Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1: Обзор литературы 12
1.1. Строение глаза и слезной железы млекопитающих 12
1.2. Важнейшие офтальмологические заболевания человека 26
1.3. Моделирование глазных заболеваний человека .
1.3.4. Моделирование отслоения сетчатки 40
1.3.4. Моделирование светового повреждения сетчатки и возрастной макулярной дегенерации
1.3.5. Моделирование синдрома «сухого глаза». Возрастные изменения слезного аппарата крыс
подходы к восстановлению тканей глаза после
1.3.1. Основные подходы к моделированию глазных заболеваний
1.4. Основные повреждения .48
1.5. Заключение 50
ГЛАВА 2: Материалы и методы 51
2.1. Реактивы и оборудование, использованные в работе .51
2.2. Животные 52
2.3. Экспериментальные группы 53
2.4. Органотипическое роллерное культивирование заднего сегмента глаза 57
2.5. Приготовление и анализ экстрактов сетчатки .59
2.6. Световое повреждение сетчатки с использованием модели LIRD 59
2.7. Определение объема слезы с помощью теста Ширмера 60
2.8. Гистологические и гистохимические методы 60
2.9. Иммуногистохимическое выявление белков 2.10. Метод TUNEL. 61
2.11. Морфометрический анализ и статистическая обработка результатов 61
ГЛАВА 3: Результаты
3.1. Системная оценка жизнеспособности клеток сетчатки в составе заднего сегмента глаза крысы c помощью комплекса методов 63
3.2. Моделирование ишемического повреждения тканей в составе заднего сегмента глаза крыс-альбиносов ex vivo .70
3.3. Моделирование отслоения сетчатки и исследование реакций ее пигментного эпителия у крыс ex vivo 84
3.4. Моделирование светового повреждения сетчатки крыс-альбиносов и пигментированных кроликов in vivo с помощью метода LIRD 103
3.5. Моделирование синдрома «сухого глаза» у крыс in vivo 118
ГЛАВА 4: Обсуждение результатов
4.1. Ишемическое повреждение тканей глаза 134
4.2. Отслоение сетчатки и метаплазия ПЭС под действием различных факторов 138
4.3. Световое повреждение сетчатки глаза . 146
4.4. Возрастные повреждения слезной железы и синдром «сухого глаза» 151
Заключение 155
Выводы 156
Список литературы
- Моделирование глазных заболеваний человека
- Экспериментальные группы
- Моделирование ишемического повреждения тканей в составе заднего сегмента глаза крыс-альбиносов ex vivo
- Световое повреждение сетчатки глаза
Моделирование глазных заболеваний человека
Нейральная часть сетчатки, которую традиционно и понимают под словом «сетчатка» и которую мы в дальнейшем будем именовать сетчаткой, выполняет ее основную функцию – восприятие формируемого оптикой глаза изображения и преобразование его в нервное возбуждение. Это высокоорганизованная нервная структура, состоящая более чем из 60 типов нейронов, послойно расположенных между стекловидным телом и ПЭС [Guo et al., 2014]. Она находится полностью в пределах заднего сегмента глаза. В сетчатке расположены три первых нейрона зрительного анализатора: фоторецепторы (первый нейрон) – палочки и колбочки, биполярные клетки (второй нейрон) и ганглиозные клетки (третий нейрон). Вспомогательными элементами служат горизонтальные и амакриновые клетки [Vzina, 2013]. Все нейроны сетчатки организованы в сложную сеть и объединены между собой колоссальным количеством контактов [Guo et al., 2014]. Сетчатка по происхождению является частью головного мозга и связана с ним посредством зрительного нерва. [Heavner, Pevny, 2012; D Onofrio, Koeberle, 2013]. Благодаря своим уникальным свойствам «мозга на периферии», сетчатка глаза млекопитающих служит прекрасной моделью для исследования биохимических процессов, а также механизмов развития и функционирования нервной ткани в норме и при патологических состояниях [Филиппов и соавт., 1987; Jones et al., 2005; London et al., 2013]. сегент Фоторецепторные нейроны (палочки и колбочки) представляют собой рецепторную часть зрительного анализатора и находятся в наружных слоях сетчатки, непосредственно взаимодействуя с ПЭС [Самаль, 2004; Егоров, Басинский, 2007]. Морфологически они представляют собой длинные цилиндрической формы клетки, которые имеют несколько отделов. Светочувствительные отделы фоторецепторных нейронов состоят из внутреннего и наружного сегментов, причем фотохимические процессы, отвечающие за световосприятие, сосредоточены в наружном сегменте, взаимодействующем с ПЭС. Внутри наружного сегмента находятся зрительные пигменты, встроенные в многочисленные (до 1000 в одной клетке) мембранные диски. Внутренний богат митохондриями и компонентами белоксинтезирующего аппарата клетки. Наружный сегмент связан с внутренним ножкой-цилией. [Филиппов и соавт., 1987; Афанасьев и соавт., 2012].
