Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Общая характеристика мобильных элементов 10
1.2.Ретроэлементы 11
1.3. ДНК- транспозоны 14
1.4. Влияние мобильных элементов на геном 16
1.5. Активность мобильных элементов 20
1.6. Распределение мобильных элементов в геномах эукариот и связь с половым размножением 24
1.7. Описание объекта исследования – Himasthla elongata (Trematoda,
Himasthlidae) 28
Глава 2. Материалы и методы 31
2.1. Сбор животных и выделение ДНК 31
2.2. Определение размера генома H.elongata 31
2.3. Метод S-SAP 32
2.4. Электрофорез в секвенирующем акриламидном и агарозном гелях 33
2.5. Клонирование консервативных и вариабельных фрагментов 34
2.6. Выявление фланкирующих последовательностей
2.7. Дот-гибридизация .35
2.8. Гибридизация по Саузерну с геномной ДНК H.elongata 36
2.9. Получение ядер и метафазных хромосом H. elongata для флуоресцентной гибридизация in situ (FISH) 37
2.10 Комбинированная окраска препаратов хромомицином А3 (CMA3) и DAPI
2.11. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) .39
2.12. Флуоресцентная микроскопия .39
2.13. Секвенирование транскриптома H.elongata .39
2.14. Компьютерные методы анализа 40
ГЛАВА 3. Результаты .41
3.1. Размер генома H.elongata .41
3.2. Генотипирование церкарий методом S-SAP: анализ консервативных и полиморфных фрагментов 43
3.3. Вклад клонированных фрагментов в формирование паттернов S-SAP .48
3.4. Описание кариотипа H. elongata 51
3.5. Распределение найденных мобильных элементов в геноме .56
3.6. Анализ транскриптов, соответствующих клонированным фрагментам .61
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 66
Выводы .77
Список используемой литературы
- ДНК- транспозоны
- Определение размера генома H.elongata
- Получение ядер и метафазных хромосом H. elongata для флуоресцентной гибридизация in situ (FISH)
- Вклад клонированных фрагментов в формирование паттернов S-SAP
Введение к работе
Актуальность проблемы В современной биологии накопление данных существенно опережает их обработку и осмысление. На сегодняшний день количество прочитанных геномов эукариот приближается к десяти тысячам, а проаннотировано чуть более 300 (National Center for Biotechnology Information, NCBI). Эукариотические геномы значительно различаются по размерам и структуре, но одним из общих и характерных их свойств является многообразие и обилие повторяющихся последовательностей (Tollis and Boissinot, 2012). Повторы традиционно принято делить на диспергированные и тандемные в зависимости от их структуры и организации в геноме. К диспергированным повторам относят мобильные элементы, или транспозоны (Transposable elements, TE) — это фрагменты ДНК, способные к перемещению и увеличению числа копий в геноме. На сегодняшний день нет устоявшейся классфикации мобильных элементов, и в настоящей работе использована одна из существующих (Wicker et al., 2007). На основании структуры и механизмов перемещения мобильные элементы делят на два класса, которые состоят из отрядов, суперсемейств и семейств. К классу I относят ретроэлементы. Они используют механизм перемещения «копировать - вставить» и увеличивают число копий в геноме за счет обратной транскрипции посредством РНК-интермедиата. Ретротранспозоны можно условно разделить на элементы, содержащие длинные концевые повторы (Long Terminal Repeats, LTR), и элементы, не содержащие длинные концевые повторы — non-LTR элементы. Наиболее известными отрядами non-LTR элементов являются LINEs (Long Interspersed Nuclear Elements) и SINEs (Short Interspersed Nuclear Elements).
Составляя от 3 до 80 % генома у
разных видов (Brown, 2002),
транспозоны не могут не участвовать в
клеточных процессах. Подавляющее
большинство мобильных элементов
неактивны, но их копии представляют
собой гомологичные
последовательности ДНК, которые
могут участвовать в нерегулярной или
«неразрешенной» рекомбинации,
называемой эктопической.
Транспозоны также влияют на
экспрессию и структуру генов,
являются мишенями для малых РНК,
эпигенетических модификаций,
Рис.1. Жизненный цикл H. elongata по Werding, 1969.А. Марита, B. Мирацидий, C. Редия, D. Церкария, E. Метацеркария.
