Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Моноцитопоэз и его регуляция (обзор литературы) 11
Глава 2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Общая характеристика экспериментальных животных 37
2.2. Экспериментальные модели поражения печени 38
2.2.1. Экспериментальная модель токсического поражения печени 38
2.2.2. Экспериментальная модель аутоиммунного поражения печени 39
2.3. Описание методов исследования 42
2.3.1. Методы выделения и подготовки клеток моноцитарной фракции 42
2.3.2. Получение мазков клеточных элементов моноцитарной фракции 43
2.3.3. Получение монослоя клеточных элементов моноцитарной фракции 43
2.3.4. Иммунологические методы исследования 44
2.3.4.1. Определение жизнеспособности клеточных элементов моноцитарной фракции 44
2.3.4.2. Подсчет количественного состава клеточных элементов моноцитарной фракции 43
2.3.4.3. Оценка миграционных способностей клеток моноцитарной фракции 44
2.3.4.4. Определение рецепторного аппарата клеточных элементов моноцитарной фракции 2.3.4.5. Определение фагоцитарных и микробоцидных свойств клеточных элементов моноцитарной фракции 49
2.3.4.6. Оценка лизосомального аппарата клеточных элементов моноцитарной фракции 50
2.3.4.7. Оценка кислородзависимой метаболической активности клеточных элементов моноцитарной фракции 53
2.3.5. Цитохимические методы исследования 55
2.3.5.1. Оценка содержания гликогена в клеточных элементах моноцитарной фракции 55
2.3.5.2. Оценка миелопероксидазной активности клеточных элементов моноцитарной фракции 57
2.3.5.3. Оценка активности кислой фосфатазы клеточных элементов моноцитарной фракции 59
2.3.6. Иммуногистохимические методы исследования 60
2.3.6.1. Оценка пролиферативной и апоптотической активности клеточных элементов моноцитарной фракции 60
2.3.7. Статистические методы исследования 62
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 63
3.1. Характеристика клеточных элементов моноцитарной фракции костного мозга и периферической крови экспериментальных животных 63
3.2. Анализ миграционной активности клеток моноцитарной фракции костного мозга и периферической крови экспериментальных животных 71
3.3.Анализ распластывания и адгезивных свойств клеток моноцитарной фракции костного мозга и периферической крови экспериментальных животных 79
3.4. Фагоцитарная активность моноцитов костного мозга и периферической крови экспериментальных животных 91
3.5. Характеристика лизосомального аппарата моноцитарных клеток костного мозга и периферической крови экспериментальных животных 101
3.6. Иммуноцитохимическая характеристика моноцитарных клеток костного мозга и периферической крови экспериментальных животных 112
3.7. Кислородзависимая метаболическая активность моноцитарных клеток костного мозга и периферической крови экспериментальных животных 123
3.8. Энзимоцитохимическая характеристика моноцитарных клеток костного мозга и периферической крови экспериментальных животных 137
3.8.1. Характеристика содержания кислой фосфатазы в моноцитарных клетках костного мозга и периферической крови экспериментальных животных 137
3.8.2.Характеристика миелопероксидазной активности в моноцитарных клетках костного мозга и периферической крови экспериментальных животных 143
3.8.3. Характеристика содержания гликогена в моноцитарных клетках костного мозга и перифернической крови экспериментальных животных 148
Заключение 156
Выводы 164
Список литературы 165
- Моноцитопоэз и его регуляция (обзор литературы)
- Характеристика клеточных элементов моноцитарной фракции костного мозга и периферической крови экспериментальных животных
- Характеристика лизосомального аппарата моноцитарных клеток костного мозга и периферической крови экспериментальных животных
- Характеристика содержания гликогена в моноцитарных клетках костного мозга и перифернической крови экспериментальных животных
Моноцитопоэз и его регуляция (обзор литературы)
Первые документально оформленные исследования крови принадлежат к середине XVI столетия. Они имели в большей степени описательный характер и были посвящены таким заболеваниям, как лимфогранулематоз, множественная миелома, пернициозная анемия. Расцвет в описательной гематологии связан с именем Пауля Эрлиха, впервые применившего специальные методы окраски клеток крови. В России огромная роль в развитии становления гематологии принадлежит СП. Боткину, посвятившему свои научные изыскания изучению анемий с позиции центральной регуляции кроветворения.
