Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Современные представления о возможностях применения биодеградируемых полимерных материалов в лечении термических поражений кожи (обзор литературы). 12
1.1 Общие сведения об ожоговых поражениях и течении раневого процесса 12
1.2 Основные морфофункциональные единицы кожи, принимающие участие в заживлении кожного дефекта и рубцевании 1.3 Роль гиалуроновой кислоты в патогенезе раневого процесса 22
1.4 Современные подходы к лечению ожогов 27
1.5 Перспективы применения в комбустиологии композиций, включающих клетки и элементы внеклеточного матрикса 34
Глава 2. Материалы и методы исследования 42
2.1 Объекты исследования 42
2.2 Характеристика эксперимента in vitro в культуре мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга 45
2.3 Характеристика эксперимента in vitro в культуре дермальных фибробластов и макрофагов 47
2.3.1. Способ получения фибробластов в культуре in vitro 47
2.3.2. Организация эксперимента в культуре дермальных фибробластов 48
2.3.3 Способ получения макрофагов 54
2.3.4. Исследование влияния биоматериала на макрофаги 55
2.4 Экспериментальные исследования in vivo 56
2.4.1 Характеристика эксперимента 56
2.4.2 Моделирование локального глубокого ожога III степени.
2.5 Статистическая обработка полученных данных 62
ГЛАВА 3. Результаты изучения свойств биопластического материала «гиаматрикс» в культуре мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток 64
ЗЛ Характеристика биосовместимости биопластического материала «Гиаматрикс» в культуре мезенхимальных стромальных стволовых клеток человека 64
3.2 Результаты изучения иммунофенотипа мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток 86
ГЛАВА 4. Тестирование биопластического материала «гиаматрикс» в культуре дермальных фибробластов и на макрофаг ах 89
4 Л Морфофункциональная характеристика тест-системы - культуры дермальных фибробластов 89
4.2. Изучение биосовместимости материала «Гиаматрикс» при внесении образца на монослой фибробластов 92
4.3. Биосовместимость материала «Гиаматрикс» при одновременном посеве фибробластов и помещении материала в культуру клеток 98
4.4. Исследование влияния биоматериала на макрофаги 103
ГЛАВА 5. Результаты исследования эффективности биоматериала «гиаматрикс» при ожогах iii степени в эксперименте in vivo по
5.1 Определение площади ожога ПО
5.2 Результаты морфологической верификации ожога у крыс в эксперименте 111
5.3 Характеристика регенераторных процессов глубокого ожога в динамике в условиях применения стандартной местной мазевой терапии..
5.3.1 Характеристика ожоговой раны у животных на 1 сутки в условиях применения стандартной местной терапии 113
5.3.2 Характеристика ожоговой раны у животных на 3 сутки в условиях применения стандартной местной терапии
5.3.3 Характеристика ожоговой раны у животных на 14 сутки в условиях применения стандартной местной терапии 116
5.3.4 Характеристика ожоговой раны у животных на 30 сутки в условиях применения стандартной местной терапии 118
5.3.5 Характеристика ожоговой раны у животных на 45 сутки в условиях применения стандартной местной терапии 121
5.3.6 Характеристика ожоговой раны у животных на 90 сутки в условиях применения стандартной местной мазевой терапии 123
5.4 Характеристика процесса заживления кожи в динамике при глубоком ожоге в условиях применения биоматериала «Гиаматрикс» 125
5.4.1 Характеристика ожоговой раны у животных на 1 сутки в условиях применения биоматериала «Гиаматрикс» 125
5.4.2 Характеристика ожоговой раны у животных на 3 сутки в условиях применения биоматериала «Гиаматрикс» 126
5.4.3 Характеристика ожоговой раны у животных на 14 сутки в условиях применения биоматериала «Гиаматрикс» 130
5.4.4 Характеристика ожоговой раны у животных на 30 сутки в условиях применения биоматериала «Гиаматрикс» 133
5.4.5 Характеристика ожоговой раны у животных на 45 сутки в условиях применения биоматериала «Гиаматрикс» 136
5.4.6 Характеристика ожоговой раны у животных на 90 сутки в условиях применения биоматериала «Гиаматрикс» 137
Заключение 139
Выводы 149
Практические рекомендации 150
