистическим анализом, критической оценкой результатов исследования в сравнении с данными современной научной литературы.
Материалы диссертации были доложены на Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2010, 2012 гг.), V Международной научно-практической конференции молодых ученых «SCIENCE4HEALTH 2013» (Москва, 2013 г.), Международной научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2014 г.), научной конференции с международным участием «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2016 г.), межлабораторной конференции ФГБНУ «НИИ морфологии человека» (19 мая 2017 г.).
Личное участие автора заключалось в проведении экспериментов, статистической обработке, анализе и обобщении полученных результатов, подготовке публикаций.
Публикации
По материалам диссертационной работы опубликовано 11 научных работ, из них 4 статьи в журналах, входящих в Перечень ВАК РФ рецензируемых научных изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук, и 7 публикаций в сборниках и материалах конференций. Получен 1 патент на изобретение.
Внедрение результатов работы
Основные результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов».
Модели индуцированных и потенцированных С7МДП абортов используются в научных исследованиях ФГБНУ «НИИ морфологии человека».
Объём и структура работы
Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 226 российских и зарубежных источников, в том числе 29 российских и 197 зарубежных. Работа иллюстрирована 35 рисунками и 13 таблицами.
Роль реакций врожденного и адаптивного иммунитета в патогенезе язвенного колита
Толстая кишка – терминальный отдел желудочно-кишечного тракта, в котором завершаются процессы переваривания пищи, всасываются вода и ионы, формируются каловые массы. В целом у человека и мыши толстая кишка имеет сходное строение. В ней выделают 3 отдела: слепую, ободочную и прямую кишку. Стенка всех отделов толстой кишки устроена единообразно и состоит из слизистой оболочки (СО), выстланной однослойным призматическим эпителием, подслизистой основы (ПО), мышечной оболочки, состоящей из кольцевого и продольного слоев мышечных клеток, и серозной оболочки. Сравнительная анатомическая и гистологическая характеристика толстой кишки у человека и мыши детально описана в книге P.M. Treuting et al. ( 2012)
Слепая кишка – начальный отдел толстой кишки, представляет собой мешок, в который открывается подвздошная кишка. На границе подвздошной и слепой кишки расположен илеоцекальный клапан. У человека слепая кишка относительно короткая, имеет слепо замкнутый вырост – червеобразный отросток, в стенке которого расположено большое количество лимфоидных узелков. У мышей слепая кишка составляет до трети длины всей толстой кишки, содержит большое количество бактерий, ферментирующих остатки пищи. Бактерии синтезируют свободные жирные кислоты, витамины К, группы В и некоторые другие. Червеобразный отросток у мышей отсутствует, но есть скопление лимфоидных узелков в узкой апикальной зоне слепой кишки.
Ободочная кишка – наиболее длинный отдел толстой кишки, расположенный между слепой и прямой кишкой. Ободочную кишку человека разделяют на восходящую, поперечную, нисходящую и сигмовидную. У мыши деление ободочной кишки на отделы несколько иное, а именно: выделяют проксимальный отдел, который поднимается из правой подвздошной области к желудку, где переходит в короткий поперечный отрезок – медиальный отдел, и далее идет дистальный отдел, переходящий в прямую кишку. У людей продольный мышечный слой слепой и ободочной кишки образует три отдельные продольные ленты – taenia coli. Эти ленты короче, чем остальные слои толстой кишки, в связи с чем между лентами образуются складки – гаустры. В толстой кишке мышей taenia coli и гаустры отсутствуют, продольный мышечный слой равномерно распределен по окружности кишки. У человека СО по всей длине ободочной кишки образует поперечные складки, которые в дистальном направлении становятся более выраженными. У мыши СО слепой кишки и проксимальной части ободочной кишки образует поперечные складки, в медиальном отделе она гладкая, а в дистальном – формирует продольные складки.
Прямая кишка у человека имеет длину около 12 см, заканчивается в зоне зубчатой линии, где переходит в анальный канал длиной 2-3 см с 5-10 продольными складками СО, которые называются колонны Морганьи. Прямая кишка у мышей очень короткая, всего 1-2 мм, СО толстой кишки резко переходит в СО анального канала, выстланную плоским эпителием (Treuting P.M. et al., 2012).
