Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 12
1.1. Общие принципы и подходы к культивированию клеток in vitro 12
1.2. Тромбоциты как альтернативные источники ростовых факторов 32
1.3. История получения и применения препаратов тромбоцитов 46
Глава II. Материалы и методы 64
11.1. Получение ЛТ 64
11.2. Биохимический анализ ЭТС и ЛТ 66
11.3. Определение содержания гормонов в ЭТС и ЛТ доноров 66
11.4. Определение содержания факторов роста в ЭТС и ЛТ доноров 66
11.5. Выделение ММСК из жировой ткани (ЖТ) человека 67
11.6. Оценка влияния ЛТ и ЭТС как культуральных добавок на рост клеток in vitro 68
11.7. Оценка дифференцировочных потенций ММСК из ЖТ человека in vitro 75
11.8. Изучение регенеративной активности ЛТ и ЭТС in vitro на модели ФЧ и ММСК 77
11.9. Проведение термоинактивации ЛТ и ЭТС
11.10. Обоснование пулирования лизата тромбоцитов на основе его функциональной активности в отношении фибробластов человека 80
11.11. Статистическая обработка результатов экспериментов 80
Глава III. Результаты собственных исследований 82
111.1. Физико-химические характеристики лизата тромбоцитов доноров в сравнении с эмбриональной телячьей сывороткой 82
111.2. Исследование динамики роста линий иммортализованных нормальных и опухолевых клеток и культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани в присутствии лизата тромбоцитов как ростовой добавки 122
III.3. Разработка методических аспектов пулирования лизата тромбоцитов 201
Заключение 206
Выводы 213
Список литературы
- Тромбоциты как альтернативные источники ростовых факторов
- История получения и применения препаратов тромбоцитов
- Определение содержания факторов роста в ЭТС и ЛТ доноров
- Исследование динамики роста линий иммортализованных нормальных и опухолевых клеток и культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани в присутствии лизата тромбоцитов как ростовой добавки
Тромбоциты как альтернативные источники ростовых факторов
Исследования культур клеток in vitro позволяют: осуществлять прижизненное наблюдение клеток в процессе микроскопии; оценивать влияние факторов среды; использовать относительно небольшое количество клеток для получения достоверных результатов; избегать морально-этических проблем; изучать влияние широкого спектра веществ в широком диапазоне концентраций и периода времени наблюдения.
Клетки одного и того же типа многогранно взаимодействуют друг с другом в тканях и, в частности, согласовывают скорость деления, чтобы поддерживать надлежащую плотность популяции. В культуре происходят сходные процессы. Так, эпителиальные клетки или фибробласты, помещенные в чашку Петри, в присутствии сыворотки «прилипают» к поверхности, распластываются и делятся до тех пор, пока не образуется сплошной монослой, в котором соседние клетки соприкасаются.
Контакты клеток обеспечиваются образованием комплексов из поверхностных белковых комплексов мембран соседних клеток, различающихся по своей функциональной активности. Щелевые контакты образуют каналы, позволяя клеткам обмениваться между собой малыми цитоплазматическими молекулами. Плотные контакты образуют барьер, регулирующий прохождение молекул через слой клеток и препятствующий диффузии белков в плазматической мембране. Адгезивные контакты и десмосомы формируют механическую устойчивость, связывая цитоскелет контактирующих клеток, а также могут служить передатчиками сигналов при изменении клеточной поверхности [25,215].
В настоящее время существует две основные концепции, объясняющие адгезию клеток: физико-химическая и лигандо-рецепторная. В основе первой лежит положение о балансе электростатических сил отталкивания, возникающего за счет отрицательного заряда карбоксильных групп остатков сиаловых кислот на поверхности клеток, и притяжения за счет фосфолипидов плазмолеммы. В пользу данной теории говорит успешное экспериментальное подтверждение рассчитанных значений межклеточных расстояний. Количественные различия различных клеток в степени адгезии можно оценить, даже с учетом неспецифического характера этого механизма [31]. Лигандо-рецепторная концепция предполагает, что в процессе клеточной адгезии участвуют разнообразные лиганды и их рецепторы. Адгезия клеток осуществляется при участии ряда веществ белковой природы, входящих в состав межклеточного матрикса, в частности, фибронектинов [183,201,208,219], ламининов [53,62,85,102,196,224], витронектинов [185,199], протеогликанов [69,134,200], а также так называемых молекул клеточной адгезии – интегринов, селектинов и кадгеринов [25,31,215].