Список литературы
- Перспективы применения в комбустиологии композиций, включающих клетки и элементы внеклеточного матрикса
- Способ получения фибробластов в культуре in vitro
- Результаты изучения иммунофенотипа мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток
- Изучение биосовместимости материала «Гиаматрикс» при внесении образца на монослой фибробластов
- Характеристика ожоговой раны у животных на 1 сутки в условиях применения стандартной местной терапии
Введение к работе
Актуальность. Термические поражения представляют серьезную медико-
социальную проблему. Ежегодно в мирное время от ожоговых травм умирает около
60 тыс. человек [Алексеев А.А.и др., 2009; Jabir S. et al., 2013; Lai A. et al., 2013]. В
Российской Федерации каждый год регистрируется более 800 000 обожженных, из
которых 30-40 % - дети. Из общего числа инвалидов в нашей стране обожженные
составляют до 23 %. По длительности и тяжести течения ожоговая болезнь
лидирует среди различных вариантов травматической болезни [Гусак В.К. и др.,
2000; Шурова Л.В. и др., 2006; Conti E., 2013]. В настоящее время отмечается
значительный рост локальных глубоких ожогов, при которых зона повреждения не
превышает 10% поверхности тела. Лечение таких больных представляет собой
серьезную медико-социальную проблему, значение которого с каждым годом
возрастает [Пальцин А.А. и др., 2002; Будкевич Л.И., Мирзоян Г.В., 2005;
Mogoianu G.D., Grumezescu A.M., 2014].
Одной из основных задач лечения пострадавших от ожогов на протяжении
всей истории развития комбустиологии является своевременность и полнота
восстановления кожного покрова, утраченного в результате ожоговой травмы
[Музыкант Л.И., Дудникова Г.Н. 1975; Соболева И.В. и др., 2007; Conti E., 2013;
Гильмутдинова И.Р., 2013]. Разработка и внедрение в клинику новых средств и
изделий медицинского назначения для лечения ожогов позволит приблизить
реализацию актуальной задачи оптимизации лечения и реабилитации
пострадавших с термическими ожогами кожи [Theoret C., 2009; Aust M.C. et al., 2010; Roh Y.S. et al., 2010; Simsek S. et al., 2011; Thuaksuban N. et al., 2011].
В последние годы в различных областях медицины широко используются материалы биогенной природы [Островский Н.В., 2007; Войнов Н.А., 2009; Волова Л.Т., 2011]
Перспективным направлением считается использование биопленок на основе гиалуроновой кислоты (ГК), которая представляет собой естественный компонент межклеточного вещества различных тканей [Костина Г. и др., 1999; Day A. J., De la Motte C.A., 2005; Bloemen M.C. et al., 2010;]. Многие исследователи рассматривают ГК в качестве одного из перспективных материалов для решения задач восстановительной хирургии и тканевой инженерии [Матчин Е.Н. и др., 2002; Винник Ю.С. и др., 2011; Ning S.N. et al., 2012; Hurler J. et al., 2012; Qiu X.W. et al., 2013]. Установлено, что относительно высокая концентрация ГК во внеклеточном пространстве в процессе регенерации тканей частично ограничивает отложения внеклеточного матрикса и коллагена, что предполагает роль ГК в предотвращении фиброза и формировании рубцовой ткани
[Григорьева Т.Г. и др., 2006; Goueffic Y. et al., 2006; Garcia-Gareta E. et al., 2013]. Однако в медицине наиболее часто используется химически модифицированная ГК, однако эффективность их клинического применения не достаточно высокая [Pielesz A., Paluch J., 2012; Chen X. et al., 2013; Qiu X.W. et al., 2013].
Принципиально новый способ получения биоматериала на основе нативной гиалуроновой кислоты, обогащенный матричными пептидами и коллагеном, был разработан в Оренбурге Рахматуллиным Р.Р. С помощью метода фотохимического наноструктурирования гидроколлоида ГК был получен биопластический материал «Гиаматрикс» с заданными биоинженерными свойствами (патент РФ № 2367476 от 21.03.2008 г. Биопластический материал). Впервые на базе Оренбургской государственной медицинской академии было проведено экспериментально - клиническое обоснование возможности применения этого материала в отолорингологии и офтальмологии [Забиров Р.А. и др., 2007, Стадников Б.А. и др, 2009, Канюков В.Н. и др., 2014].