Помимо деления на слепую, ободочную и прямую кишку, также выделяют правую и левую толстую кишку. Правый отдел толстой кишки человека состоит из червеобразного отростка, слепой, восходящей ободочной и части поперечной ободочной кишки, расположенной до срединной линии живота, что примерно соответствует у мыши слепой кишке и проксимальной части ободочной кишки. Левый отдел толстой кишки у человека начинается в зоне поперечной ободочной кишки, спроецированной на срединную линию живота, включает нисходящую ободочную и прямую кишку, заканчивающуюся анальным отверстием. Левый отдел толстой кишки человека соответствует медиальному и дистальному отделам толстой кишки мыши (Treuting P.M. et al., 2012). Деление толстой кишки на левый и правый отделы связано с разной частотой возникновения и особенностями течения воспалительных и опухолевых заболеваний в этих отделах. Так, при язвенном колите на начальной стадии, как правило, поражается дистальный отдел толстой кишки, а затем патологический процесс постепенно распространяется в проксимальном направлении (van der Post S., Hansson G.C., 2014). Известно, что левый и правый отделы толстой кишки различаются по источнику развития, экспрессии генов, кровоснабжению, метаболизму, абсорбционной активности, количественному и качественному составу микрофлоры. Так правый отдел у млекопитающих образуется из дистальной половины эмбриональной средней кишки, и кровь в него поступает по верхней брыжеечной артерии, а левый отдел развивается из задней кишки и кровоснабжается из нижней брыжеечной артерии (van der Post S., Hansson G.C., 2014). В правом отделе толстой кишки у человека капиллярная сеть многослойная, а в левом – однослойная (Iacopetta B., 2002). Правый и левый отделы различаются по уровню экспрессии более чем 1000 генов, ряду белков плазматической мембраны, метаболизму глюкозы, полиаминов и масляной кислоты, концентрации желчных кислот (Glebov O.K. et al., 2003; van der Post S., Hansson G.C., 2014). В направлении от восходящей ободочной кишки к сигмовидной снижается интенсивность всасывания воды и ионов (Fukuda S. et al., 1986), возрастают показатель рН (Evans D.F. at al., 1988) и апоптотический индекс эпителиальных клеток (Liu L.U. et al., 1999). По сравнению с левым отделом, в правом выше экспрессия белков теплового шока HSP25, HSP70, тол-подобного рецептора TLR2 и ниже – TLR4, причем такое распределение экспрессии определяется составом микрофлоры (Hu S. et al., 2010; Wang Y. et al., 2010).
Стенка толстой кишки и у человека, и у мыши состоит из СО, продольного и кольцевого мышечных слоев и покрыта серозной оболочкой. У обоих видов млекопитающих СО выстлана однослойным призматическим эпителием, формирующим трубчатые железы, ориентированные перпендикулярно поверхности СО – крипты Либеркюна. Основными эпителиальными клетками толстой кишки являются столбчатые всасывающие колоноциты, бокаловидные и энтероэндокринные (ЭЭК) клетки (Treuting P.M. et al., 2012). Кроме них в состав эпителия входят стволовые и прогениторные клетки, М-клетки, а также малочисленные tuft-клетки, функция которых еще не вполне ясна (Noah T.K. et al., 2011). Клетки Панета у человека встречаются в червеобразном отростке и слепой кишке, но, как правило, отсутствуют в нижележащих отделах толстой кишки. У мышей в СО толстой кишки клеток Панета нет (Treuting P.M. et al., 2012). Собственная пластинка слизистой оболочки (СПСО) у человека и мыши содержит капилляры и лимфатические сосуды, а также лимфоциты и плазматические клетки. Присутствуют как диффузно распределенные лимфоциты, так и их скопления в виде кластеров и лимфоидных узелков. Лимфоидные узелки могут располагаться в СПСО, в ПО или проходить через мышечную пластинку, занимая одновременно и СПСО, и ПО. Эозинофилы, тучные клетки и макрофаги являются нормальными компонентами СПСО, но их количество меньше, чем лимфоцитов и плазматических клеток. В норме в СПСО толстой кишки выявляется небольшое количество диффузно рассеянных нейтрофилов (Treuting P.M. et al., 2012).
ПО отделена от СПСО мышечной пластинкой, состоящей из 2-3 рядов гладкомышечных клеток. В ПО у человека много жировой ткани, которая отсутствует у мышей.