Многими исследователями в течение достаточно длительного времени велась кропотливая работа над формированием гипотезы кроветворения. В научных кругах рассматривались основные три из предложенных теорий происхождения кроветворных клеток. Как оказалось позже, все предложенные учения были заблуждениями, кроме того, в них не было четко определено место моноцитов как клеток крови.
Особое место в истории занимает унитарная теория кроветворения, предложенная и агрументированно обоснованная русским гистологом профессором А.А. Максимовым в 1909 году. В основе выдвинутого им положения лимфоцит являлся родоначальной клеткой для всех ростков гемопоэза. Позже А.А. Максимов выделил четыре класса клеток в кроветворных тканях (с неограниченной потенцией развития - стволовые клетки; с частично ограниченной потенцией развития - полустволовые клетки; со строго ограниченной потенцией - унипотентные предшественники; полностью дифференцированные клетки, замыкающие и завершающие суицидальный круг развития - дифференцированные клетки), которые вошли в основу современной схемы кроветворения (Гаврилов О.К., 1976). А.А. Максимову (1909) принадлежит и сам термин “стволовая клетка".
Позже, в 1961 году, был установлен факт существования гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Исследователями J.E Till и E.A. McCulloch была создана модель, позволяющая изучать кинетику кроветворных органов, выявлять их свойства на разных уровнях кроветворения. Суть эксперимента заключалась в восстановлении гемопоэза у мышей после смертельной дозы радиоактивного облучения. После трансплантации клеток костного мозга здоровых животных в селезенке облученных реципиентов через 7-Ю дней были обнаружены колонии, состоящие из развивающихся кроветворных клеток. В 1964 году J.P. Lewis с соавторами доказали причастность образующихся в колониях форменных элементов крови ко всем клеточным линиям. A.J. Becker с соавторами (1963 г.) использовали костномозговые клетки с хромосомной меткой. В результате, образовавшиеся в селезенке облученной мыши колонии клеток, имели хромосомную метку донора. Это свидетельствовало о присутствии в костном мозге колониеобразующих кроветворных клеток, отнесенных в разряд стволовых плюрипотентных, существование которых предположил ранее А.А. Максимов. Позже была доказана способность гемопоэтических стволовых клеток к самообновлению и пролиферации, т.е. к продукции большого количества себе подобных клеток.
Гемоцитопоэз представляет собой достаточно сложный процесс. Клеточный цикл делящихся клеток-предшественниц, помимо митоза, включает фазу G1, во время которой происходит подготовка гемопоэтических клеток в синтезу ДНК, S-фазу, характеризующуюся удвоением количества ДНК, и фазу G2, включающую период подготовки к митотическому делению. Продолжительность митотического цикла для морфологически не распознаваемых клеток-предшественниц составляет около 20 часов.
Пролиферативный ресурс стволовых клеток обеспечивается их способностью к симметричному и асимметричному делению (Тверских В.В. и соавт., 2009). В результате симметричного деления происходит логарифмическое нарастание количества дочерних клеток с характеристиками родительской клетки. При асимметричном делении образуется стволовая и более детерминированная клетка, будучи подвергнутая в дальнейшем дифференцировке (Зуева Е.Е., и соавт., 2005; Morrison S.J., Kimble J., 2006; Fuchs E., 2008; Lin H., 2008).