Разработка и внедрение в клинику новых медицинских технологий с использованием биоматериалов и изделий медицинского назначения для лечения глубоких локальных ожогов позволит приблизить реализацию актуальной задачи улучшения лечения и реабилитации лиц с термическими ожогами кожи.
На основании вышеизложенного целесообразным представляется
проведение комплексной морфофункциональной оценки процессов регенерации кожи на клеточном, тканевом и организменном уровнях в условиях применения биопластического материала «Гиаматрикс» для обоснования лечения глубоких локальных дермальных ожогов III степени.
Цель исследования: экспериментально-морфологическое обоснование эффективности применения биопластического материала на основе нативной гиалуроновой кислоты при глубоких локальных ожогах кожи.
Задачи исследования:
-
Провести in vitro на культуре мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) человека тестирование на цитотоксичность и биосовместимость материала «Гиаматрикс».
-
Оценить влияние биопленки «Гиаматрикс» на функциональную и пролиферативную активность фибробластов человека и жизнеспособность макрофагов мышей в условиях in vitro.
-
В эксперименте на модели локального дермального ожога III степени у крыс исследовать влияние материала «Гиаматрикс» на характер регенеративного процесса.
-
Провести in vivo сравнительную оценку результатов применения биоматериала «Гиаматрикс» и стандартной мазевой терапии при локальных глубоких ожогах кожи в условиях эксперимента.
Научная новизна.
Впервые было проведено комплексное исследование воздействия материала «Гиаматрикс» на 3 типах клеток (мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, дермальные фибробласты и макрофаги), участвующих в разных фазах раневого процесса, подтвердившее его биосовместимость и отсутствие цитотоксичности.
В экспериментальных исследованиях in vitro показано положительное
влияние биополимера «Гиаматрикс» на жизнеспособность и пролиферативную активность культур ММСК и фибробластов человека.
Впервые на модели локального ожога кожи III степени площадью 7 % от поверхности тела у крыс показан репаративный характер регенеративного процесса кожи при разработанном хирургическом лечении с использованием «Гаматрикса».
Продемонстрировано, что при применении исследуемого в работе материала на месте экспериментального ожога III степени формируется органотипический регенерат, сопровождающийся полноценной эпителизацией, восстановлением дериватов кожи и утраченного объема дермы.
Установлено, что эффективность применения «Гиаматрикса» при
моделировании глубокой ожоговой раны в эксперименте обусловлена
противовоспалительным и регенераторным эффектами исследуемого биоматериала.
Впервые показано, что проведение ранней некрэктомии с последующим наложением биопластического материала «Гиаматрикс» оптимизирует процесс регенерации в области ожоговой раны за счет сохранения структуры и функции подкожно-жировой клетчатки, играющей важную роль в восстановлении структуры кожи.
В ходе исследования получен патент РФ №2458709 от 28.12.2012 г. «Биопластический материал».
Теоретическая и практическая значимость работы.
Результаты проведенного исследования имеют фундаментальное значение для развития учения о репаративных гистогенезах.
Разработана методология комплексной оценки влияния материала
«Гиаматрикс» на клетки - участники разных этапов раневого процесса.
Результаты доклинических исследований, проведенных как in vitro - на
культурах клеток, так и in vivo - на экспериментальных животных,
свидетельствуют об эффективности применения биопластического материала
«Гиаматрикс» в лечении ожогов III степени.
Предложен алгоритм, включающий раннюю первичную хирургическую обработку области термического повреждения кожи с дальнейшим наложением на раневую поверхность материала «Гиаматрикс», обеспечивающий репаративную регенерацию кожи на месте глубокого локального ожога III степени.
Показано, что применение биодеградируемого материала «Гиаматрикс» не требует наложения дополнительной повязки на ожоговую рану и проведения последующей аутодермопластики.
Данные, полученные в ходе выполнения исследования, позволяют рекомендовать данный материал для применения в медицинской практике в качестве монотерапии глубоких локальных термических поражений кожи.
Внедрение в практику.
Результаты исследования применяются в образовательном процессе кафедры оперативной хирургии и клинической анатомии с курсом инновационных технологий ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Минздрава России» и используются в научной деятельности химико-биологического факультета ФГБОУ ВПО "Оренбургский государственный университет".