участвуют в организации структуры хроматина и ответственны за синтении (Abrusan and Krambeck, 2006; Slotkin and Martienssen, 2007). Таким образом, мобильные элементы часто рассматриваются как один из основных факторов нестабильности генома. Перемещения TE выявлены как в половых, так и соматических клетках (Kazazian, 2011). Мозаичность распределения ретропозона LINE-1 в геномах соматических клеток человека (Muotri et al., 2005) и транспозона
Tc1 в клетках Caenorhabditis elegans дают основание говорить о том, что TE способы обеспечивать генетическую изменчивость, не сцепленную с половым процессом. Подходящей моделью для таких исследований являются представители класса Trematoda — одной из наиболее успешных и широко распространенных групп паразитических плоских червей. Трематоды обладают сложным жизненным циклом, который протекает с чередованием гермафродитного и партеногенетических поколений в нескольких животных-хозяевах. Объектом настоящей работы является Himasthla elongatа (Mehlis, 1831, рис. 1) из семейства Himasthlidae (Tkach et al., 2016). Долгое время считали, что особи партеногенетического поколения трематод — редии или дочерние спороцисты, происходящие от одной материнской особи и обитающие в первом промежуточном хозяине, моллюске, равно как и производимые ими расселительные личинки, церкарии, представляют собой генетически идентичные клоны, так как являются продуктом диплоидного (апомиктического) партеногенеза. Тем не менее, на ряде видов трематод с помощью молекулярных методов показали, что у особей партеногенетического поколения имеет место генетический полиморфизм — клональная изменчивость (Grevelding, 1999; Халтурин и др., 2000; Семенова и др. 2005). Остается неясным, какие последовательности генома отвечают за возникновение этой изменчивости, но, согласно некоторым гипотезам, ее источником могут быть мобильные элементы (Семенова и др., 2005; Корсуненко и др., 2009).
Цель и задачи исследования
Цель — выявить изменчивость в геноме партенит H. elongata методом S-SAP и охарактеризовать изменяющиеся последовательности. Задачи:
-
Провести генотипирование партенит H. elongata методом S-SAP и охарактеризовать последовательности из полиморфных и консервативных зон
-
Определить распределение клонированных фрагментов в паттернах генотипирования методом дот-блота.
-
Определить наличие или отсутствие последовательностей клонированных фрагментов мобильных элементов в транскриптоме H. elongata.
-
Изучить распределение найденных клонированных фрагментов в геноме H. elongata методом FISH.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Клональная изменчивость (КИ) показана методами S-SAP и дот-гибридизации на одиночных церкариях трематоды H. elongata. В консервативных зонах располагаются LINE-подобные ретроэлементы, в полиморфных зонах присутствуют спейсерные участки LINEs, а также фрагменты LTR-ретротранспозонов.
-
Обе группы основанных на LINE фрагментов активно транскрибируются и, следовательно, вносят вклад в КИ.
-
Кариотип H.elongata содержит 12 пар хромосом(2n=24), среди которых 3 пары несут ядрышковые организаторы.
-
Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) обнаружила дисперсное распределение тех фрагментов LINE, которые основаны на открытой рамке считывания обратной транскриптазы (RT) и обогащение конститутивного гетерохроматина тем фрагментом, который основан на спейсерных участках LINE.
Научная новизна работы Впервые получены данные о кариотипе H.elongata, выявлен полиморфизм в морфологии хромосом и в их окраске дифференциальными красителями. До настоящего момента кариологические данные какого-либо из видов рода Himasthla отсутствовали. Доказана пригодность метода S-SAP для генотипирования одной личинки, имеющей микроскопические размеры. Подобная техника может применяться и для других объектов с малым количеством материала. Проведена характеристика последовательностей из консервативных и полиморфных зон в полученных методом S-SAP паттернах генотипирования церкарий. Впервые в геноме H.elongata выявлены фрагменты ретроэлементов семейств CR1, RTE, BEL, copia и, таким образом, определены потенциальные носители клональной изменчивости. Проведен анализ последовательностей, составляющих картины генотипирования партеногенетических личинок. Впервые показано, что фрагменты кодирующей части CR1 ретроэлемента (non-LTR) и некодирующей части элемента представлены в транскриптоме в значительных количествах, но в разных транскриптах. Локализация кодирующей и некодирующей частей CR1 (non-LTR) впервые показана в разных частях хромосом — факультативном или конститутивном гетерохроматине. Конкретные данные настоящей работы являются вкладом в выявление связи повторяющихся последовательностей и некодирующей РНК, определение их вклада в упаковку генома, его нестабильность и эволюцию.