Существовало предположение об образовании резервной ДНК, сохраняющейся для самообновления пула стволовых клеток, и о новообразованной ДНК клеток, подлежащих дальнейшей дифференцировке. Завесу тайны над механизмом асимметричного деления стволовой клетки приокрыли биологи из Университета Джонса Хопкинса в Балтиморе (США). Изучая данный механизм на примере стволовых клеток зародышевой линии самцов дрозофилы (Male Germline Stem Cells, GSC), авторы пришли к выводу, что одна из дочерних хроматид получает «старые» гистоны, другая «новые». Затем в ходе клеточного деления, стволовая клетка получает хроматиды, несущие на себе эпигенетические метки, определяющие идентичность стволовой клетки. В дифференцирующиеся клетки передаются новые молекулы гистонов, на которые может быть нанесена какая-то другая информация (Vuong Tran et a!., 2012).
Механизм реализации асинхронного деления, вероятно, достигается анатомической привязкой одним из полюсов делящейся клетки к клеткам микроокружения, позволяющим сохранить свойства стволовой клетки (Зуева Е.Е. и соавт., 2005). Этот процесс реализуется посредством молекул клеточной адгезии кадгерина и бета-катенина.
Ранее считалось, что начало этапа дифференцировки регулируется транкрипционным фактором Oct-4 (Lengner et al, 2007), обнаруженным только в стволовых клетках млекопитающих. На данный момент опровергнута роль Oct-4 в процессах самообновления и дифференцировки взрослых соматических кроветворных стволовых клеток (Томилин А.Н., 2009). Процесс дифференцировки запускается с прикрепления клеток друг к другу, так как рецепторы адгезии и цитоскелет клеток играет большую роль в передаче сигнала к началу дифференцировки из внеклеточной среды в клеточное ядро. Таким образом, в красном костном мозге происходит самообновление полипотентных стволовых гемопоэтических клеток.
В настоящее время очевидно наличие шести классов дифференцировки клеток периферической крови (Липунова Е.А., 2007). Полипотентная стволовая клетка - морфологически не распознаваемая клетка, условно относящаяся к 1 классу кроветворения. Доля стволовых клеток в тканях взрослого организма очень мала. Например, кроветворные стволовые клетки встречаются с частотой 1:10-15 тыс. клеток костного мозга или 1:100 тыс. клеток периферической крови. В процессе взросления человека наблюдается значительное снижение количества стволовых клеток. По данным литературы, при рождении у ребенка одна стволовая клетка приходится на 10 тыс. обычных клеток, т. е. в организме ребенка присутствует 50 млрд. стволовых клеток. У людей в возрасте 60 лет и старше одна стволовая клетка приходится на один миллион обычных клеток (Гусева Д.С, 2013). В процессе взросления организма количество стволовых клеток существенно снижается за счет изменения их клонального состава, не влияя на свойства отдельных гемопоэтических стволовых клеток (Cho R.H. et al., 2008). Снижение же пролиферативного потенциала в стволовых клетках с возрастом организма не происходит, что ранее было подтверждено проведенными исследованиями (Ross E.A. et al, 1982; Iscove N.N., Nawa K., 1997). Полипотентная стволовая клетка способна к митотическому делению до 100 раз в течение своей жизни.
Миграция стволовых клеток усиливается при патологических состояниях, сопровождающихся нарушениями гомеостаза (гипоксия, радиационные воздействия, химиотерапия, стрессорные воздействия, неопластические повреждения) (Aboody S.K. et al, 2000; 2006; Zhao D. et al, 2012). Стволовые клетки в покоящемся состоянии выполняют две основные функции, заключающиеся в самоподдержании и дифференцировке с образованием коммированных предшественников (Липунова E.A., 2007).
Вслед за классом полипотентных стволовых клеток образуется мультипотентная полустволовая клетка или миелоидная стволовая клетка, называемая также колониеобразующей единицей гранулоцитов, эритроцитов, моноцитов, мегакариоцитов (КОЕ-ГЭММ) и лимфоидная стволовая клетка. Существование класса частично детерминированных клеток выявляется опосредованно. Например, установлено достоверное снижение общего количества клеток миелоидной группы при хроническом радиационном воздействии (Шибкова Д.З., Аклеев А.В., 2006). К ограниченному самоподдержанию способен класс унипотентных клеток-предшественников.