Традиционно с точки зрения гистоморфологии в нейральной части сетчатки выделяют девять слоев (см. рис. 1), среди них наиболее склерально расположен слой фоторецепторов. Более витреально в сетчатке находятся ядерные слои (наружный и внутренний), состоящие из перикарионов нейронов с ядрами. Они перемежаются сетчатыми (плексиформными) слоями, которые сформированы из отростков нейронов и образуемых на них синапсов [Klintworth, Landers, 1976; Рыков, 1982]. Самыми близкими к стекловидному телу нервными клетками сетчатки являются крупные нейроны – ганглиозные клетки (ганглиозный слой), чьи аксоны формируют слой нервных волокон. Заметим, что элементы одной и той же клетки сетчатки располагаются в разных морфологических ее слоях: так, светочувствительные сегменты фоторецепторных клеток образуют фоторецепторный слой (ФС), перикарионы и ядра тех же клеток – НЯС, и, наконец, аксоны фоторецепторов формируют наружный сетчатый слой сетчатки (НСС). Зачастую в работах по физиологии и патологии сетчатки совокупность ПЭС и слоев, включающих фоторецепторные клетки, т.е. ФС и НЯС, называют наружной сетчаткой, а расположенные более витреально слои – внутренней сетчаткой [Taradach, Greaves, 1984; Логвинов и соавт, 2006; Pikuleva, Curcio, 2014]. Аксоны всех ганглиозных клеток сетчатки собираются в конечном итоге у заднего полюса глаза в зрительный нерв. Начальная часть его, находящаяся внутри глазного яблока и видимая при офтальмоскопии на глазном дне, называется диском зрительного нерва (ДЗН) [Егоров, Басинский, 2007]. В этой области толщина сетчатки минимальна, а фоторецепторные клетки отсутствуют, поэтому в поле зрения соответственно месту проекции ДЗН имеется слепая зона (слепое пятно) [Копаева, 2002; Сомов, 2005; Афанасьев и соавт., 2012].
Глиальная популяция в сетчатке, представлена, прежде всего, мюллеровскими клетками, образующими радиальную глию сетчатки [Школьник-Яррос, Калинина, 1986; Klintworth, Cummings, 2012] и микроглией [Chen et al., 2002; Karlstetter et al., 2015]. Клетки радиальной глии простираются от витреальной границы сетчатки до фоторецепторного слоя, где окончания мюллеровских клеток соединяются с нейронами сетчатки с помощью густой сети синаптических комплексов [Григорян, 2001], которая образует на наружной и внутренней границах сетчатки, наружную и внутреннюю пограничную мембраны, соответственно. Что касается клеток глии обычного типа, например, микроглии, то они встречаются в ганглиозном слое и слое нервных волокон [Сомов, 2005] и способны при патологических состояниях активироваться, мигрировать внутри сетчатки и фагоцитировать погибающие нейроны сетчатки [Chen et al., 2002].