Теоретическое и практическое значение работы Работа имеет фундаментальную направленность и расширяет представления о роли мобильных элементов в геноме. Результаты работы важны для понимания механизмов появления полиморфизма при отсутствии полового процесса. Объект исследования принадлежит к классу Trematoda, среди представителей которого много возбудителей опасных заболеваний, а клональная изменчивость трематод служит препятствием для разработки противопаразитарных средств. Вид H. elongata безопасен для человека и является удобной моделью для изучения механизмов клональной изменчивости. Материалы диссертации используются в курсах лекций для бакалавров и магистров Биологического факультета Санкт-Петербургского государственного университета и могут быть использованы в общих и специальных курсах лекций биологических факультетов других университетов.
Апробация работы По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 3 — статьи. Основные положения представлены и обсуждены на XII сессии Морской биологической станции СПБГУ (2011), III и V конференциях молодых ученых Института цитологии РАН (2012, 2016 гг); 16-й и 19-й Пущинской Международной школе-конференции молодых ученых (2012, 2015 гг); Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2013» (2013); Международной конференции «Хромосома 2015» (2015); 49th European Marine Biology Symposium (2014); EMBL Symposium: The Mobile genome: Genetic and Physiological impacts of transposable elements (2015).
Вклад автора Автор провел: анализ литературы по теме работы, планирование экспериментов, получение основной части результатов, написание статей и
подготовку докладов на конференциях, сбор животных, выделение ДНК, проведение всех этапов S-SAP, дот-гибридизации, анализ клонированных последовательностей, подготовку проб для измерения генома и кариотипирования. Анализ кариотипа выполнен совместно с Деминым С.Ю. Анализ транскриптов и оценка размера генома выполнены совместно с Галактионовым Н. К. Эксперименты по проточной цитофлуорометрии проведены в лаборатории внутриклеточной сигнализации под руководством Аксенова Н. Д. Материалы, вошедшие в диссертацию, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.
Финансовая поддержка работы Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты № 05-04-49156-а, 11-04-01700, 15-04-01857, 16-34-00603 мол_а, 17-04-02161), РНФ (гранты 15-15-20026, 14-14-00621) гранта Президиума академии наук по программе «Клеточная и молекулярная биология» (рук-ль Боголюбов Д.С.), гранта Министерства образования и науки РФ № 6.1278.2014/К (2014-2016 гг).
Объем и структура диссертации Диссертация содержит разделы «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы», «Список цитируемой литературы», содержащий 141 наименование, «Приложение 1», «Приложение 2», изложена на 116 страницах и проиллюстрирована 65 рисунками (включая приложения) и 5 таблицами.
ДНК- транспозоны
Подавляющее большинство мобильных элементов неактивны, однако их копии представляют собой гомологичные последовательности ДНК, которые могут участвовать в нерегулярной рекомбинации, которую называют эктопической. Ее вероятность зависит от числа гомологичных последовательностей и длины элементов. Рекомбинация приводит к генетическим перестройкам: вредным (делеции, инверсии), полезным (появление человеческих генов семейства гликофоринов (Makalowski, 2000)) или нейтральным. ДНК-транспозоны Foldback (FB) выделяются среди остальных элементов из-за высокой частоты и амплитуды провоцируемых перестановок генома. Большие размеры (часто более 10 т. п. н.) и сложная структура инвертированных повторов FB элементов, вероятно, являются ключевыми факторами вовлечения этих транспозонов в реорганизацию хромосом. В серии экспериментов показала, что эктопическая рекомбинация между двумя противоположно направленными FB-подобными элементами Drosophila buzzatii порождает две независимые инверсии хромосом. Инверсии оказались географически широко рапространены и полиморфны в естественных популяциях мух (Caceres et al 1999, Casals et al 2003). Это дает основания предполагать, что эти изменения селективно выгодны, так как влияют на фенотип мух. В каждом случае очаги появления инверсий находились внутри «горячих точек» генома, которые очень разнятся между популяциями по последовательностям и структуре, более того, они наполнены тесно расположенными вставками ДНК-транспозонов суперсемейств FB и hAT (Feschotte and Pritham, 2007). Известны случаи рекомбинации элементов L1, которая приводила к появлению новых подсемейств LINE (Hayward et al., 1997; Saxton and Martin, 1998) или дупликации генов (Fitch et al.,1991). Существуют также и примеры заболеваний человека, вызванные рекомбинацией между ретроэлементами (Gogvadze and Buzdin, 2009). Однако случаи рекомбинации единичны и не соответствуют количеству ретротранспозонов в геноме.