Характеристика клеточных элементов моноцитарной фракции костного мозга и периферической крови экспериментальных животных
Согласно данным литературы (Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В., 2007), одним из показателей гемопоэза является содержание клеток различных ростков в костном мозге. В связи с этим нами определялось содержание клеток моноцитарного ростка в единице объема костного мозга у экспериментальных животных в различные сроки постнатального развития.
Прежде всего, нами установлено, что количество бластных клеток костного мозга у интактных животных после рождения снижается, а к периоду полового созревания вновь увеличивается и стабилизируется, в период половой зрелости суммарное содержание бластных клеток увеличивается и достигает максимального значения (таблица 2). Так, если у интактных крысят, суммарное содержание бластных клеток составляет 0,78±0,03, то у половозрелых крысят данный показатель составил 0,90±0,06. Изменение исследуемого показателя в течение всех сроков исследования имеет волнообразных характер.
Как видно из таблицы 2, аналогичная закономерность обнаружена и у подопытных крысят обеих групп. Так, если у новорожденных крысят (токсическая группа Ol) содержание бластных клеток составляет 0,56±0,11, то в подсосный период данный показатель существенно снижается (0,31±0,08). В период полового созревания он снова увеличивается, достигая максимального значения в период половой зрелости (0,74±0,08).
У животных аутоиммунной группы (02) также после рождения (0,61±0,02) отмечается постепенное снижение исследуемого показателя к подсосному периоду (0,37±0,03). В период полового созревания динамика количественного состава бластных клеток костного мозга имеет волнообразный характер, составляя на 30 день исследования 0,51±0,09, на 45 день - 0,45±0,07. В период половой зрелости количество бластных клеток возрастает до максимальных значений (0,77+0,03). При этом, на большинстве сроков исследования опытных групп отмечается недостоверное снижение исследуемого показателя по сравнению с контролем (таблица 2). Кроме того, нами производилась оценка содержания промоноцитов костного мозга экспериментальных животных. Полученные результаты отражены в таблице 3.
Как видно из таблицы, у интактных крысят после рождения в костном мозге происходит постепенное увеличение содержания промоноцитов, достигающее максимального значения в период половой зрелости. Так, если в период новорожденности у интактных крысят содержание промоноцитов костного мозга составило 0,96±0,03, то у половозрелых животных этой группы исследуемый показатель составил 1,84±0,06. У животных токсической группы (01) содержание промоноцитов в единице объема костного мозга после рождения (0,81±0,06) снижается к подсосному периоду (0,74±0,03), а к началу периода полового созревания существенно увеличивается до показателя превышающего таковой в период новорожденности (0,9±0,04).
К концу периода полового созревания содержание промоноцитов в костном мозге у данной группы животных вновь снижается до 0,82±0,04, однако у половозрелых животных данный показатель резко увеличивается и достигает максимального значения (1,75±0,04)
У животных аутоиммунной группы (02) выявлена другая закономерность. С периода новорожденное (0,84±0,03) до начала периода порлового созревания (0,86±0,08) содержание промоноцитов в единице объема костного мозга изменяется несущественно. К окончанию периода полового созревания исследуемый показатель снижается до 0,79±0,05, а затем, к 60-му дню, возрастает до максимальных значений (1,69±0,12). При этом обращает на себя внимание тот факт, что у подопытных крысят на большинстве сроков исследования содержание промоноцитов в костном мозге достоверно снижено по сравнению с контролем.
Исследование содержания моноцитов в костном мозге экспериментальных животных позволило выявить следующую закономерность. У интактных крысят после рождения происходит постепенное увеличение содержания моноцитарных клеток в костном мозге (таблица 4)
Так, если у новорожденных интактных крысят содержание моноцитов в костном мозге составило 1,56±0,05, то у половозрелых животных данный показатель составил 2,62±0,12.