Сетчатка – достаточно консервативный элемент глаза млекопитающих: число ее слоев, как и их клеточный состав, меняются в процессе эволюции очень мало [Дондуа, 2004]. Однако строение сетчатки млекопитающих и вообще позвоночных животных при едином плане в некоторых деталях значительно варьирует [Андреев, 1992]. Сетчатка разных млекопитающих отличается по толщине. Толщина и строение сетчатки грызунов [Агафонов и соавт., 2009]и кроликов [Davis, 1929] практически одинаковые на всем протяжении, за исключением участков вблизи ДЗН и зубчатого края, при этом среди грызунов и зайцеобразных наблюдается обратная зависимость между размером животного и толщиной его сетчатки: у мыши сетчатка имеет наибольшую (240 мкм), а у кролика наименьшую (120 мкм) среднюю толщину, сетчатка крысы занимает среднюю позицию в указанном ряду [Davis, 1929; Rodriguez-Ramos Fernandez, Dubielzig, 2013]. Толщина сетчатки человека различается в разных областях, составляя от 70 до 400 мкм, в среднем составляя 250 мкм [Alamouti, Funk, 2003; Егоров, Басинский, 2007].
В зависимости от времени суточной активности, млекопитающие обладают неодинаковым соотношением палочек и колбочек в сетчатке: дневные виды (приматы, в том числе человек) имеют максимальное количество колбочек (6-7% от общего количества фоторецепторов), сумеречные (кролик) – среднее (5%) [Андреев, 1992] и, наконец, ночные (мышь, крыса) – минимальное ( 3%) [Carter-Dawson, LaVail, 1979; Peichl, 2005; Mustafi et al., 2009].
Экспериментальные группы
Приготовление и анализ экстрактов сетчатки. Экстракты сетчатки тритонов (n=30) и крыс (n=15) получали по методу, описанному в работе [Маргасюк и соавт., 2005], используя лизирующий буфер (pH=8,3) следующего состава: 0,15 М NaCl, 1 мM CaCl2, 5 мM KCl, 1 мM HEPES; перед добавлением к культуральной среде экстракты фильтровали, используя фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Концентрацию белка в экстрактах определяли, используя анализ на основе бицинхониновой кислоты (BCA) или спектрофотометрический метод [Северин, Соловьева, 1989]. Наличие FGF2 в экстрактах сетчатки крыс и тритонов выявляли с помощью вестерн-блоттинга, проверку пригодности антител против FGF2 проводили методом множественного выравнивания аминокислотных последовательностей факторов роста FGF2 крысы, человека и быка с помощью алгоритма muscle.
Световое повреждение сетчатки с использованием модели LIRD. Глаза крыс и кроликов облучали ярким светом согласно модели LIRD, используя собственные модификации и комбинации описанных вариантов этой модели [Noell et al., 1966; Lawwill, 1973; McKechnie, Foulds, 1978; McKechnie, Foulds, 1980; McKechnie, Foulds, 1981; Stone et al., 1999]. До освещения животные были адаптированы к темноте в течение 12 часов. Источником видимого света высокой интенсивности во всех случаях служила металлогалогеновая лампа NC-DE 70W/DW RX7s (мощность 70W, световой поток 5000-5500 люмен, цветовая температура 4000К). Крыс облучали, позволяя им свободно передвигаться по клетке. Источник света при этом располагали на расстоянии двух метров от клеток с крысами, что давало интенсивность освещения сетчатки, равную 2500-3000 люкс. Кроликов перед проведением эксперимента анестезировали (15 мг/кг Золетила 100 внутримышечно), затем их глаза облучали лампой, располагая ее в 30 см от открытых глаз кроликов, что обеспечивало освещенность 6000 люкс. Во время освещения зрачки глаз расширяли повторными инстилляциями капель атропина сульфата (1%) и фенилэфрина (10%), роговицу увлажняли фосфатным буфером (PBS, pH=7,4). таке определяли ассу тела ивотного, после чего для кадой крс 60 2.7. Определение объема слезы с помощью теста Ширмера. У молодых и старых самцов крыс выясняли объем выделяемой в покое слезы с помощью одной из модификаций теста Ширмера [Williams, 2007]. Для этого концы стерильных белых хлопковых нитей смачивали в 0,1% растворе красителя метиленового синего так, что длина смоченного участка на каждой нити составляла 3 мм. Под частичным наркозом во внутренний угол глаза под веко животного помещали окрашенный конец нити. Через одну минуту измеряли длину окрашенного участка, также определяли массу тела животного, после чего для каждой рассчитывали коэффициент слезовыделения s = т Где l1 и l0 – конечная и начальная длина окрашенного участка нити, соответственно, а m – масса животного.