Мобильные элементы существенно влияют на экспрессию генов за счет наличия собственных промоторов и сайтов сплайсинга, особенно если локализованы вблизи экзонов (рис.3., а) либо за счет нарушения структуры при встраивании в интроны (рис.3, б). Появляется источник новых вариантов мРНК, становится возможным изменение их уровня траснкрипции и тканеспецифичности. Например, элементы Alu имеют тенденцию накапливаться в богатых генами областях генома (Lander et al., 2001) и имеют в своей структуре фрагменты, похожие на консенсусные последовательности сайтов сплайсинга. В целом, Alu-производные сигналы сплайсинга гораздо слабее по сравнению с конститутивными и альтернативными активными сигналами, но могут работать(Sorek et al., 2002; Mola et al., 2007). LINE-подобные элементы также могут быть вовлечены в сплайсинг РНК, однако с меньшей частотой по сравнению с Alu повторами. Повтор L1 млекопитающих содержит множественные функциональные сигналы сплайсинга, которые обеспечивают появление разнообразных альтернативно сплайсированных транксриптов L1 (по большей части бесполезных для перемещения) и могут участвовать в генерации гибридных транскриптов между элементами L1 и генами. LTR-содержащие ретротранспозоны также принимают участие в образовании альтернативно сплайсированных РНК. Например, две изоформы человеческого эндотелиального рецептора к VEGF кодируются одним геном (VEGFR-3/FLT4). Одна из изоформ рецептора короче второй на 63 а. о. и формируется за счет наличия альтернативного сайта сплайсинга, принадлежащего последовательности эндогенного ретровируса, который расположился между экзонами в гене VEGFR-3/FLT4 (Hughes, 2001). Интеграция LTR-содержащего элемента в ген CYP19, кодирующий ключевой фермент биосинтеза эстрогена, привела к формированию альтернативного промотора, расположенного в 100 т. п. н. до открытой рамки считывания гена. Это привело к специфичной для приматов транскрипции CYP19 в синцитиотрофобласте плаценты, что, вероятно, сыграло важную роль в контроле уровня эстрогена во время беременности (Lagemaat et al., 2003).
Отдельные представители SINE элементов мыши (B2 повторы) имеют высокую степень гомологии с промоторами РНК-полимеразы II. Авторы предполагают, что эти ретропозоны имеют потенциальную возможность распространения в геноме новых функциональных промоторов и образования многих вариантов новых транскриптов, что давало бы материал для естественного отбора (Ferrigno et al., 2001). Способность мобильных элементов играть роль альтернативных промоторов может стать причиной появления антисенс-транскриптов, комплементарных генным интронам или экзонам (рис.3.,д).
Кроме внедрения новых сайтов сплайсинга и промоторов, мобильные элементы могут участвовать в модификации генов путем введения дополнительных сигналов полиаденилирования (рис.3, в). Автономные ретроэлементы кодируют необходимые для перемещения белки и используют сигналы поли(А) в 3 -областях собственных генов. Известно много случаев преждевременной терминации транскрипции на сигналах полиаденилирования ретроэлементов. Например, человеческие гены HHLA2 и HHLA3 используют LTR-18 содержащие элементы HERV-H в роли носителей для своих сигналов полиаденилирования. В целом, по недавним оценкам происхождение около 8 % поли(А) сайтов связаны с мобильными элементами (Gogvadze and Buzdin, 2009). Иногда происходит одомашниванивание транспозонов и появление новых генов. Наиболее яркий пример — это V(D)J рекомбинация, в ходе которой образуется разнообразие антител, и которую считают решающим моментом в эволюции адаптивной иммунной системы челюстных позвоночных. Фермент Rag1 — один из участников перетасовки сегментов генов иммуноглобулинов — высоко гомологичен транспозазе ДНК-транспозонов семейства transib, который найден только в геномах беспозвоночных (Cooper and Alder, 2006).