У новорожденных крысят токсической группы (01) число моноцитов в костном мозге составило 1,32±0,04. Постепенно увеличиваясь, количество моноцитов костного мозга данной опытной группы к 30 дню постнатального развития достигает значения 1,65±0,09, затем, снижаясь к окончанию периода полового созревания (1,54±0,03), достигает максимального значения (2,34±0,08) в период половой зрелости.
У животных аутоиммунной группы (02) после рождения до подсосного периода содержание моноцитов в костном мозге не изменяется. Затем в период начала полового созревания исследуемый показатель несколько увеличивается (1,59±0,11) и практически стабилизируется до окончания полового созревания (1,52±0,05). Однако, у половозрелых животных данной группы содержание моноцитов существенно увеличивается и достигает максимального значения (2,41±0,07). Обращает на себя внимание, что на большинстве сроков исследуемый показатель у опытных групп достоверно снижен по сравнению с контролем.
В отношении количественного состава моноцитов периферической крови новорожденных крысят следует отметить, что число исследуемых клеточных элементов интактных животных при рождении составляет 0,9±0,06, что соответствует 58% от исходного уровня моноцитов костного мозга аналогичного возрастного периода крысят. Такое количественное взаимоотношение моноцитов костного мозга и моноцитов периферической крови согласуется с данными литературы (Кравченко И.Н. и соавт., 2008). В токсической группе животных количество моноцитов периферической крови новорожденных составило 0,72±0,04 (54% от исходного уровня моноцитов костного мозга аналогичного возрастного периода крысят), в аутоиммунной группе — 0,76±0,07 (53% от исходного уровня моноцитов костного мозга аналогичного возрастного периода крысят).
Характеристика лизосомального аппарата моноцитарных клеток костного мозга и периферической крови экспериментальных животных
Главная функция лизосом — ферментативная деградация попавших в них макромолекул и органелл. В настоящее время известно около 40 ферментов, содержащихся в лизосомах (различные протеазы, нуклеазы, гликозидазы, липазы, фосфолипазы, фосфатазы и сульфатазы и др.) (Luzio J.P. et al, 2007). Общим для всех ферментов является то, что они принадлежат к классу кислых гидролаз, проявляя наибольшую активность при рН=5. При кислотности цитозоля 7,2 ферменты неактивны, что защищает цитоплазму от разрушения в случае утечки ферментов (Кольман Я., Рем К-Г., 2000).
Накоплено огромное количество знаний по лизосомам (Пупышев А.Б., 2006). По данным исследователей, костный мозг является распространенным объектом исследования в связи с постепенно нарастающей проблемой терапии лизосомных болезней, использование пересадки костномозговых клеток, внедрения в костномозговые клетки полноценных генов дефектных лизосомных ферментов. На молекулярно-биологическом уровне исследуется участие лизосом в процессах стимулируемого апоптоза (Guicciardi M.E. et al, 2004), панкреонекроза (Halangk W., Lerch М.М. et al, 2000) и другой патологии (Gozuacik D., Kimchi А., 2004). Отмечается наиболее высокий интерес изыскателей к участию лизосом в процессах онкотрансформации клеток, опухолевому росту, к лизосомным болезням накопления и роли лизосом в клеточной гибели и апоптозе.
О состоянии лизосомального аппарата моноцитарных клеток костного мозга и периферической крови мы судили по общепринятой методике (Фрейдлин К. С. и соавт., 1976) с определением числа акридинположительных клеток и индекса лизосомальной активности (рисунок 39,40).
Прежде всего, нами проведен анализ содержания среди моноцитарных клеток костного мозга экспериментальных животных числа акридиноранжпозитивных клеток в различные сроки постнатального онтогенеза. Полученные результаты отражены на рисунке 41. Как видно из рисунка, у интактных животных после рождения происходит увеличение числа акридиноранжпозитивных бластных клеток костного мозга.