Гистологические и гистохимические методы. Для фиксации препаратов использовали 10% раствор формалина на фосфатном буфере (pH=7,4) или смеси Буэна и Карнуа, после чего использовали криотом либо подвергали препараты гистологической обработке, включающей обезвоживание в изопропиловом спирте и заливку правильно ориентированных образцов в парафин. Из парафиновых блоков получали срезы толщиной 4-7 мкм через различные области задних сегментов глаз, от их периферии до места выхода зрительного нерва, и продольные срезы через центральные области слезных желез. Закрепленные на предметных стеклах срезы окрашивали соответственно одной из следующих методик: гематоксилином Караччи и эозином, метиловым зеленым и пиронином по методу Браше, альциановым синим, ШИК в модификации Мак-Мануса, сафранином О и прочным зеленым, по методам Ван Гизона, Маллори и Массона (парафиновые срезы) или суданом III (замороженные срезы). После окрашивания образцы дегидратировали и заключали под покровные стекла. Все гистологические процедуры проводили, как указано в руководствах по гистотехнике Меркулова [Меркулов, 1969] и Kiernan [Kiernan, 2008]. 2.9. Иммуногистохимическое выявление белков PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) или цитоплазматического антигена макрофагов либо 3-тубулина выполняли в криосрезах заднего сегмента глаз крыс, которые закрепляли на стеклах, покрытых поли-L-лизином. Вначале проводили пермеабилизацию 0,5% раствором Тритона-X100 на PBS, затем – блокировку в 5% растворе BSA на PBS в течение ночи при температуре +4 С. Далее образцы инкубировали c раствором, содержащим первичные антитела против PCNA в разведении 1:300 или антитела против антигена макрофагов в разведении 1:100 либо антитела к 3-тубулину в разведении 1:200 и 0.01% Tween20 на PBS в течение часа (все антитела мышиные), затем отмывали от раствора первичных антител и инкубировали с раствором, содержащим вторичные козьи антимышиные FITC-конъюгированные антитела в разведении 1:100 на PBS. Между всеми шагами образцы трижды в течение 5 минут отмывали PBS. Готовые препараты заключали в среду Moviol. В качестве контроля использовали ту же схему без добавления первичных антител.
Метод TUNEL. Выявление ядер с олигонуклеосомной деградацией хроматина проводили методом TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) согласно инструкции к коммерческому набору, содержащему FITC-конъюгированный биотин, в парафиновых срезах задних сегментов глаз. Срезы дополнительно окрашивали для визуализации ядер пропидий йодидом в концентрации 40 мкг/мл, после чего препараты заключали в среду Moviol.
Морфометрический анализ и статистическая обработка результатов. Микрофотографии получали с использованием цифровой камеры высокого разрешения AxioCam MRc5, установленной на микроскопе AxioScope A.1. Просмотр и обработку микрофотографий, добавление к ним шкал и морфометрические измерения выполняли, используя программное обеспечение AxioVision 8.0. На предварительно зашифрованных препаратах измеряли следующие параметры: ширину сетчатки, количество клеток ПЭС и сетчатки с различными морфологическими маркерами (признаками митоза, гибели или миграции из слоя, TUNEL-позитивностью), ширину наружного ядерного слоя сетчатки (НЯС) и площадь его атрофии, а также высоту внутренних сегментов фоторецепторов. Полуколичественным методом (в баллах) определяли тяжесть возрастных изменений в экзорбитальной слезной железе. Статистический анализ полученных результатов проводили в соответствии с правилами получения репрезентативных выборок генеральных совокупностей для биологических объектов [Автандилов, 1990]. Результаты обрабатывали, получая средние величины и стандартные отклонения и определяя наличие статистически значимой разницы средних величин выборок с помощью двустороннего непараметрического критерия Манна-Уитни или t-критерия Стьюдента на уровне надежности p=0,05. Вычисления и построение графиков проводили с помощью программ MS Office Excel и ORIGIN 8.1.
