Введение к работе
. Актуальность проблемы. В , интерфазных ядрах эукариотических леток ДНК находится в составе сложного нуклеопротеидного омплекса, называемого хроматином. В последние годы взгляд на роматин, как на структуру, обеспечивающую компактную упаковку линноя заряженной молекулы ДБК внутри клеточного ядра, сменяется ризнанием его активной роли в сложном процессе управления
ИФФвреНЦИаЛЬНОЯ ЗКСПреССИВЙ ГеНОМа (Elgin, 1990( Feisenfeld, 992).
Говоря о структуре хроматина, традиционно выделяют три уровня го структурной организации: нуклэосомный. наднуклеосомныи хроматиновая Фибрилла диаметром 30 нм) и петлевой. 30-нм.Фибрилла редставляет собой структурное состояние основной массы хроматина а протяжении большей части клеточного цикла. Несмотря на чевиднуга важность этой структуры " и на десятилетия интенсивных сследования в этой области, до сих пор не сформировались общие редставления о способе её организации. Свидетельством далёкой от кончательного разрешения ситуации является одновременное уществовааие множества моделей наднуклеосомноя структуры роматина twidom, 1989). а обшим для всех моделей недостатком вляется отсутствие связи с проблемами Функционирования хроматина, этя имеются данные в- пользу того, что именно на этом уровне эдается активное или репрессированное состояние определённой
ЗСТИ.ГеНОМа (Weintraub, 19В5; Wolffe and Brown, 1988; Kamakaka id Thomas, 1990).
Большинство дискуссионных моментов, касающихся эднуклеосомноя структуры хроматина в той или иной степени связаны влиянием длины межнуклеосомноя (линкерной) ДНК на параметры фуктуры, а также с выяснением её точной траектории в составе Э-нм Фибриллы. Поэтому сравнительные исследования препаратов эоматина, различающихся длиной линкерной ДНК, представляют собой тодотворныя подход к проблеме высшей структуры хроматина.
Известно, что наблюдается обратная корреляция между длиной шкернои ДНК и уровнем транскрипционной активности. Такие данные
)ЛуЧеНЫ Как ДЛЯ ТОТаЛЬНЫХ ІПреПараТОВ Хроматина (Morris, 1976),
зк и'для индивидуальных генов, принадлежащих одному, и. тому же
ШУ ПДер (Villpponteau et al ., 1992). ЭТО ДабТ ВОЗМОЖНОСТЬ
зязать структурные. изменения, вносимые этим параметром, с смежными Функциональными последствиями таких изменения.-
- г -
Цели и задачи исследования. Цель предлагаемой работы состояла в том," чтобы выявить особенности, вносимые изменением длины линкернои ДНК в процесс Формирования и характер наднуклеосомной структуры хроматина. Для её осуществления помимо классического объекта - хроматина тимуса крысы, были выбраны экстремальные по данному параметру варианты:- хроматин нейронов больших полушарий мозга голубя с одной из самых коротких линкерных ДНК, а также хроматин сгормиев морского ежа, характеризующийся самоа длинной из наблюдавшихся линкерных ДНК.
В соответствии с далью исследования были поставлены следующие задачи:
1. Методом скоростной седиментации изучить процесс
компактизации олигонуклеосомных Фрагментов хроматина трех
указанных типов, индуцируемый увеличением ионной силы раствора
(традиционно используемый при исследованиях tn vitro . аналог
процесса конденсации-декондэнсации хроматиновых Фибрилл).
2. Применяя модельные расчёты для анализа полученных
седиментационных данных, . оценить структурные, параметры
олигонуклеосомных Фибрилл различных типов и характер их изменений
при зависимой от ионной силы компактизации.
,» 3. Исследовать процесс образования специфических ассоциатов, характерный для части олигонуклеосомных Фрагментов компактного реппрессированного хроматина спермиев морского ежа.
Научная новизна и научно-практическая ценность рабовц.