Адгезивные структуры клеточного матрикса сформировались на ранних этапах эволюции клетки. Основу этих адгезивных структур образует внеклеточный матрикс, секретируемый клетками и образующий волокна, слои, пленочные образования. Структурная функция внеклеточного матрикса осуществляется с помощью соответствующих гликопротеинов (коллагена, эластинов) и протеогликанов (проявляющих гидрофильные свойства и поддерживающих водное окружение клеток).
Существенное значение в прикреплении клеток к поверхности, помимо наличия белковых структур адгезивных контактов, имеет секреция клетками компонентов межклеточного матрикса. В прикреплении клеток к различного рода матриксам и поддержании структуры тканей участвуют ряд белков, среди которых необходимо выделить трансмембранные кадгерины, образующие стержневые структуры между клетками. Важную роль в регуляции взаимодействия клеточных рецепторов и межклеточного матрикса играют сигнальные механизмы. Фибронектин – один из белков внеклеточного матрикса, синтезируемый в фибробластах, гепатоцитах, эндотелиоцитах, некоторых клетках нервной системы. В зависимости от типа клеток, активность фибронектина несколько варьирует. Внутри клетки фибронектин присутствует в растворенном виде, в то время как нерастворимые формы формируют структуры внеклеточного матрикса. Основная функция его заключается в прикреплении клеток к матрицам, содержащим фибриллярный коллаген. Фибронектин регулирует форму клеток, организацию цитоскелета, способствует заживлению ран и гемостазу.
Фибронектин имеет важное значение в опухолевом росте, образуя субстрат для миграции клеток при образовании метастазов. Важность фибронектина для роста, подвижности и дифференцировки клеток обусловлена его связями с клетками посредством интегринов. Именно последним принадлежит ключевая роль в адгезии клеток. Согласно большинству моделей, фибронектиновые димеры связываются с интегриновыми рецепторами поверхности клеток, изменяют свою конформацию, принимая линейную форму, и соединяются далее с димерами фибронектина, создавая прочную опорную структуру. Ламинины – семейство белков внеклеточного матрикса, находящихся в основном в базальной ламине(отсюда название) и в других тканях. Состоят из трех полипептидных субъединиц (, , , образующихся при экспрессии разных генов), образующих суперспираль. Ламинины образуют сетеподобные структуры, благодаря которым при участии интегриновых рецепторов происходит прикрепление (посредством полудесмосом) и распространение по базальной ламине многих видов эпителиальных клеток. В образовании данных структур принимают участие также коллаген IV типа, энтактин, перлекан, а также до 20 различных видов рецепторов.
История получения и применения препаратов тромбоцитов
Материалом для получения ЛТ являлась тромбоцитарная масса (ТМ) доноров (отделение переливания крови ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздрава России). Средний возраст доноров составлял 33 года (мужчин – 31 год, женщин – 35 лет). Большая часть доноров (как мужчин, так и женщин) были моложе 45 лет.
Перед процедурой заготовки ТМ все доноры подписывали развернутое информированное согласие и проходили обследование на наличие ВИЧ I и II типа, HBs-антигена, вируса HCV, возбудителя сифилиса. Также осуществлялся клинический анализ крови и (при диспротеинемии в анамнезе) исследование белковой фракции. ТМ от донора получали путем афереза на аппарате Amicus (США) по методике фирмы-производителя прибора. Процедура заготовки ТМ валидирована и предполагает контаминацию лейкоцитами в количестве не более 1106 на дозу ( 21011 тромбоцитов), что контролируется в соответствии с техническим регламентом о требованиях безопасности крови, ее продуктов, кровезамещающих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии, а также положениями стандарта «Донорская кровь и ее компоненты: характеристики и контроль качества. XI. Тромбоциты, полученные методом афереза». После завершения процедуры в лабораторию передавали стерильные запаянные пробирки-пробники объемом 6 мл (от каждого донора 1-2 пробника) с сопроводительной информацией: ФИО донора, пол, возраст, результаты клинического анализа крови, концентрация тромбоцитов в ТМ.