Так, если у интактных крысят в период новорожденности число акридиноранжпозитивных клеточных элементов составило 8,33±0,80, то в период половой зрелости исследуемый показатель достигает 13,2±1,22. Аналогичная закономерность выявлена и у подопытных животных, у которых имеет место постепенное увеличение после рождения исследуемого показателя, достигающего максимального значения в период половой зрелости. Так, у животных токсической группы (О1) в период новорожденности количество акридиноранжпозитивных бластных клеток составило 4,66±0,50, постепенно увеличиваясь до периода половой зрелости исследуемый показатель достигает своего максимального значения 11,8±0,90.
В аутоиммунной группе (О2) также имеет место постепенное увеличение исследуемого показателя с 3,96±0,62 в период новорожденнос и до 10,4±0,60 к периоду половой зрелости. Обращает на себя внимание, что на ранних стадиях исследования (период новорожденное и подсосный период) у подопытных крысят число акридиноранжпозитивных клеток достоверно снижено по сравнению с контролем. В то время как на поздних стадиях исследования (период полового созревания и период половой зрелости) наблюдается только тенденция к снижению.
Анализ содержания акридиноранжположительных клеток среди промоноцитов костного мозга экспериментальных животных позволил выявить следующую закономерность (рисунок 42). Как видно из рисунка, у интактных животных число акридиноранжпозитивных промоноцитов костного мозга после рождения постепенно увеличивается и достигает максимального значения на 60-й день постнатальной жизни. Так, если у новорожденных крысят интактной группы исследуемый показатель составил 20,7±0,7, а в период половой зрелости он достигает максимального значения (28,2±0,9).
В то же время, у подопытных животных выявлена другая закономерность. После рождения (18,7±0,62) у подопытных крысят токсической группы (О1) происходит снижение к подсосному периоду (14,3±1,10) числа акридиноранжпозитивных промоноцитов костного мозга. Затем, постепенно увеличиваясь, исследуемый показатель достигает своего максимального значения к периоду половой зрелости (17,4±1,40).
У крысят аутоиммунной группы имеет место другая динамика изменения количества акридиноранжпозитивных промоноцитов с пиками максимальных значений в период новорожденное (17,8±1,12), в период начала полового созревания (15,8±0,70) и в период половой зрелости (16,7±0,81). 22,4
Исследование акридиноранжпозитивных клеток среди моноцитов костного мозга экспериментальных животных позволил выявить следующую закономерность (рисунок 43). Как видно из рисунка, у интактных крысят после рождения происходит постепенное увеличение числа акридиноранжпозитивных моноцитов костного мозга. Согласно нашему исследованию, у интактных новорожденных крысят содержание акридиноранжпозитивных моноцитов составляет 61,8±0,40, а у половозрелых интактных животных исследуемый показатель увеличивается до уровня 94,1 ±1,21. Аналогичная закономерность выявлена и у подопытных животных, у которых после рождения, как видно из рисунка 43, происходит постепенное увеличение числа акридиноранжположительных моноцитов костного мозга, достигающего максимального значения также в период половой зрелости. Так, в токсической группе в новорожденный период исследуемый показатель составил 50,3±1,41, в период половой зрелости -81,7±1,20. У крысят аутоиммунной группы количество акридиноранжпозитивных моноцитов со значения 45,3±1,31 в период новорожденности увеличился до максимальных цифр 81,9±0,90 к периоду половой зрелости. При этом, на всех сроках исследования у подопытных животных имеет место достоверное снижение акридинпозитивных моноцитов.
Обнаруженная закономерность характерна и для моноцитов периферической крови животных новорожденного периода. Так, если количество акридиноранжпозитивных клеток интактных животных составляет 62,8±0,80, то в опытных группах этот показатель значительно снижен: в токсической группе животных он составил 49,7±0,62, в аутоиммунной группе - 46,0±0,71.