Показано, что длина линкернои ДНК не является лимитирующим'
Фактором при зависимой от Hojmqa силы конденсации
олигонуклеосомных Фрагментов хроматина. Имеются механизмы,
позволяющие преодолеть ограничения, связанные как .с ' очень
коротким, так л с очень длинным линкером. ' ..
Анализ . динамики - расчитанных структурных параметров
олигонуклеосомных Фрагментов- хроматина на различных этапах,
компактизации позволил: 1. предложить модели структуры
' хроматиновой Фибриллы в растворах низкой и высокой ионной силы;.
Z. получить информации о механизме Формирования наднуклеосомной
структуры хроматина.
. _ Показано, что в растворе низкой ; ионной силы .структура рлигонуклеосомнои цепи соответствует модели расположения нуклеосом в виде .пространственного зигзага. . При зтом впервые' продемонстрирована возможность изгибания линкернои ДНК различной
ДЛИНЫ (Osipova et al. , 1770). ВПОСЛВДСТВИИ ЭТО бЫЛО ПОДТВврЖДвНО ДаННЫМИ ДРУГИХ аВТОрОВ (Yao et.al., 1790).
Изогнутое или свернутое в петлю состояние линкерной ДНК сохраняется на всех этапах компактизации хроматина и представляется важным для его Функционирования. Предложенная модель высшей-структуры хроматина представляет собой двухстартовую двойную суперспираль с расположенными внутри петлями линкерной ДНК. Данная модель позволяет преодолеть ряд трудностей других типов моделей.
Впервые обнаружено и исследовано явление специфической ассоциации части олигонуклеосомных Фрагментов хроматина спермиев морского ежа, наблюдающеэся в растворах низкой ионной, силы и сопровождающее процесс их компактизации. До сих пор подобное явление было известно только для хроматиновых Фибрилл из ядер терминально дифференцированных клеток эритроцитов цыпленка, содержащих гены, не экспрессирующиеся в данном типе клеток
(Weintraub, 17В4; Grigoryev et al., 1771). С0П0СТаВЛЄНИ9 СВОЙСТВ
этих двух типов ассоциатов позволяет рассматривать это свойство в качестве отличительного признака структуры хроматина необратимо репрессированной части генома, характерной для состояния терминальной диФФеренцировки.
Полученные данные углубляют понимание способа организации структуры хроматиновой Фибриллы и механизмов процесса конденсации-денонденсации хроматина, а также уточняют наши представления о структурно-Функциональных взаимоотношениях в хроматине.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на і Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), на симпозиуме "Ядерные белки и -экспрессия генома" (Канев, 1983), на vin (Цущино, 1984) и їх (Черноголовка, 1987) Всесоюзных симпозиумах "Структура и функции клеточного ядра", на симпозиуме с участием стран-членов СЭВ и СФРЮ "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и клетках" (Пущино, 1985), на vi Всесоюзном симпозиуме по конФормационным ' изменениям биополимеров в растворах (Тбилиси, 1985), на vi конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1988), на ш конференции молодых ученых Института экспериментальной биологии АН Армянской ССР (Ереван, 1988), на viii двухстороннем симпозиуме СССР-ФРГ "Организация генома и регуляция активности.генов" (Иркутск, 1989), на и двухстороннем симпозиуме СССР-США"Структура зукарготического генома и -регуляция
его экспрессии" (Тбилиси, 1989), на Международном симпозиумі "Структура и функции клеточного ядра" (Суздаль, 1989), на vi Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетически: процессов" (Москва, 1990), на vin международном биореологическої конгрессе (Токио, 1992) а также на научной конференции молоды: учёных Института цитологии АН СССР (1987) и на семинарах Институт; цитологии РАН.
Публикации. По тема диссертации опубликовано 7 статей.
Объём работы. Диссертация изложена на стр. машинописногс
текста и состоит из введения, обзора литературы, описанш
материалов и методов исследования, результатов . и обсуждениг
собственных исследовании, выводов и списка литературы, содержащего
названий. Работа иллюстрирована рисунками и таблицами.