Мышечная оболочка у человека и мыши состоит из внутреннего кольцевого и внешнего продольного слоев. Энтеральная нервная система у обоих видов представлена нервными ганглиями и связанными с ними нервными волокнами, которые формируют подслизистой (мейснерово) и межмышечное (ауэрбахово) нервные сплетения (Treuting P.M. et al., 2012).
Таким образом, толстая кишка мыши и человека имеет общий план строения, но есть различия (Табл. 1), которые следует учитывать при экстраполяции данных с экспериментальных животных на человека.
Заключение к обзору литературы
Показано, что ЭКК могут выступать в роли непрофессиональных антигенпрезентирующих клеток. ЭКК экспрессируют неклассические молекулы MHC класса Ib и костимулирующие молекулы семейства B7. ЭКК преимущественно активируют CD8+ регуляторные Т-клетки. В этом процессе ключевую роль играет уникальный комплекс, образованный GP-180 (гликопротеином семейства CEA) и CD1d (неклассические молекулы MHC), которые связываются соответственно с CD8 и Т-клеточным рецептором (TCR) на поверхности Т-лимфоцитов. При ЯК наблюдается нарушение экспрессии GP-180, а ЭКК преимущественно стимулируют пролиферацию CD4+ Т-клеток и секрецию интерферона (IFN-) через MHCII (Major Histocompatibility Complex II) (Roda G. et al., 2010).
Не только ЭКК регулируют микрофлору и иммунную систему кишечника, но и они влияют на ЭКК. У мышей, лишенных микрофлоры, снижена толщина слоя слизи, но она восстанавливается после обработки лигандами TLR.. Экспрессия многих антимикробных пептидов усиливается или зависит от присутствия комменсальных бактерий. Транспорт IgA через эпителиальный барьер регулируется, в частности, экспрессией pIgR на базолатеральной мембране ЭКК, которая возрастает при активации NF-B сигнального пути. Активация TLR2 приводит к повышению продукции TFF3. Активные формы кислорода, продуцируемые в ответ на комменсальные или патогенные бактерии, способствуют образованию ЭКК фокальных контактов и их миграции в зону повреждения. Провоспалительные цитокины, такие как IFN и TNF, приводят к реорганизации множества белков плотных контактов, включая ZO-1, окклюдин, клаудины 1 и 4 и другие, и повышению проницаемости плотных контактов. TGF напротив, поддерживает целостность плотных контактов, а также способствует восстановлению эпителия при повреждении (Peterson L.W., Artis D., 2014; Roda G. et al., 2010). К эпителиальному барьеру ободочной кишки можно отнести иммунные клетки, расположенные между или под ЭКК и контактирующие с ними. К таким клеткам относятся межэпителиальные лимфоциты (МЭЛ) и CD11clowF4/80+CX3CR1hi резидентные макрофаги кишечника. МЭЛ – активированные не рециркулирующие Т-лимфоциты, расположенные в эпителиальном пласте и непосредственно контактирующие с ЭКК. МЭЛ гетерогенны и включают лимфоциты с Т-клеточными рецепторами и . В толстой кишке последние преобладают. Большинство МЭЛ содержат цитотоксические гранулы и могут продуцировать эффекторные цитокины, такие как IFN, IL-2, IL-4, IL-17. Для МЭЛ характерна экспрессия рецепторов натуральных киллеров (NK). Большинство МЭЛ экспрессируют гомодимеры CD8. Выделяют натуральные и индуцированные МЭЛ. Индуцированные МЭЛ развиваются из обычных CD4+ или CD8+ TCR+ Т-клеток, приобретают активированный фенотип в ответ на презентацию антигена и являются клетками памяти, участвуют в развитии иммунного ответа на патогены. Натуральные МЭЛ представляют собой TCR+ или TCR+ Т-клетки как CD8+ или CD8–, но не экспрессирующие ни CD4, ни CD8, они реализуют противовоспалительный ответ, поддерживают толерантность к кишечным антигенам, обладают иммунорегуляторными свойствами и поддерживают гомеостаз эпителия (Cheroutre H., Lambolez F., Mucida D., 2011).
CD11clowF4/80+CX3CR1hi резидентные макрофаги кишечника располагаются субэпителиально и контактируют с ЭКК. Они выступают в роли активных фагоцитов, поглощают патогенные и комменсальные бактерии, преодолевающие эпителиальный барьер. Эти макрофаги экспрессируют белки плотных контактов, что позволяет им образовывать трансэпителиальные дендриты, которые проникают в просвет кишечника и захватывают антигены (Peterson L.W., Artis D., 2014).