Моделирование ишемического повреждения тканей в составе заднего сегмента глаза крыс-альбиносов ex vivo
Разрыхление сетчатки в условиях отсутствия внутриглазного давления, а постоянного вращения в роллере, ведет к возрастанию общей толщины увеличению вариабельности ее толщины от препарата к препарату (таблица 4). Причем, внутренний и наружный ядерные слои сетчатки становятся более разрозненными, в них появляются значительные межклеточные пространства, а плексиформные слои теряют сетчатую структуру (рис. 21). При этом прекращают детектироваться отдельные невриты нервных клеток и отростки глиальных клеток (см. рис. 12). Кроме того, наружные сегменты фоторецепторов становятся разрозненными и, в конечном счете, разрушаются, при этом их остатки образуют тяжи в пространстве между слоями ПЭС и нейральной сетчатки (см. рис. 20-21). В этом же пространстве располагаются макрофагоподобные клетки (вероятно, трансформированные клетки ПЭС), фагоцитирующие фрагменты фоторецепторов.
Кальциевый ионофор A23187 и NMDA не оказывают существенного апоптогенного воздействия на сетчатку и другие ткани заднего сегмента глаза крысы в условиях роллерного культивирования.
Для индукции апоптотической гибели ганглиозных клеток в моделях глаукомы и ишемической ретинопатии часто используются химические агенты, например, NMDA и кальциевые ионофоры как сами по себе, так и в ситуациях, где основное повреждение вызывается другими воздействиями, в частности, окклюзией центральной вены сетчатки in vivo [Matini et al., 1997; Shen et al., 2006; Guerin et al., 2011]. С целью усилить альтеративные процессы мы также применили указанные агенты в дополнение к ишемическому повреждению сетчатки крысы, которое достигалось ее роллерным культивированием ex vivo в составе заднего сегмента глаза.
Концентрации, в которых вещества добавляли к культуральной среде, были подобраны согласно рекомендациям для органотипического культивирования сетчатки [Александрова, 2009; Guerin et al., 2011]. При этом 250 мкМ NMDA и 1 мкМ или 5 мкМ A23187 не оказывают существенного дополнительного апоптогенного влияния на сетчатку ни через 24, ни через 72 часа культивирования. Отметим, что степень нейродегенерации и разрыхления сетчатки в присутствии указанных агентов не увеличивается; другие ткани заднего сегмента глаза, в том числе ПЭС, не отвечают на апоптогенное действие этих веществ, вероятно, из-за низкой для органотипической культуры заднего сегмента глаза их концентрации.
Заключая данный раздел (3.2) настоящей работы, можно суммировать его результаты следующим образом. Было показано, что в пределах первых 12 часов роллерного культивирования сетчатка глаза крысы демонстрирует морфологические и гистохимические свойства, присущие этой ткани в норме. После первых суток культивирования существенное число клеток ганглиозного слоя подвергается пикнозу и прекращает синтез РНК. К четвертым суткам культивирования практически все клетки ганглиозного слоя сетчатки находятся в состоянии апоптоза. Следовательно, в ишемических условиях роллерного культивирования нейроны сетчатки в составе заднего сегмента глаза подвергаются спонтанной гибели по апоптотическому пути, при этом в сетчатке происходят нейродегенеративные процессы. Добавление NMDA и ионофора A23187 не усиливает эти явления. Клетки ПЭС в условиях ишемического роллерного культивирования сохраняют жизнеспособность значительно дольше, чем нейроны сетчатки. 3.3. Моделирование отслоения сетчатки и исследование реакций ее пигментного эпителия у крыс ex vivo.