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Результаты исследования in vitro на цитотоксичность и
биосовместимость материала «Гиаматрикс» на культурах ММСК, фибробластов человека, а также на резидентных макрофагах мыши свидетельствуют об отсутствии токсического действия биоматериала на клетки и его положительном биологическом эффекте.
2 . В эксперименте in vivo применение биоматериала «Гиаматрикс»
после ранней некрэктомии при лечении локальных термических ожогов кожи III степени более эффективно по сравнению с мазевой терапией. Это обусловлено способностью материала в комбинации с ранней первичной хирургической обработкой области повреждения снижать выраженность воспалительной реакции в ране и сокращать сроки регенерации покровов тканей с формированием органотипического регенерата.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на
Всероссийском конкурсе инновационных проектов «Система-Саров-2010»
(Нижний Новгород, 2010), на собрании третьей Всероссийской школы-семинара
студентов, аспирантов и молодых ученых по направлению «Наноинженерия»
(Калуга-Москва, 2010); на Всероссийской конференции с международным
участием «Доклинические исследования в инновационной медицине
и биотехнологиях» (Самара, 2013), Объединенном XII конгрессе международной ассоциации морфологов и VII съезда российского научного медицинского общества анатомов, гистологов и эмбриологов (Тюмень, 2014),.на заседании Самарского отделения научно-медицинского общества анатомов, гистологов и эмбриологов (Самара, 2015).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 7 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования РФ для публикаций основных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Получен 1 патент РФ на изобретение.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 174 страницах и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 3 глав результатов исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 269 источников, в том числе 160 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 81 рисунком.
Перспективы применения в комбустиологии композиций, включающих клетки и элементы внеклеточного матрикса
Термические поражения представляют серьезную медико-социальную проблему, ежегодно в мирное время от ожоговых травм умирает около 60 тысяч человек. Частота ожогов возрастает вследствие интенсивного технического перевооружения промышленности и быта [Jabir S. et al., 2013]. В Российской Федерации регистрируется более 800 тыс. обожженных в год, из них около 30-40 % - дети. Инвалиды вследствие ожогов составляют около 23 % в общей структуре инвалидности [Гусак В.К. и др., 2000; Шурова Л.В. и др., 2006; Conti Е., 2013].
Кожа является органом с целым рядом функций (барьерной, теплозащитной, теплопроводной, выделительной, дыхательной, иммунной) [Chen X.etal., 2013].
По характеру действующего фактора ожоги подразделяют на термические, химические, электрические, лучевые.
По локализации выделяют: ожоги функционально активных частей тела (конечностей); ожоги неподвижных частей тела (туловища); ожоги лица; ожоги волосистой части головы; ожоги промежности; ожоги верхних дыхательных путей [Григорьева Т.Г. и др., 2006].
Еще в 1962 г. Lorthioir J. на основании изучения нескольких сотен публикаций об ожогах, пришел к выводу об отсутствии единой классификации ожогов [Lorthioir J., 1962]. В историческом плане вероятно наиболее полный анализ разработанных классификаций поражения кожи при ожогах выполнен и представлен Т.Я.Арьевым (1966). Большинство классификаций ожоговых ран построено на принципе, в соответствии с которым степень ожога определяется глубиной омертвения кожи. Ткани, расположенные глубже подкожной клетчатки, в классификациях ожоговых ран, как правило, не учитываются, вероятно, потому, что первичный некроз их наступает не более чем в 1-2% всех ожогов. Однако именно этот факт в должной мере не учитывается рядом авторов [Алексеев А.А., Лавров В.А., 2009].
До конца XX в. широко использовались трехстепенные классификации, имеющие своим прообразом старинную классификацию Фабриция Хильдана (Fabricius Hildanus, 1607).
В основу 2-степенных классификаций была положена идея подразделения ожоговых ран на подлежащие и не подлежащие оперативному лечению, поскольку в большинстве из них различаются ожоговые раны с частичным и полным некрозом кожи. В настоящее время специалисты нередко выбирают именно этот подход при массовых поражениях термическими факторами, используя его в период сортировки пострадавших.
В то же время в соответствии с МКБ-10 для оценки глубины поражения рекомендуется использовать трехстепенную классификацию ожогов: - первая степень ожога характеризуется поражением эпидермиса; - вторая степень сопровождается потерей эпидермиса и части дермы; - третья степень характеризуется глубоким некрозом всех слоев кожи и подлежащих тканей.