Таким образом, ЭКК могут распознавать широкий спектр патоген-ассоциированных молекул и регулировать иммунные реакции в СО толстой кишки за счет секреции иммунорегуляторных молекул и контактных взаимодействий с лимфоцитами, макрофагами и дендритными клетками. В норме ЭКК поддерживают толерантность к комменсальной микрофлоре и пищевым антигенам, а при попадании в кишечник патогенов - запускают воспалительный ответ. Нарушение баланса между толерогенными и провоспалительными сигналами в ЭКК может вносить значительный вклад в патогенез ЯК.
ЯК является актуальной проблемой современной медицины. Однако исследование этиологии и патогенеза ЯК на клиническом материале затруднено так как, трудно установить начальные стадии заболевания и точную длительность его течения, а наличие сопутствующей патологии и применение лекарственных препаратов изменяют клиническую картину заболевания. Исследования биопсийного материала позволяют получить информацию только об изменениях СО из нескольких локальных зон толстой кишки. В свою очередь, операционный материал представлен лишь наиболее тяжелыми случаями течения заболевания и его поздними сроками. Кроме того, разработка новых лекарственных средств и методов лечения ЯК требует проведения доклинических испытаний на экспериментальных моделях.
Поэтому для исследования механизмов развития ЯК и доклинической оценки лекарственных средств разработан ряд экспериментальных моделей на животных: химические (тринитробензолсульфоновая кислота, ДСН, оксазолон, уксусная кислота, нестероидные противовоспалительные препараты, каррагинан, пептидогликан-полисахарид), трансгенные (Gat –, 1Ь-Г –, IL-Кґ –, Keratin 8–7–, TCRa –), адаптивного переноса (CD4+ Т cells/SCID, CD3 (Tg26)), спонтанные (СЗН/НеВіг) (Boismenu R., Chen Y., 2000; Randhawa P.K. et al, 2014). Эти модели не отражают всей сложности механизмов заболевания у человека, но они предоставляют широкий спектр возможностей для изучения патогенеза ЯК и оценки различных терапевтических воздействий (Pere М, Сегаг А., 2012). Колит, индуцированный декстрансульфатом натрия
Наиболее широко используемой и адекватной ЯК человека является модель колита, индуцированного ДСН (Randhawa P.K. et al., 2014). Впервые модель ДСН-колита была воспроизведена на хомячках и описана в 1985 году T. Ohkusa et al. В 1990 году I. Okayasu et al. для воспроизведения модели ЯК использовали мышей. В настоящее время только в электронной базе данных PubMed размещено более 2,5 тысяч статей с упоминанием о ДСН-индуцированном колите. Модель технически легко выполнима и характеризуется высокой воспроизводимостью. Добавление мышам в питьевую воду 1-5% ДСН в течение 4-9 дней приводит к индукции острого язвенно-воспалительного процесса, ограничивающегося толстой кишкой. Развитие патологического процесса проявляется диареей с кровью, снижением массы тела и ухудшением общего состояния животных (Randhawa P.K. et al., 2014; Kiesler P., Fuss I.J., Strober W., 2015).
Модель ДСН-индуцированного колита имеет ряд преимуществ по сравнению с другими моделями. Она легко воспроизводима, а начало, длительность и тяжесть воспалительного процесса хорошо контролируемы. Изменяя концентрацию, продолжительность и число курсов потребления мышами ДСН можно моделировать острый, хронический и рецидивирующий колит. При хроническом ДСН-колите в толстой кишке часто наблюдается дисплазия эпителия, характерная для ЯК человека, что позволяет использовать данную модель для изучения процессов канцерогенеза, ассоциированного с колитом. Кроме того, исследование действия традиционных лекарственных средств, используемых в терапии ЯК, на модели ДСН-колита у мышей показывает, что результаты, полученные на модели ДСН-колита, можно экстраполировать на человека (Pere M., Cerar A., 2012).