Помимо воздействия на геном на уровне нуклеотидной последовательности, транспозоны вовлечены и в эпигенетическую систему регуляции (рис.3, г). Известно, что некоторые копии мобильных элементов являются источником и мишенями малых некодирующих РНК. Поскольку копии транспозонов содержатся в 3 UTR многих генов, то произошедшие из повторов (чаще всего это LINEs) miРНК способны регулировать уровень большого числа неродственных мРНК в клетке (Макарова, Крамеров, 2007).
Описаны редкие случаи, когда ретротранспозоны выступают в роли инсуляторных элементов, разделяющих транскрипционно активные и неактивные участки хроматина. Так LINEs млекопитающих часто располагаются в районах ассоциации с ядерным матриксом (MARs - matrix attached regions) (Gogvadze, Buzdin, 2009).
Определение размера генома H.elongata
Оказалось, что в геномах всех личинок присутствуют как консервативные, так и полиморфные фрагменты. При этом положение консервативных фрагментов неизменно у особей как внутри одного клона, так и при сравнении личинок из разных моллюсков. Области наибольшей гетерогенности продуктов отмечены вертикальными линиями справа от автографа геля (рис. 11). Наличие консервативных фрагментов и сходные картины генотипирования церкарий свидетельствуют о надежной воспроизводимости результатов S-SAP. Для клонирования отобрали наборы фрагментов разной длины (рамки на рис.11). Успешную реамплификацию прошли все вырезанные зоны, кроме 4 – 6. Далее клонированные последовательности изучали по нескольким параметрам: 1) проводили анализ на наличие фрагментов повторов; 2) поиск консервативных доменов; 3) распределение в картине продуктов S-SAP; 4) распределение в геноме H.elongata; 5) поиск сходных последовательностей в транскриптоме H.elongata. Вначале все клонированные последовательности проверили на принадлежность к тандемным повторам в программе TRF (Tandem repeat finder), однако результаты оказались отрицательными. Затем провели аннотацию в программе RepeatMasker, которая сравнивает целевые фрагменты с базой данных RepBase. По результатам поиска из 36 клонированных фрагментов 20 последовательностей имеют сходство с мобильными элементами (таблица 2); в некоторых с помощью сервиса NCBI Conserved Domains обнаружены консервативные домены обратных транскриптаз (А1, А1 , B1, B1 , B2, 7_7) и интегразы (8_1, 15_1). В 15 клонированных фрагментах по результатам поиска в RepBase не выявлено каких-либо последовательностей мобильных элементов, но в отдельных (2_3, 3_5) обнаружены не относящиеся к транспозонам домены. Например, во фрагменте 2_3 в 3 области программа RepeatMasker находит совсем короткий участок ( 50 п. н.) ретроэлемента Daphne, а большая часть фрагмента несет большой гельзолиновый домен. Все неизвестные фрагменты затем подвергли поиску по базе SINE Base (Vassetsky and Kramerov, 2013). В результате в последовательностях 1_2, 1_5, 2_1, 2_5, 3_10, 7_14 ,9_2 , 14_1, 15_2 и 15_3 обнаружили фрагменты SINE элементов (приложение 1). Аналогичные результаты получили при анализе последовательностей 12_2, 13_1 и 13_4, в которых фрагменты SINE обнаруживаются при поиске RepeatMasker, а также последовательности 12_1 (приложение 1).
Фрагменты non-LTR ретроэлементов обнаружены в консервативных и полиморфных зонах выше 300 п. н., а фрагменты LTR-содержащих ретроэлементов — в зонах более 500 п. н. (15_1, 8_1, 7_9, 7_10 и 12_1). Среди выявленых non-LTR ретроэлементов подавляющее большинство имеет гомологию с транспозонами семейства CR1. Некоторые клонированные последовательности несут короткие фрагменты ретроэлементов RTE и Tad1. В последовательностях 1_5, 2_5 и 7_13 найдены короткие участки до 100 п. н., гомологичные ДНК-транспозонам семейств MuDR и Harbinger. Таблица 2. Анализ секвенированных фрагментов.
Вклад клонированных паттернов S-SAP Эксперименты по дот-гибридизации провели для того, чтобы определить вклад конкретных TE в формирование консервативных и вариабельных участков паттерна S-SAP. Клонированные фрагменты наносили на мембрану в соответствии со схемой (рис. 4), затем мембраны гибридизовали с фрагментами S-SAP из наиболее вариабельных зон, имеющих разный диапазон длины (рис.4).