Ранее классификация ожогов не подвергалась детальному обсуждению, часть практикующих врачей при постановке диагноза основывалась на 3-х степенной классификации, другие же придерживались 4-х степенной классификации ожогов.
На XX съезде хирургов Украины в 2002 г. была утверждена классификация ИНВХ им. В.К. Гусака АМН Украины, включающая 4 степени ожогового поражения: I ст. - эпидермальный ожог (соответствует 1-2 степени по классификации 1961 г.) II ст. - дермальный поверхностный ожог (ЗА ст.) III ст. - дермальный глубокий ожог (ЗБ ст.) IV ст. - субфасциальный ожог (4 ст.)
Позже на II съезде комбустиологов России (2008) был рассмотрен переход от отечественной классификации глубины термического поражения, принятой в 1960 г. на 27 Всесоюзном съезде хирургов, на классификацию международного классификатора болезней - МКБ- 10. По глубине согласно 4-х степенной классификации ожоги делились на: а) поверхностные: I степени - повреждение верхнего слоя ороговевающего эпидермиса, для которого характерны: гиперемия, отек, боль. Рана динамична, может трансформироваться во II ст. через несколько часов. II ст. - повреждение эпидермиса до росткового слоя. Для нее характерны небольшие пузыри, при этом кожа розовая и влажная, отмечается выраженная болезненность. Капиллярный пульс на дне раны сохранен. III А степень ожога представляет собой частичную гибель дермы или собственно кожи. Болевая чувствительность снижена или отсутствует. Проявления: пузыри большого размера, толстостенные, напряженные, могут содержать до 1 л жидкости, нередко имеют сливной характер. При разрушении пузыря дно раны имеет белесоватый вид с розовыми вкраплениями, рана сухая, болевая чувствительность снижена или отсутствует. Цвет раны - коричневый, рана может быть имбибирована парами и копотью, в таких случаях симулирует IV ст. ожога.
Способ получения фибробластов в культуре in vitro
Экспериментальное - морфологическое исследование выполнено на базе Института экспериментальной медицины и биотехнологий Самарского государственного медицинского университета (ректор - академик РАМН Г.П. Котельников, директор ИЭМБ - доктор медицинских наук профессор Л. Т. Волова) и на базе государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Самарский областной центр планирования семьи и репродукции» (директор - кандидат медицинских наук О.В. Тюмина).
Эксперименты выполнены с использованием двух модельных систем: - клеточной: на мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках костного мозга, дермальных фибробластах человека и на резидентных макрофагах мыши; - на лабораторных животных - белых лабораторных крысах обоего пола.
На клеточном, тканевом и организменном уровнях изучены биологические эффекты применения биопластического материала на основе гиалуроновой кислоты «Гиаматрикс» (Регистрационное удостоверение № ФСР 2011/10313 от 18 марта 2011 г.).
Вид образца материала представлен на рисунках 2.1 и 2.2. Материал запечатан в стерильную упаковку, является стерильным, представляет собой пленку толщиной 1-3 мм, бледно-желтого цвета с гладкой поверхностью. Материал эластичен, легко режется инструментом, при световой микроскопии однороден (рисунок 2.3). Рисунок 2.1. Материал «Гиаматрикс» в стерильной упаковке
Биопластический материал «Гиаматрикс» [Рахматуллин P.P. и др., 2009] разработан на основе ГК - линейного несульфатированного гликозаминогликана, содержащего от 2000 до 25 000 дисахаридных единиц D-глюкуроновой кислоты и К-ацетил-Б-глюкозамина, соединенных между собой бета-1,3- и бета-1,4-гликозидными связями [Рахматуллин P.P., 2011; Hurler J. et al., 2012; Qiu X.W. et al., 2013]. ГК представляет собой полианион, поэтому материал гигроскопичен, эффективно связывает молекулы воды и образует вязкий гидрогель.
При производстве биоматериала «Гиаматрикс» исходный гидрогель ГК подвергнут воздействию ультрафиолетового облучения {Хтах = 230 нм), в результате чего происходила фотохимическая сшивка макромолекул. Это придает биоматериалу оптимальные биоинженерные свойства: эластичность, адгезию, дренажные качества и значительно улучшает биосовместимость за счет его метаболизации в ране. Кроме того, для приготовления полимера не используются химические реагенты, вследствие чего в биоматериале отсутствуют химические примеси. 2.2. Характеристика эксперимента in vitro в культуре мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки были получены из костного мозга взрослого человека после подписания информированного согласия на получение биологического материала. Доброволец находился на лечении в сосудистом отделении Самарской областной клинической больницы им. М.И. Калинина по поводу атеросклероза нижних конечностей и участвовал в научном проекте по использованию аутологичных клеток в лечении атеросклероза. Донор был обследован на ВИЧ, RW, гепатит В, С; результаты анализов отрицательные.