Согласно данным, изложенным в главе 3.2., значительное число клеток ПЭС в условиях органотипического роллерного культивирования по сравнению с нейронами сетчатки, остается жизнеспособным достаточно долгое время (4-7 суток), что позволяет использовать указанный метод для изучения клеточных реакций ПЭС. В этой связи для моделирования и исследования процессов, происходящих в пигментном эпителии и других тканях стенки заднего сегмента глаза при отслоении сетчатки, мы использовали культивирование препаратов с удаленной сетчаткой в течение 7 дней. Такой подход, как нам кажется, позволяет оценивать клеточные реакции в тканях без влияния на них экстравазации крови, вторичных воспалительных и резорбтивных явлений, имеющих место in vivo. Для этого мы удаляли сетчатку из свежевыделенных препаратов заднего сегмента глаза и культивировали полученные образцы, содержащие склеру, хороид и ПЭС, на роллере в отсутствие добавок или в присутствии какого-либо одного из перечисленных факторов: экстракта сетчатки тритона, экстракта сетчатки крысы, FGF2, EGF либо PEDF.
Согласно нашим результатам, описанным в разделе 3.2., роллерное органотипическое культивирование заднего сегмента глаза крысы приводит к постепенной гибели клеток ПЭС, более медленной, чем гибель нейронов сетчатки. Как следствие в контрольных (в отсутствие добавок) препаратах заднего сегмента с удаленной сетчаткой через 7 дней культивирования появляются протяженные участки слоя ПЭС, содержащие гибнущие клетки с пикнотическими ядрами. Кроме этого, в полости препаратов появляются клетки макрофагального фенотипа, демонстрирующие экспрессию макрофагальных белковых маркеров (рис. 22, 23А, 24Б), которые могут происходить как из ПЭС, так и из хороида, хотя в ряде случаев их морфологические признаки, к примеру, двуядерность, указывают на их происхождение этих макрофагов от двуядерного ПЭС (рис. 22Е).
Световое повреждение сетчатки глаза
Одной из задач настоящей работы явилось детальное описание модели, использующей роллерное органотипическое культивирование сетчатки в составе заднего сегмента глаза крысы. При этом основное внимание было уделено ганглиозному слою, в частности, из-за того, что апоптотическая гибель ганглиозных клеток – ключевой этап патогенеза таких тяжелых заболеваний, как глаукома и ишемическая ретинопатия, а также потому, что именно нейроны ганглиозного слоя наиболее серьезно страдают при патологиях зрительного нерва [Xin et al., 2007].
Исследования, выполненные нами с помощью трех разных методов гистологического и гистохимического окрашивания препаратов показали, что в органотипической культуре заднего сегмента глаза крысы происходит быстрая спонтанная апоптотическая гибель ганглиозных клеток и других нейронов сетчатки, включая фоторецепторы. Временные интервалы в процессе культивирования, в которые происходит накопление пикнотичных ядер и TUNEL 134 ГЛАВА 4: ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Предваряя обсуждение полученных нами результатов, заметим, что морфологический материал по офтальмологическим патологиям человека крайне скуден и встречается в основном в старой литературе, поскольку глаз и слезная железа человека не являются тривиальным объектом исследования ни для биопсии, ни для гистологического анализа аутопсийного материала, за исключением случаев энуклеации глазного яблока при травмах и опухолевых поражениях. В связи с этим имеется значительный недостаток морфологического, в том числе и иллюстративного материала в отношении офтальмологической патологии, затрудняющего сравнение происходящих при моделировании повреждения и восстановления тканей глаза in vivo и ex vivo с картиной заболеваний органа зрения у человека. В случае некоторых поражений, таких, как отслоение сетчатки и глаукома, такое сравнение возможно только с привлечением данн х по у е су еству и оделя этого состояния на ивотн х в условиях vivo. существующим моделям этого состояния на животных in позитивных клеток в ганглиозном слое были различны: сначала в большинстве клеток снижалось содержание РНК, позднее в их ядрах конденсировался хроматин, который в конечном счете подвергался необратимой олигонуклеосомной деградации (см. рис. 15-17). Уже через 48 часов культивирования ганглиозные клетки демонстрировали значительный уровень апоптотической гибели, вероятными причинами которой могут быть их аксонотомия, ишемия и (или) трофическая недостаточность.