Несмотря на то, что модель ДСН-индуцированного колита достаточно длительно и широко используется, полностью стандартизовать ее не удается (Табл. 2). У мышей наблюдается различная реакция на ДСН, что связано как с характеристиками самого ДСН (концентрация, молекулярный вес, производитель и партия) и продолжительностью его воздействия, так и с генетическими особенностями животных (линия, пол) и микробиомом кишечника (Pere M., Cerar A., 2012).
Морфометрическое исследование распространенности язвенного и воспалительного процессов в разных отделах ободочной кишки при экспериментальном остром и хроническом колите
Для оценки изменений клеточного состава инфильтрата на окрашенных гематоксилином и эозином продольно ориентированных срезах дистального отдела ободочной кишки на микроскопе Leica DM2500 (Leica Microsystems, Германия) с объективом х100 подсчитывали число нейтрофилов, плазмоцитов и лимфоцитов в СПСО и ПО, рассчитывали среднее число клеток на 1 мм длины среза.
Для оценки количества бокаловидных клеток, их размеров, объемной доли и содержания в них высокосульфатированных и нейтральных муцинов, на микроскопе Axioplan 2 imaging (Carl Zeiss, Германия) с объективом х20 при одинаковых условиях освещения получали снимки гистологических препаратов трех отделов ободочной кишки, окрашенные альциановым синим и реактивом Шиффа после обработки йодной кислотой. Для съемки выбирали участки СО с продольно ориентированными криптами, при колите - без язв и эрозий, но с выраженными морфологическими признаками воспаления. Измерения проводили в программе PhotoM1.21 (freeware, разработчик А. Черниговский, 2000–2001, http://t_lambda.chat.ru/).
Количество бокаловидных клеток определяли как их число на крипту на фотографиях срезов, окрашенных альциановым синим. Размеры бокаловидных клеток оценивали по занимаемой ими площади на фотографиях срезов, окрашенных альциановым синим (50 клеток на каждой фотографии). Объемную долю бокаловидных клеток рассчитывали как процент от площади СПСО и эпителия, занимаемой окрашенными структурами на бинаризованных фотографиях срезов, окрашенных реактивом Шиффа после обработки йодной кислотой. Содержание высокосульфатированных и нейтральных муцинов определяли по интенсивности окрашивания бокаловидных клеток альциановым синим и реактивом Шиффа после обработки йодной кислотой, соответственно. Интенсивность окрашивания рассчитывали как средний десятичный логарифм отношения яркости фона к яркости точки объекта на фотографии. Интенсивность гистохимических реакций значительно варьировала даже в пределах контрольной группы, что связано с различиями в толщине срезов, времени фиксации и окраски. Для нивелирования этих различий, интенсивность окрашивания бокаловидных клеток нормировали по интенсивности окрашивания расположенных рядом участков соединительной ткани.
Для оценки числа ЭЭК, под микроскопом Leica DM2500 (Leica Microsystems, Германия) с объективом х20 на всем протяжении срезов ободочной кишки подсчитывали число хромогранин А-положительных клеток на крипту.
Иммуноферментный анализ (ИФА). Ободочную кишку извлекали из брюшной полости, выделяли медиальный отдел, вскрывали его продольно, промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), разделяли продольно на 2 части, одну часть помещали в 1 мл PBS при температуре 4С. Далее ткань (около 70 мг) гомогенизировали (гомогенизатор TissueLyser LT, Qiagen, Нидерланды) 10 мин при 40Гц, центрифугировали (центрифуга-вортекс CM-70M, ELMI, Латвия) 15 мин при 9000 об/мин. Супернатант замораживали при -70С и хранили не более 3 месяцев. Проводили определение концентрации интерлейкинов IL-2, IL-4, IL-6, IL-17 и интерферона (IFN) в гомогенате ободочной кишки методом иммуноферментного анализа с помощью наборов фирмы eBioscience (США) согласно приложенной инструкции. Концентрацию цитокинов нормировали на общее содержание белка в каждой пробе, определяемое УФ-методом с помощью спектрофотометра BioSpec-nano (Shimadzu, Япония).
Полимеразная цепная реакция в реальном времени. Методом ПЦР после обратной транскрипции в режиме реального времени определяли уровень экспрессии мРНК цитокинов IL1, IL2, IL4, IL6, IL10, IL12p40, IL17, IFN, TGF, муцинов 1, 2, 3, 13, белков плотных контактов клаудинов 2 и 4 относительно уровня экспрессии мРНК -актина.