Мезенхимальные клетки, полученные из костного мозга, культивировали в пластиковых флаконах («Orange Scientific», Бельгия) площадью 25 см2 в питательной среде аМЕМ (Sigma) с добавлением 2 мМ аланил-глютамина (Invitrogen) и 10% отборной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Gibco) при температуре 37 С и концентрации С02 - 5% в ССЬ инкубаторе (МСО-150, Sanyo, Япония) до достижения монослоя. Затем клетки снимали с культурального пластика 0,25% трипсином. Действие трипсина останавливали питательной средой аМЕМ (Sigma), содержащей 2 мМ аланил-глютамина (Invitrogen) и 10% отборной ЭТС (Gibco).
Для эксперимента образцы клеток были разделены на две группы -контрольную и опытную, в каждой по 8 образцов. Культивирование в обеих группах проводили в течение 26 суток в одинаковых условиях при температуре 37 С и концентрации С02 5%.
В контрольной группе клетки вносили в чашки Петри с питательной средой в концентрации 1362 клетки на 1 см2 культурального пластика.
Перед исследованием материал «Гиаматрикс» был регидратирован в стерильном фосфатно-солевом буфере путем многократного погружения и активного помешивания материала в растворе. Перед внесением клеток на пластик в него помещали изучаемый материал размером 0,5 х 0,5 см. Клетки вносили в питательную среду в концентрации 1362 клетки на 1 см" культурального пластика.
Нативные культуры изучали, фотографировали и проводили морфометрию на 1, 3, 7, 11, 15, 20, 26 день культивирования.
Оценка площади клеток была выполнена на аппаратно-программном комплексе Axio Observer Al. (Carl Zeiss) с помощью программного обеспечения Axio Vision.
Кластерный анализ культуры осуществляли на программном комплексе Image J 1.43m и Image Pro Plus 6.0.
Подсчет клеток проводили с использованием аппаратного комплекса Vi-Cell XR, фирмы Becman Coulter. В данном аппарате применяется автоматизированная технология определения жизнеспособности клеток методом окрашивания трипановым синим.
Подсчет клеток и определение жизнеспособности осуществляли перед посевом и по окончании культивирования. На основании полученных данных проводили расчет пролиферативной активности по следующим формулам: [loglQCVff) - log 10(іЯ1)] log 10(2) (2.1) где, NH1 - количество клеток при посеве культуры; NH - количество наращенных клеток [Vincent J., 1998]; На основании вышеуказанной формулы мы получили данные о количестве удвоений культуры за период культивирования. Скорость удвоения культуры (удвоения/ч) рассчитывали по формуле: Dt х = а (2.2) где, Ct - Продолжительность культивирования, ч; Dt - количество удвоений культуры [Vincent J., 1998];
Для выявления клеток на биоматериале Гиаматрикс окраску ядерным флуоресцентным красителем DAPI проводили в конце эксперимента на 26 сутки культивирования. Окраску красителем Гимза также осуществляли на 26 сутки эксперимента.
Иммунофенотипирование проводили на проточном цитофлюориметре FACS Canto (Becton Dickinson), непосредственно перед посевом и после снятия клеток на 19 и 26 сутки культивирования.
Определяли антигены на поверхности клеток с помощью моноклональных антител (Becton Dickinson): анти CD 90, CD 44, CD 45, CD73, HLA - DR, HLA - ABC, антитела против антигенов CD 34, CD 105, CD 14, меченные фикоэритрином (РЕ) или флюоресцеинизотиоцианатом (FITC).
Для анализа использовали суспензию с содержанием не менее 3x10Э клеток, контролем служили клетки, не обработанные антителами. Учитывая однотипность красителей на различных антителах и отсутствие возможности установки компенсации флюоресценции, проводили одноцветный анализ для каждого антитела. Показатели флюоресценции интерпретировали в программе FACS Diva 5.0.