Нет недостатка в работах, исследующих свойства ганглиозного и других слоев сетчатки позвоночных после перерезания либо ишемического повреждения зрительного нерва in vivo [McKernan et al., 2006; Zhang et al., 2010] и in vitro [La Vail, Hild, 1971]. При этом большинство авторов указывает на повреждение аксонов, образующих зрительный нерв, как на наиболее вероятную причину гибели ганглиозных клеток. Во всех описанных в литературе случаях повреждения зрительного нерва признаки апоптотической гибели ганглиозных клеток (пикноз, появление TUNEL-позитивного окрашивания) возникали не раньше пятых-седьмых суток после операции, что показано как с помощью морфологических методов на светооптическом и электронномикроскопическом уровнях [Barron et al., 1986; Kustermann et al., 2008], так и при помощи метода TUNEL [Zhang et al., 2010]. У крыс и мышей, перенесших повреждение зрительного нерва, все клетки ганглиозного слоя на первые-третьи сутки после операции были жизнеспособными [McKernan et al., 2006; Zhang et al., 2010], в нашем же случае эти клетки демонстрируют существенную гибель ( 41%) уже через двое суток после аксонотомии. Следовательно, причиной гибели нейронов ганглиозного слоя в наших экспериментах является не аксонотомия, а условия культивирования, скорее всего, ишемия и (или) трофическая недостаточность.
В используемом нами подходе к культивированию сетчатки трофическая недостаточность, по-видимому, не играет существенной роли в гибели клеток ганглиозного слоя в первые четверо суток культивирования, поскольку в большинстве случаев, описанных в литературе, наиболее предпочтительной для поддержания жизнеспособности клеток эксплантов сетчатки считается смена культуральной среды один раз в 4-5 дней [La Vail, Hild, 1971]. Следовательно, критического для поддержания жизни нейронов истощения метаболитов до этого срока происходить не должно. Однако отсутствие смены среды в дальнейшем, вероятно, отрицательно влияет на выживаемость оставшихся клеток сетчатки в промежутке между четвертым и десятым днями культивирования. Примечательно, что авторы, сообщавшие о наилучших результатах выживаемости клеток сетчатки, использовали намного больший объем среды культивирования [Koizumi et al., 2007]: 26 мл по сравнению с 5 мл в нашем случае.
В пользу ишемического характера повреждения ганглиозных клеток на ранних стадиях культивирования свидетельствует работа [Bull et al., 2011], в которой показано, что уровень апоптоза ганглиозных клеток в органотипической культуре значительно повышается в ишемических условиях. Аналогично в нашей модели ишемические условия создавались в результате культивирования препаратов заднего сегмента глаза в герметизированных флаконах. Известно, что содержание кислорода во флаконах при культивировании по нашему методу снижается с 20 до 5 % к 30 дню ex vivo [Grigoryan et al., 2013], что, конечно, не может не сказаться на метаболизме таких чувствительных к гипоксии клеток, какими являются нейроны.
Важно отметить, что картина событий, происходящих во время роллерного культивирования, напоминает морфологические проявления глаукомы in vivo у видов, у которых это заболевание возникает спонтанно, в том числе у человека и кошки (рис. 58). При глаукоматозном поражении происходит отек и дезорганизация слоев сетчатки и, что наиболее важно, апоптотическая гибель ганглиозных клеток. Атрофия внутренней сетчатки и разрыхление ее плексиформных слоев возникают и при синдроме окклюзии центральной артерии сетчатки (URL: http://retinagallery.com). Картина поражения сетчатки при органотипическом культивировании сходна с описанной, однако, степень разрыхления сетчатых слоев в нашем случае выше, чем in vivo, за счет физического воздействия вращения в роллере на эти структуры (рис. 58).