Перед этапом получения ЛТ производили нормирование всех образцов ТМ по концентрации тромбоцитов (1,75109 тромбоцитов/мл), для чего в стерильных условиях содержимое пробирок-пробников переносили в пластиковые пробирки объемом 15 мл (Corning, США), производили дополнительно подсчет концентрации тромбоцитов в образце по унифицированной методике с помощью камеры Горяева либо на автоматическом гематологическом анализаторе Sysmex KX20 (Япония).
Для определения содержания тромбоцитов в камере Горяева пробу ТМ объемом 20 мкл разводили в 3,48 мл физиологического раствора с добавлением 0,5 мл цитратного буфера АСD-A, вносили разведенный ТК в камеру Горяева и подсчитывали сумму Y тромбоцитов в 25 больших квадратах. Концентрация рассчитывалась по формуле:
Х(кл/мкл) = Ух250х20 (П.1) Средняя концентрация тромбоцитов в образце ТМ составила 1,63±0,17109 тромбоцитов/мл. В случае, если в образце ТМ определялось менее 1,75109 тромбоцитов/мл, его центрифугировали при 4000 об/мин в течение 40 мин при 20С (центрифуга Eppendorf 5810R, Швеция), ресуспендируя затем осадок тромбоцитов в нужном для достижения указанной концентрации объеме супернатанта, если более 1,75109 тромбоцитов/мл - разводили необходимым объемом плазмы. Для получения ЛТ использовали, таким образом, неактивированные тромбоциты.
Для получения ЛТ был выбран метод температурного лизиса, который заключается в проведении циклов замораживания и быстрого размораживания образца ТМ. Согласно данным ряда авторов [61,80,95,125,148,165,193 ,198], в результате такой процедуры происходит разрушение -гранул тромбоцитов и высвобождение из них ФР. Для получения образца ЛТ пробирки с ТМ каждого донора замораживали при -80С (низкотемпературный холодильник Sanyo MDF-U500VX) и через 24 ч размораживали при +37С (20-40 мин; термостат ТС-80М-2). Процедуру повторяли от 1 до 3 раз. Затем образцы центрифугировали в различных отобранных нами режимах (центрифуга Eppendorf 5810R, Швеция) для осаждения фрагментов тромбоцитов. Объединенные супернатанты от 1-2 пробников каждого донора, представляющие собой ЛТ, оценивали под микроскопом при увеличении 20х на наличие/отсутствие видимых нелизированных тромбоцитов и/или их фрагментов. При отрицательном микроскопическом контроле ЛТ разливали в стерильные пластиковые микроцентрифужные пробирки (Corning, США) в зависимости от задач эксперимента по аликвотам от 100 до 500 мкл и замораживали (-80С) до дальнейшего исследования.
Биохимический анализ образцов индивидуального ЛТ доноров (n=48; 25 мужчин и 23 женщины), пула ЛТ от 28 доноров (n=6) и ЭТС (n=14) производили в клинико-диагностической лаборатории ФГБУ «МНИОИ им П.А. Герцена» МЗ РФ с использованием автоматического анализатора Ilab 650 (Shimadzu, Япония). Определяли концентрацию билирубина общего, холестерина, ЛПВП, ЛПНП, коэффициента атерогенности, триглицеридов, белка общего, альбумина, АСТ, АЛТ, щелочной фосфатазы, ЛДГ, мочевины, мочевой кислоты, глюкозы, калия, натрия, кальция, фосфора неорганического, хлоридов, магния, железа, креатинина. Уровни всех компонентов в ЭТС при представлении данных нормировали на содержание общего белка в ЛТ.
Определение содержания факторов роста в ЭТС и ЛТ доноров
На первом этапе работы рутинными биохимическими методами в ЛТ 25 мужчин и 23 женщин определены параметры, традиционно оцениваемые в клинической практике (табл. III.4).