Результаты изучения иммунофенотипа мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток
Экспериментальное исследование in vivo проведено на 50 белых лабораторных крысах обоего пола с соблюдением всех этических требований, предъявляемых к работе с экспериментальными животными (Приказ №755 МЗ ССР от 12.08.77 г.). Все крысы содержались в индивидуальных клетках, в закрытом теплом помещении вивария, где проходили необходимый карантин. Питьевой и водный режим были обычными, соблюдался световой режим. Масса животных в начале эксперимента составляла 170 - 190 г.
На крысах моделировали ожог III степени, площадь которого составила 7% поверхности тела (В.В. Болтовская, 2006). Для нанесения термического ожога использовали устройство, состоящее из цилиндрического плоскодонного стеклянного стакана, воду в котором доводили до кипения с помощью кипятильника. Температуру воды контролировали при помощи термометра.
После моделирования ожога крысы были разделены на 2 группы: экспериментальная группа и группа сравнения (таблица 2.2).
В рамках выполнения этой части работы не использовали животных с моделью ожога 3 степени без лечения, при этом основывались на литературных данных, свидетельствующих, что нелеченые глубокие ожоги III степени площадью более 10 % несут серьезную угрозу для организма и приводят к гибели животных в течение первых 10 суток с начала эксперимента [Болтовская В.В., 2006].
В течение всего эксперимента животных ежедневно осматривали, проводили планиметрию поверхности ожоговой раны, отмечали их общее состояние, активность, характер волосяного покрова, состояние раны и окружающих тканей.
Животных выводили из эксперимента путем введения летальной дозы тиопентала натрия через 3, 14, 30, 45 суток и на 90 сутки после воспроизведения ожога. Во все указанные сроки забирали материал для гистологического исследования.
Область раневого дефекта с прилегающей кожей вырезали с захватом прилежащих мышц и фиксировали в 12 % растворе нейтрального формалина, затем проводили по спиртам возрастающей крепости и заливали в целлоидин-парафин.
Серийные парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизон для верификации коллагеновых волокон. Всего было изготовлено и изучено 96 гистологических препаратов. Гистологические срезы толщиной 5 мкм изучали, анализировали и фотографировали с помощью автоматизированной аналитической системы, включающей микроскоп «Olympus ВХ 41», цифровую фотокамеру Prog RCF и компьютер. Для анализа изображений использовали программу «Морфология 5.2» (ВидеоТест, Санкт-Петербург).
При моделировании ожога у экспериментальных животных в качестве наркоза применяли комбинированную анестезию (рометар + золетил) в дозе 0,1 мл на 100 г массы тела. Кожу в межлопаточной области тщательно выбривали, дважды обрабатывали 70% спиртом. Для формирования ожога использовали цилиндрической формы емкость. Воду в емкости нагревали с помощью кипятильника до кипения, после этого дно посуды прикладывали к выбритому участку кожи на фиксированное время 35 с, в результате чего образовывался ожог III степени (рисунок 2.6).
В первые минуты после воздействия температурного фактора наблюдалось побледнение кожи с ограничением зоны поражения (рисунок 2.7). В течение первых 5 минут после моделирования ожога была выполнена первичная хирургическая обработка раны. Пораженный участок кожи иссекали, рану обрабатывали 3% раствором перекиси водорода и подсушивали (рисунок 2.8). Рисунок 2.7. Зона ожога в первые минуты после воздействия температурного фактора, межлопаточная область. Побледнение кожи в области ожоговой раны
Первичная обработка раны в первые часы после моделирования ожога. Иссечение некротизированного участка кожи Из биоматериала вырезали фрагмент по размеру раны, помещали его в емкость с хлоргексидином на 2 мин. Отмечали высокую гидрофильность материала. После регидратации «Гиаматрикс» помещали на подготовленную рану, как показано на рисунке 2.9.
В группе сравнения проводили лечение ожоговой раны стандартным способом с применением местных лекарственных средств. Рану до отторжения струпа обрабатывали многокомпонентным препаратом на водорастворимой основе «Левомеколь», затем вели под повязкой с мецилурациловой мазью до заживления (рисунок 2.10).