Оставшуюся при подготовке к ИФА-исследованию вторую половину медиального отдела ободочной кишки помещали в 1 мл лизирующего раствора Trizol RNA Prep 100 (Isogene Lab.ltd, Россия). Ткань (около 70 мг) гомогенизировали (гомогенизатор TissueLyser LT, Qiagen, Нидерланды) 5 мин при 40Гц, оставляли при комнатной температуре на 15-20 минут, центрифугировали (центрифуга-вортекс CM-70M, ELMI, Латвия) 10 мин при 9000 об/мин, супернатант переносили в чистую микропробирку. Пробы замораживали и хранили при -70С.
Пробы размораживали при комнатной температуре, забирали для исследования половину содержимого (500 мкл), добавляли в него по 100 мкл хлороформа, тщательно перемешивали и оставляли на 10 мин при комнатной температуре до разделения фаз. Пробирки центрифугировали при 16100 об./мин (Центрифуга 5415R, Eppendorf, Германия) 20 мин при 4С. Верхнюю водную фазу аккуратно, не задевая интерфазу, переносили в чистую микропробирку.
К водной фазе добавляли по 250 мкл 100% изопропанола, тщательно перемешивали, помещали в холодильник -20С на 15-20 мин. Центрифугировали при 16100 об./мин 20 мин при 4С. Аккуратно, не нарушая осадок, убирали супернатант. К осадку добавляли 500 мкл 70% этанола на воде свободной от РНКаз (Ambion Nuclease-Free Water not DEPCreated, Thermo Fisher Scientific, США). Затем перемешивали и центрифугировали при 16100 об./мин 15 мин при 4С. Промывку этанолом повторяли.
Осадок подсушивали в открытых пробирках при 37С и растворяли в 50 мкл воды свободной от РНКаз, прогревали пробу при +56С 10 мин. Замораживали и хранили при -70оС. Отбирали аликвоты для измерения концентрации РНК и оценки качества ее выделения. Определение концентрации РНК и чистоты образца спектрофотометрическим методом. С помощью спектрофотометра BioSpec-nano (Shimadzu, Япония) определяли оптическую плотность (OD) в пробах при 260, 280 и 230нм (максимумы поглощения нуклеиновых кислот, белков и полисахаридов, соответственно). Концентрацию РНК рассчитывали по формуле [РНК мкг/мл]=40 OD2б0. В среднем концентрация РНК в пробах была 0,4 мкг/мл. Загрязненность препаратов определяли по следующим критериям (Табл. 5):
Морфологическое и морфометрическое исследование бокаловидных клеток в разных отделах ободочной кишки в норме и при экспериментальном остром и хроническом колите
При гистологическом исследовании продольных срезов проксимального, медиального и дистального отделов ободочной кишки у мышей контрольной группы эпителиальная выстилка сохранена на всем протяжении СО. Крипты были глубокие, их просветы узкие (рис. 7 А-В). СПСО и ПО содержали небольшое количество равномерно распределенных клеточных элементов – фиброцитов, фибробластов, лимфоцитов и единичных гистиоцитов (рис. 7 Г, Д). Мышечная пластинка представлена 1-2 слоями гладкомышечных клеток. Лимфатические сосуды ПО были с узким щелевидным просветом. В СО, преимущественно в СПСО, выявлялись лимфоидные узелки, часть их была со светлыми центрами (рис. 7 Е). Мышечная оболочка состояла из кольцевого и продольного слоев гладкомышечных клеток. В ПО и мышечной оболочке выявлялись четко очерченные ганглии соответственно подслизистого и межмышечного нервных сплетений. Серозная оболочка была представлена тонким слоем рыхлой волокнистой соединительной ткани и выстлана плоским мезотелием.
На 7-ые сут. эксперимента морфологическая картина ободочной кишки была мозаичной (рис.8). Наиболее выраженные патологические изменения в ободочной кишке были представлены обширными, распространяющимися до мышечной пластинки язвами (рис.8 А, рис.9 А, Г). На поверхности язв выявлялись скопления нейтрофилов и лейкоцитов, дно язв было представлено грануляционной тканью с большим количеством фибробластов, фиброцитов, лимфоцитов, нейтрофилов и макрофагов. На поверхности краев язв выявлялись признаки реэпителизации: грануляционная ткань была выстлана однослойным кубическим эпителием. Лимфатические сосуды СПСО и ПО были расширены, в ПО наблюдалась выраженная воспалительная инфильтрация преимущественно из лимфоцитов и нейтрофилов, а также единичных макрофагов и плазмоцитов. Края язв были представлены криптами с пролиферирующим эпителием: эпителиальные клетки высокие призматические, с крупным ядром с ядрышками и многочисленными митозами. Бокаловидные клетки в этих криптах не выявлялись. В СПСО, особенно ее базальном отделе, и в ПО была выраженная воспалительная инфильтрация из лимфоцитов, нейтрофилов, единичных макрофагов и плазмоцитов. Лимфатические сосуды СО были расширены (рис.8 Б).