У мужчин индивидуальные различия в биохимических показателях, по значениям относительной ошибки среднего (m/M%), были наибольшими для концентрации триглицеридов, билирубина и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) (m/M% 13,0-13,8%). У женщин индивидуальные различия в биохимических показателях были наибольшими для концентрации билирубина, ЛДГ, АСТ (m/M% 13,3 -36,4%) (табл. III.4).
Как у мужчин, так и у женщин наблюдался повышенный (по сравнению с верхней границей нормы для венозной крови человека) уровень глюкозы, что объясняется приемом донорами сладкого чая перед процедурой тромбоцитафереза, и натрия, обусловленный присутствием в концентрате тромбоцитов буферного раствора на основе цитрата натрия. Также в ЛТ отмечался повышенный уровень ЛДГ и пониженный - хлоридов и белка общего (табл. III.4).
Нами не было выявлено значимых различий по указанным биохимическим показателям между мужчинами и женщинами.
Сходный анализ был проведен для 14-х лотов ЭТС (табл. III.5). В ЭТС, по сравнению с нормами для венозной крови человека, повышено содержание креатинина, маркеров формирования костной ткани (ЛДГ, щелочная фосфатаза) и показателей минерального обмена - калия, кальция, фосфора, магния.
Показано, что в ЛТ содержались те же компоненты, что и в ЭТС, но их концентрации отличались от таковых в ЭТС. В частности, в ЛТ, в отличие от ЭТС, достоверно выше было содержание билирубина, холестерина, ЛПВП и ЛПНП, общего белка, альбумин, АЛТ, АСТ, мочевой кислоты, глюкозы и натрия (в 1,2 – 6,0 раз) и достоверно ниже – содержание щелочной фосфатазы, ЛДГ, мочевины, калия, кальция, магния, железа, фосфатов, хлора (в 1,1 – 6,7 раз). Не было отмечено различий в содержании триглицеридов в обоих биологических объектах (табл. III.6).
Образцы ЛТ, полученного из тромбоцитарного концентрата мужчин и женщин, показывают существенные индивидуальные различия в некоторых биохимических показателях. Т.е. очевидно, что для пулирования ЛТ необходимо использовать тромбоконцентрат как от мужчин, так и от женщин.
Кроме того, оказалось, что ЛТ отличается по ряду усредненных биохимических показателей – ферментов, неорганических компонентов, продуктов белкового обмена - от ЭТС. Вышесказанное свидетельствует о возможности получения более стандартизованной (по сравнению с ЭТС) ростовой добавки на основе ЛТ при подтверждении его функциональных свойств.
Указанные биохимические параметры были также изучены для пулированных (от 28 доноров) образцов ЛТ (n=6). Было установлено, что они не отличаются от таковых для индивидуальных образцов ЛТ, за исключением АСТ, калия и магния (табл. III.8).
Различия между пулами ЛТ от 10 мужчин и 10 женщин по ряду параметров (ЛПВП, триглицериды, АСТ, АЛТ, щелочная фосфатаза, ЛДГ, мочевина, натрий, кальций, фосфор неорганический, железо, креатинин) оказались менее значимыми в сравнении с лотами ЭТС. То есть по биохимическим показателям ЛТ были более однородными, чем лоты ЭТС (табл. III.7).
Таким образом, проведен сравнительный анализ биохимического состава 48 образцов ЛТ, полученных из тромбоцитарной массы доноров (25 мужчин, 23 женщин), пула ЛТ (от 28 доноров, n=6) и ЭТС различных лотов (n=14). Показано, что ЛТ и ЭТС по ряду биохимических показателей значимо отличаются друг от друга (билирубин, холестерин, белок общий, альбумин, ЛДГ, глюкоза, показатели минерального обмена) и от венозной крови человека (холестерин, белок общий, альбумин, ЛДГ), при этом в ЛТ как мужчин, так и женщин существуют индивидуальные различия в биохимических показателях, что служит основанием для процедуры пулирования ЛТ мужчин и женщин с целью стандартизации ЛТ по значимым показателям.