А. Нормализованные диаграммы соотношения интенсивности сигналов гибридизации на дот-блотах для некоторых зондов. В центре диаграмм указаны обозначения личинок, чья ДНК стала источником зондов. 1. Зонды 800-1000 п.н., 2. Зонды 500-700 п.н. 3. Зонды 300-500 п.н. при варианте S-SAP с эндонуклеазами HindIII и EcoRI. B. Цветовые обозначения точек на блотах. Sample — стандарт диаграммы, в которой интенсивности всех точек на блоте приняты как равные ( 5.5 %).
При анализе сигналов гибридизации выявили, что соотношение интенсивности точек на блотах неодинаково для разных личинок на внутри-клональном и межклональном уровнях
На диаграммах рис.12 видно, что, например, зонды в диапазоне 800-1000 п. н. (А,1) имеют разное распределение интенсивности у трех церкарий. Схожая картина наблюдается и для зондов средней длины (Рис.12, А, 2.).Такая неоднородность подтверждает наличие полиморфизма в геномах партенит, а также указывает на вероятные перестройки. Использование двойной рестрикции HindIII и EcoRI привело к выравниванию интенсивности точек на блотах, а также к появлению других мажорных сигналов.
Также максимально выраженные на дот-блотах фрагменты различны для разных гибридизационных зондов. Типичные для зондов каждого диапазона картины гибридизации показаны на рис.9В. В случае вариабельных зон средней длины (рис. 13, В, 3) выражены фрагменты, несущие короткие участки ДНК транспозона MuDR, а также не идентифицированные фрагменты и фрагмент гена гельзолина (рис.9В, 2). Сигналы, соответствующие другим клонированным фрагментам, представлены приблизительно равномерно на всех блотах.
Следующими по выраженности фрагментами, представленными на всех блотах, являются 15_1 и 7_5. Фрагмент 15_1 является частью открытой рамки считывания, кодирующей интегразу элемента BEL из отряда LTR-содержащих ретротранспозонов. При анализе клонированных последовательностей LTR-элементы обнаруживали только в высоких зонах фореза (более 500 п. н.), а при дот-гибридизации фрагмент выявляется во всех зондах и средней длины. LTR-содержащие ретротранспозоны — длинные элементы ( 5-8 т. п. н.) c несколькими потенциальными открытыми рамками считывания. Вероятно, фрагмент 15_1 представляет собой часть длинной последовательности LTR-содержащего элемента BEL, способного транскрибироваться и перемещаться целиком.
Получение ядер и метафазных хромосом H. elongata для флуоресцентной гибридизация in situ (FISH)
У трематод на хромосомах картированы лишь некоторые полноразмерные ретроэлементы из генома S. mansoni. SINE элемент Sm распространен дисперсно на всех хромосомах. LTR-содержащий ретроэлемент Boudicca не имеет дисперсного распределения и локализуется в эухроматине хромосом 2 и женской половой хромосомы W, non-LTR ретроэлемент Perere 03 из семейства RTE также расположен в эухроматине субтеломерной зоны хромосомы 2 (Valentim et al., 2008).
Для картирования клонированных фрагментов понадобилось впервые провести кариологический анализ H. еlongata. В ходе анализа выявили полиморфизм в морфологии, варьирование по степени расхождения сестринских хроматид (СХ) и дискорданс гомологичных хромосом (Solovyeva et al, 2016). Неполное разделение СХ в клетках H. elongata всегда сопровождается асимметрией конденсации хроматина и (или) картиной исчерченности. Феномен дискорданса гомологов хорошо известен для хромосом человека. Показали, что минимальные значения дискорданса (6,7 – 14,2 %) можно наблюдать у метафазных хромосом после GTG-окраски (G-техника окраски трипсином и Гимзой). В то же время для прометафазных хромосом степень варьирования размеров и, соответственно, дискорданс гомологов имели значения до 29,8 % после окраски GTG и 64,2 % после окраски RBG (R-техника окраски бром-дезоксиуридином и Гимзой) (Schwartz and Palmer, 1984). Дискорданс гомологичных хромосом широко обсуждается в литературе с точки зрения эмбриогенеза (Patkin, 2002) и тканеспецифичной дифференцировки стволовых клеток (Tran et al, 2013), а также асимметрии деления клеток и тканевой дифференцировки во время эмбриогенеза (Bell, 2005; Tajbakhsh et al., 2009; Lansdorp et al., 2012). Таким образом, возникла необходимость создать банк изображений (приложение 2.) для каждого компонента кариотипа H. elongata для того, чтобы обнаружить все возможные варианты изменчивости в морфологии хромосом. Идентификационные ряды служили для определения отдельных хромосом в прометафазных и метафазных пластинках. Индивидуальная изменчивость хромосом оценивалась по следующим критериям: когезии и неполному разделению сестринских хроматид, картине бендов, центромерному гетерохроматину и окраске терминальных бендов флуорохромом DAPI. Более детальное описание дискорданса гомологов и вариабельности разделения сестринских хроматид требует отдельного изучения. На данный момент, мы отмечаем, что одна метафазная или прометафазная пластинка может содержать хромосомы с кардинально различной степенью разрешения бендов, соответсвующие крайней левой или крайней правой позиции в идентификационных рядах (приложение 2). Форма хромосомы складывается из двух составляющих: 1) уровня конденсации, которая отражает стадию митоза; (2) степени разделения сестринских хроматид.