В зонах с сохраненной эпителиальной выстилкой и криптами выявлялись участки с выраженной воспалительной инфильтрацией базального отдела СПСО и слабой – ПО. В этих участках число бокаловидных клеток было резко снижено, а их размеры увеличены. Лимфатических сосуды были расширены (рис.8 В, рис.9 В, Д). В проксимальном отделе ободочной кишки выявлялись участки СО, которые при микроскопическом исследовании не отличались от таковых у мышей контрольной группы.
В области язв отмечался очаговый фиброз СПСО (рис. 12 Б, Д). В области выраженных язвенных и воспалительных изменений СО встречались единичные крипт-абсцессы (рис.9 Б). На всем протяжении ободочной кишки в СО, преимущественно в СПСО, выявлялись лимфоидные узелки, часть из них была со светлыми центрами (рис.9 Е). В мышечной и серозной оболочках и нервных ганглиях признаков воспаления не наблюдалось.
На 28-ые сут. выявлялась морфологическая картина хронического колита (рис.10). Отмечалось небольшое количество эпителизирующихся язв (рис.10 А, рис. 11 А). Язвы были не обширные, щелевидной или пирамидальной формы: в поверхностных отделах края язв практически смыкались, в базальном направлении язвенный дефект был расширен и около мышечной пластинки плавно переходил в инфильтрат базальной части СПСО, распространяющийся на значительное расстояние вокруг самой язвы. Поверхность язв была выстлана кубическим эпителием, дно было представлено грануляционной тканью, в которой определялись фибробласты, фиброциты, лимфоциты и плазмоциты. В краях язв крипты были деформированы со сниженным по сравнению с нормой числом бокаловидных клеток. ПО инфильтрирована, преимущественно, плазмоцитами и лимфоцитами, просветы лимфатических сосудов были расширены.
На большем протяжении ободочной кишки наблюдалась воспалительная инфильтрация СПСО, особенно ее базального отдела, и ПО плазмоцитами, лимфоцитами, и единичными нейтрофилами и макрофагами; деформация крипт, заполнение их просветов слизью. Число бокаловидных клеток было увеличено. Лимфатические сосуды СПСО и ПО были расширены (рис.10 Б, рис. 11 А). Наряду с зонами, где воспалительные изменения были выраженными, определялись участки без воспалительных изменений (рис.10 В, рис.11 В).
В медиальном отделе ободочной кишки у 1-ого из 7-ми животных выявлена очаговая дисплазия эпителия (рис.11 Г, Д).
Отмечался очаговый фиброз базальной части СПСО и мышечной оболочки (рис.12 В, Е). На всем протяжении ободочной кишки в СО, преимущественно в СПСО, выявлялись лимфоидные узелки, часть их них была со светлыми центрами (рис. 11 Е). В мышечной и серозной оболочках и нервных ганглиях, как и при остром колите, признаков воспаления не наблюдалось.
Таким образом, у половозрелых самцов мышей C57BL/6 острый колит, индуцированный 1% раствором ДСН, характеризуется обширными острыми язвами, воспалительной инфильтрацией СПСО и ПО, представленной преимущественно нейтрофилами и лимфоцитами, единичными крипт-абсцессами, снижением числа бокаловидных клеток. При хроническом колите наблюдаются деформация крипт, расширение их просветов и заполнение слизью, гиперплазия бокаловидных клеток, небольшое число эпителизирующихся язв, выраженная воспалительная инфильтрация преимущественно базального отдела СПСО лимфоцитами, плазмоцитами и единичными нейтрофилами, очаговый фиброз базального отдела СПСО и мышечной оболочки. У 1-ого из 7-ми животных выявлена очаговая дисплазия эпителия.