Исследование динамики роста линий иммортализованных нормальных и опухолевых клеток и культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани в присутствии лизата тромбоцитов как ростовой добавки
В настоящем разделе была поставлена цель сравнить влияние ЛТ и ЭТС как ростовых добавок на параметры роста и морфологию клеток человека - нормальных (ММСК из жировой ткани человека) и иммортализованных (фибробласты кожи человека, штамм hTERT 1608).
На первом этапе работы было исследовано влияние комбинаций этих ростовых добавок в различных соотношениях на рост ММСК in vitro путем дробной замены. Для исследования дробной замены ЭТС были выбраны 2 культуры ММСК из жировой ткани человека. Культивирование клеток вели в 96-луночных культуральных пластиковых планшетах в ПРС с ростовыми добавками следующего состава:
В данной серии экспериментов использовали пул ЛТ от 10 доноров ТМ (ЭТС – «ПанЭко», Россия; кат. № SH30071.03). Установлено, что в течение 7 суток обе культуры ММСК наиболее активно пролиферировали в присутствии комбинации 7,5% ЛТ и 2,5% ЭТС (оптическая плотность составила 0,493 и 0,364 для культуры 1 и культуры 2 соответственно) - рис. III.22, рис. III.24. Для остальных вариантов ростовой добавки оптическая плотность достоверно уменьшалась в ряду ЛТ 5,0%/ЭТС 5,0% ЛТ 10% ЛТ 2,5%/ЭТС 7,5% ЭТС 10% MesenCult для культуры 1 (рис. III.22). В параметрах роста культуры 2 не отмечалось достоверной разницы между комбинациями ростовых добавок ЛТ/ЭТС 5,0%/5,0%, 2,5%/7,5% и ЛТ 10%. Данные ростовые добавки, однако, обеспечивали более выраженную пролиферацию ММСК по сравнению с ЭТС 10% и MesenCult, между которыми, в свою очередь, также не было отмечено значимых различий в величинах оптической плотности раствора формазана (рис. III.24).
В течение 7 суток культивирования ММСК (культура № 1) отмечалась достоверно более высокая скорость прироста клеточной популяции (относительно 1-х суток) в присутствии комбинации ЛТ и ЭТС 5,0%/5,0% (рис. III.23), составившая на 7-е сутки 1234%. Для остальных вариантов ростовой добавки прирост клеточной популяции достоверно уменьшался в последовательности ЛТ 2,5%/ЭТС 7,5% ЛТ 7,5%/ЭТС 2,5% ЛТ 10% ЭТС 10% MesenCult и составил на 7-е сутки 870%, 815%, 718%, 368% и 198% соответственно.
Для прироста ММСК из культуры № 2 наблюдалась несколько иная картина: наиболее высокий прирост клеточной популяции (относительно 1-х суток) отмечался в присутствии 10% ЛТ, составивший 297%, что, однако, значимо не отличалось от значений, полученных для комбинации ЛТ 7,5%/ЭТС 2,5% (269%) - рис. III.25. Для остальных вариантов ростовой добавки скорость прироста клеточной популяции уменьшалась в последовательности ЛТ 5,0%/ЭТС 5,0% ЛТ 2,5%/ЭТС 7,5% ЭТС 10% MesenCult и составила на 7-е сутки 131%, 99%, 51% и 47% соответственно. При этом не было отмечено достоверной разницы в величине прироста для комбинаций ЛТ 5,0%/ЭТС 5,0% vs ЛТ 2,5%/ЭТС 7,5% и ЭТС 10% vs MesenCult (рис. III.25).
Представленные выше данные свидетельствуют о том, что 10% ЛТ обеспечивает достоверно более высокий по сравнению с 10% ЭТС прирост ММСК из жировой ткани человека in vitro. Стимулирующий эффект в отношении ММСК отмечается не только для нативного ЛТ, но и для его комбинаций с ЭТС при дробной замене последней: 10% 7,5%/2,5% 5,0%/5,0% 2,5%/7,5% 0%/10%. Величина стимулирующего эффекта комбинаций несколько варьирует в разных сериях экспериментов и с использованием разных образцов клеточных культур.