Другим показателем состояния лизосомального аппарата является индекс лизосомальной активности (цитохимический показатель лизосомальной активности, отражающий среднюю активность лизосомальных энзимов).
Анализ индекса лизосомальной активности в бластных клетках костного мозга экспериментальных животных позволил выявить следующую закономерность (рисунок 44).
Как видно из рисунка 44, у экспериментальных животных контрольной и подопытных групп индекс лизосомальной активности в бластных клетках костного мозга после рождения постепенно увеличивается и достигает максимального значения в период половой зрелости. Так, у интактных новорожденных крысят индекс лизосомальной активности бластных клеток составляет 0,12±0,07, а у половозрелых интактных животных исследуемый показатель увеличивается до уровня 0,28±0,09.
У подопытных животных токсической группы (О1) после рождения (0,09±0,06) происходит постепенное увеличение индекса лизосомальной активности бластных клеток костного мозга, достигающего максимального значения в период половой зрелости (0,24±0,09). В аутоиммунной группе (О2) прослеживается аналогичная тенденция с уровнем индекса лизосомальной активности в период новорожденности 0,09±0,04, в период половой зрелости 0,22±0,05.
При этом на всех сроках исследования у подопытных животных имеет место достоверное уменьшение среди бластных клеток костного мозга индекса лизосомальной активности.
Характеристика содержания гликогена в моноцитарных клетках костного мозга и перифернической крови экспериментальных животных
Многие процессы в клетке, обеспечивающие ее защитные функции, достаточно энергозависимы. Основным источником энергии в клетке является гликоген, представляющий собой главную форму существования углеводов в организме. Гликоген в клетке хранится в виде особых гранул, диффузно распределенных по цитоплазме, нередко образующими связь с гладким эндоплазматическим ретикулумом. Авторы указывают на тесную связь динамики гранул гликогена с формой митохондрий и их локализацией в клетке, предполагая, что подобное взаимодействие может быть обусловлено необходимостью мобилизации гликогена для энергетических нужд клеток (Nielsen J. et al, 2010). В моноцитах гликоген выявляется в виде мелкой пылевидной зернистости по периферии цитоплазмы клетки (Кишкун А. А., 2005). Количественная характеристика гликогеновых гранул в цитоплазме позволяет оценить энергетическое состояние клетки, являющейся одним из важных показателей ее жизнедеятельности (Юхновец А.А., 2003) (рисунок 70).
Для полного анализа функционального состояния моноцитарных клеток костного мозга изучение энергетического потенциала явилось необходимым этапом нашего исследования.
Анализ содержания гранулярного гликогена в бластных клетках костного мозга у экспериментальных животных позволил выявить следующую закономерность (рисунок 71).
Как видно на рисунке, содержание ШИК-позитивных бластов у интактных животных в период новорожденное составляет 1,75±0,05. Затем к началу периода полового созревания этот показатель увеличивается до уровня 2,23±0,07. После снижения показателя к окончанию периода полового созревания до 2,20±0,02, достигает максимального значения к периоду половой зрелости до 2,28±0,03. В бластных клетках костного мозга токсической группы (О1) животных наблюдается иная тенденция. В период новорожденнос содержание ШИК- позитивных бластных клеток составило 0,81±0,03, постепенно увеличиваясь, исследуемый показатель достигает своего максимального значения к окончанию периода полового созревания (2,18±0,01), после чего уменьшается до 2,10±0,02 к периоду половой зрелости. В опытной группе потомства самок крыс с индуцированным аутоиммунным гепатитом (О2) содержание гликогена в бластных клетках костного мозга в период новорожденности находится на минимальном уровне и составляет 1,58±0,06, после чего показатель увеличивается до 2,03±0,03 к подсосному периоду и стабилизируется, претерпевая незначительные колебания до периода половой зрелости. Характерно, что практически на всех сроках исследования уровень ШИК-позитивных бластных клеток костного мозга опытных групп снижен по сравнению с группой контроля. Исключение составляет период новорожденности. На этом сроке содержание гликогена в бластных клетках животных токсической группы превышает таковой в клетках интактных животных на 0,06 единиц.