Варьирование размеров блоков центромерного гетерохроматина, отличное от других описанных морфологических особенностей, потенциально может отражать популяционную изменчивость. Источник этого полиморфизма может быть найдет после определения в геноме H.elongata последовательностей основных тандемных повторов, главного компонента гетерохроматина. Тандемные повторы послужат надежным зондом для исследования вариабельности гетерохроматиновых блоков.
Заметная картина исчерченности на хромомах H. elongata видна после дифференциальной окраски DAPI и CMA3. Распространено мнение, согласно которому четкие G- и R-блоки характерны для хромосом только высших позвоночных животных. При этом G-сегменты ярко окрашиваются AT-специфичными флуорохромами, а R-блоки наоборот — ГЦ - специфичными (Родионов, 1999). Настоящей работе впервые наблюдали исчерченность при дифференциальной окраске хромосом плоского червя. Ближайший родственный вид H. elongata с известным геномом — это Echinostoma caproni (рис. 9). К сожалению, кариотип E. caproni описан при помощи дифференциальной окраски Гимзой (Richard and Voltz, 1987), и отсутствуют подробные идеограммы.
В животных клетках от 40 до 95 % рибосомной ДНК находится в неактивном состоянии (Grummt, 2003). Картирование неактивных кластеров рДНК является нерешенной проблемой цитогенетики животных. Выявление последовательностей в гетерохроматине методом FISH требует ужесточения условий гибридизации. Однако даже кратковременная обработка пепсином или протеиназой К приводила к полному исчезновению исчерченности хромосом H. elongata. Мы не использовали протеиназы при картировании 18S рДНК. Все сигналы, полученные методом FISH, были также выявлены при окраске азотнокислым серебром (приложение 2). Таким образом, в кариотипе H. elongata минимум три хромосомы являются носителями ядрышковых организаторов.
С выходом публикации о новой филогении эхиностоматид (Tkach et al, 2016) химаслин выделили в отдельное семейство Himasthlidae. Однако многие авторы придерживаются старой классификации (Kostadinova, 2005), в соответствии которой род Himasthla относят к семейству Echinostomatidae Looss, 1899. Далее в обсуждении речь пойдет о старом варианте филогении. Кариологические данные по семейству Echinostomatidae Looss, 1899 доступны для сравнительно небольшого числа видов, чьими промежуточными хозяевами служат пресноводные моллюски, а окончательными — птицы, животные и человек. Согласно литературным источникам, диплоидный набор хромосом эхиностоматид варьирует от 14 до 22 (таблица 5). Существует мнение о существовании эволюционной тенденции в классе Digenea в поддержании диплоидного набора хромосом, равного 20, который, вероятно является предковым (Birstein and Mikhailova 1989). До настоящего момента кариологические данные какого-либо из видов рода Himasthla отсутствовали.
Вклад клонированных фрагментов в формирование паттернов S-SAP
Они покрывают фрагмент 2 т. п. н. в конце ORF2 и 3 UTR L1. Аналогичный участок обнаружен и в гетерохроматиновых районах человеческого генома (Kuznetsova et al., 2016). Экспериментально полученные клоны короткие (100 – 200 п. н.), а яркость их FISH-сигналов на хромосомах и в хромоцентрах сигнала сравнима с сигналом от классических ТП — сателлитов мыши. Это свидетельство в пользу тандемной организации фрагмента внутри гетерохроматинового района.