В промоноцитах интактных животных после рождения отмечается постепенное увеличение содержания ШИК-позитивного материала, достигающего максимальное значения в период половой зрелости (рисунок 72). Так, если у новорожденных интактных крысят исследуемый показатель составил 2,07±0,05, то у 60-дневных интактных животных содержание гликогена достигает 2,45±0,02. Аналогичная закономерность выявлена и у подопытных животных.
При этом обращает на себя внимание, что, начиная с подсосного периода и до периода половой зрелости, в промоноцитах костного мозга подопытных крысят обеих групп содержание ШИК-позитивного материала снижено по сравнению с контролем. Исключение составили промоноциты костного мозга животных токсической группы периода новорожденности, где уровень содержания гликогена в клетках равен таковому в промоноцитах интактных животных.
Содержание ШИК-позитивного материала в моноцитах костного мозга интактных животных после рождения к подсосному периоду увеличивается, достигая максимального значения 2,77±0,04 (рисунок 73).
К началу периода полового созревания уровень гликогена в исследуемых клетках снижается до минимального значения 2,44±0,06, после чего, к периоду половой зрелости, вновь начинает увеличиваться до 2,56±0,03. В моноцитах костного мозга животных токсической группы (О1) после рождения (2,35±0,07) отмечается постепенное увеличение содержания ШИК-позитивного материала, достигающего максимальное значения к подсосному периоду 2,45±0,06. После значительного уменьшения показателя до 2,27±0,06 к началу периода полового созревания, вновь наблюдается его увеличение к 45-му дню исследования до 2,43±0,04, после чего содержание гликогена в исследуемых клетках к периоду половой зрелости снижается незначительно до 2,4±0,06. Динамика содержания ШИК-позитивных моноцитов костного мозга животных аутоиммунной группы (О2) изменяется аналогичным образом с максимальным значением исследуемого показателя в подсосный период (2,53±0,04) и минимальным значением (2,24±0,03) - в период начала полового созревания При этом обращает на себя внимание, что на большинстве сроков исследования выявлено снижение или тенденция к снижению содержания ШИК- позитивного материала в моноцитах костного мозга подопытных животных.
Содержание ШИК-позитивных моноцитов периферической крови интактных животных составило 2,51±0,07. В опытных группах наблюдения отмечено угнетение исследуемого показателя до 2,43±0,05 в токсической группе и в аутоиммунной группе до 2,39±0,04.
Полученные нами данные выявивили снижение гранулярного гликогена, а следовательно, уменьшение энергетического потенциала моноцитарных клеток костного мозга и периферической крови потомства животных с индуцированным хроническим поражением печени.
Известно, что изменение физиологического состояния организма и различные заболевания приводят не только к изменению содержания гликогена в клетках, но нередко сопровождаются модификацией его структуры (Reyes-Gordillo K. et al., 2000; Muriel P. et al., 2005; Chavez E. et al, 2006; Mpabanzi L. et al., 2012). Так, было показано снижение содержания ШИК-позитивных клеточных элементов нейтрофильного ряда и макрофагов у потомства самок крыс с экспериментальным токсическим, лекарственным гепатитом (Невзорова Н.В., Брюхин Г.В., 2012; Шаврина Е.Ю., Брюхин Г.В., 2012; Шаврина Е.Ю., 2012; Шопова А.В., 2015). Снижение содержания гликогена в моноцитарных клетках свидетельствует о метаболическом истощении фагоцитов, сопровождающимся угнетением их цитохимической и микробоцидной активности. Особенно это наглядно демонстрируется при длительнотекущих патологических процессах в организме (Филинюк О.В., и соавт., 2007), при экспериментальной кровопотере (Кузнецов М.Е., 2004), при усугублении диспластических процессов в эпителии шейки матки (Богдасаров А.Ю., Родкина Р.А. и соавт., 2002).