Впервые клональная изменчивость трематод выявлена именно на тандемно повторенных последовательностях сателлите W1 в геномах партеногенетических поколений S. mansoni (Bayne, Grevelding, 2003). Элемент W1 существует в 500 – 1000 копиях в геноме, как ТП с мономером 476 п. н., одним сайтом рестрикции для EcoRI, соответственно, относится к сателлитной ДНК (Grevelding, 1999) и локализуется преимущественно в гетерохроматине половых хромосом (Lepesant et al., 2012). На праймерах к W1 выявили генетическую гетерогенность внутри популяций S. mansoni и интерпретировали это как нестабильность генома. После культивирования дочерних спороцист доказали, что внутри одного клона есть различия по содержанию W1. Выявили особей, содержащих укороченный вариант мономера, а в некоторых случаях элемент W1 вообще отсутствовал. Геномную гетерогенность обнаружили среди клонов церкарий, произошедших от одного мирацидия. Авторы высказали предположение, что причиной клональной изменчивости стала митотическая рекомбинация при партеногенетическом размножении или, так называемая эктопическая или неразрешенная рекомбинация (Bayne, Grevelding, 2003). Но результаты настоящей работы свидетельствуют о том, что в клональной изменчивости задействованы скорее фрагменты ТЕ, которые также присутствуют в гетерохроматине (рис. 17; Kuznetsova et al., 2016). Фрагмент 7_5 не организован тандемно, что подтверждается анализом in silico (TRF; Benson, 1999) и гибридизацией по Саузерну (рис.22). Однако морфологические данные (рис. 21) позволяют думать, что фрагмент тяготеет к конститутивному гетерохроматину. У мыши фрагменты того же района LINE выделены из хромоцентров, то есть из конститутивного гетерохроматина (рис.25, Kuznetsova et al., 2016). Точная локализация фрагмента 7_5 нуждается в уточнении дополнительными методами (например, двойной fiberFISH с зондом к ТП с учетом видоспецифичности), однако этот фрагмент безусловно представлен в транскриптоме (рис.24).
Подтверждение функциональной важности 3 - фрагмента LINE, к этой области относится и 7_5, для эукариотических геномов находится в работе, посвященной C0Т1 РНК человека (Hall et al., 2014). Недавние исследования обнаружили богатое разнообразие некодирующих РНК, в основном, с неизвестными функциями. Но работ, посвященных изучению диспергированных повторов, составляющих существенную (до 80% у некоторых видов) часть генома, очень мало. С помощью гибридизации in situ зондов C0T-1 ДНК с тотальной РНК клеток обнаружили, что изобилующая связанная с эухроматином РНК представлена преимущественно повторами (C0T-1 РНК), включая ретроэлемент LINE-1. C0T-1 РНК располагается в соответствии с хромосомными территориями и остается стабильно связанной с ними после ингибирования транскрипции. Территория C0T-1 РНК устойчива к механическим повреждениям и прочно ассоциирована с ядерным матриксом. Потеря связанной с эухроматином РНК повторов приводит к аберрантному распределению хроматина и конденсации (Hall et al., 2014). В работе также показано, что представленность РНК ретроэлемента L1 значительно выше по сравнению с РНК главного SINE элемента человека. Согласно биоинформационному анализу, число копий элементов L1 и Alu на хромосоме 4 человека примерно одинаково (151 полноразмерных и 58639 укороченных L1, и 54993 Alu). Так как 68% элементов Alu и 47% L1 находятся в интронах, транскрипция с генов не влияет на эту разницу. Согласно мнению авторов, РНК повторов не является транскрипционным шумом, а, напротив, увеличивает возможности регулирования и настройки транскрипции. Именно регуляторной ролью объясняется обилие и повсеместное распространение ТЕ. Но более того, транскрипты ORF2 LINE и 3 конца LINE доминируют во фракции C0T-1 РНК (fig.6, Hall et al, 2014), что полностью согласуется и с результатами настоящей работы (рис.24).
Результаты настоящей работы подтверждают, что повторяющуюся «мусорную» часть генома стоит изучать не только как ДНК, но и как основную часть «темной материи» транскриптома. Всего лишь 5% промоторов лежит в пределах канонических генов (Venters and Pugh, 2013). Как происходит экспрессия и регуляция остальной их, генов, части, остается непонятным. Настоящая работа является вкладом в то, что может привести к новой революции в исследованиях генома: выявление связи РНК и повторяющихся последовательностей, их вклад в упаковку генома, его нестабильность и эволюцию.