Рисунок 2.10. Группа сравнения. Стандартное лечение ожога III степени: наложение повязки с Левомеколем. Фиксирование рамки к краям раны для предотвращения констрикции После нанесения биоматериала кровотечение из раны у экспериментальных животных останавливалось, пленка «Гиаматрикс» хорошо прилипала к ране и легко моделировалась. Для предупреждения контракции раны к ее краям пришивали рамку, как представлено на рисунке 2.11.
Статистическая обработка данных выполнена с помощью пакета прикладных программ Statistica 10.0 с учетом современных требований к предъявлению результатов статистического анализа [Реброва О.Ю., 2002; Боев В.М. и др., 2014]. Анализ качественных переменных выполняли путем расчета и оценки относительных частот. Для описания количественных данных изначально проводили анализ характера распределения при помощи расчета критерия Шапиро - Уилка. Если уровень статистической значимости критерия превышал величину 0,05, то распределение считали соответствующим закону нормального распределения. В данном случае количественные данные описывали при помощи средней арифметической величины, а их вариабельность определяли по среднеквадратическому отклонению, данные представляли в формате М±б; где М - среднее арифметическое величина, б - среднеквадратическое отклонение.
В случаях несоответствия показателей выборки закону нормального распределения использовали для описания медиану, нижний и верхний квартиль (Me, Q25; Q75); где Me - медиана, Q25 и Q75 - нижний и верхний квартиль соответственно.
Для определения статистической значимости различий между сравниваемыми группами по качественным переменным использовали критерий х - квадрат Пирсона.
Количественные переменные при парном сравнении сопоставляли при помощи расчета критерия Стьюдента, при обязательной проверке соответствия распределения в группах закону нормального распределения и равенства дисперсий в группах (определяли по критерию Левина). Если условия не выполнялись, использовали критерий Манна-Уитни.
Множественные сравнения проводили при помощи дисперсионного анализа либо непараметрического дисперсионного анализа Краскела -Уоллиса. Статистическую значимость различий в связанных группах по количественным признакам оценивали при помощи критерия Вилкоксона (парные сравнения), либо непараметрического дисперсионного анализа (множественные сравнения). Различия в сравниваемых группах считались статистически значимыми при доверительной вероятности не менее 95% 0X0,05).
Результаты изучения иммунофенотипа мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток
Морфологические признаки без особенностей, преимущественно клетки имели малые размеры, четкие, ровные края, 2-3 отростка, которыми клетки соединялись друг с другом. Цитоплазма МСК была равномерной, без включений, ядра четкие с одним и более ядрышками.
Общая плотность колоний на 26 сутки составляла 100% за исключением участков расположения материала (10-15% площади пластика).
На 26 сутки после начала эксперимента клетки опытной группы также снимали раствором трипсин-версена, подсчитывали и анализировали на проточном цитофлюориметре. Количество получаемых клеток с одной культуральной посуды (20.3 см ) составило 1, 500 000 млн. в опытной группе против 750 000 клеток в контрольных образцах.
Соотношение между незрелыми, взрослыми и гигантскими клетками в опытных и контрольных образцах существенно не различалось (таблица 3.5). В контрольной группе отмечено некоторое превышение количества гигантских клеток, что говорит о незначительном уменьшении пролиферативной активности культуры в этих образцах по сравнению с опытными образцами, где использовался «Гиаматрикс».
В группе с применением биоматериала скорость удвоения составила 0,01 удвоения/ч (0,220 удв./сут) при общем количестве удвоений 5,73. В то же время в контрольных образцах скорость удвоения составила 0,01 удвоения/ч (0,249 удв./сут), при общем количестве удвоений 4,57, то есть ниже, чем в группе с добавлением материала «Гиаматрикс» (таблица 3.6). ТаблицаЗ.6 Пролиферативная активность клеток при культивировании мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток с использованием различных материалов
Показатели Контроль Гиаматрикс Удвоений в час 0,01 0,01 Количество удвоений 4,57 5,73 Различия в скорости пролиферации не достоверны р 0,05, то есть скорость пролиферации была одинаковой.
Полученные данные не выявили признаков токсичности исследуемого материала. Исследование показало удовлетворительный рост клеток в присутствии биоматериала «Гиаматрикс». Отмечено изменение морфологической картины при совместном культивировании клеток с биоматериалом - на первых этапах культивирования клетки имели более четкую структуру, однородную цитоплазму, ровные края и отростки, размеры клеток были несколько меньше клеток в контрольных образцах. На последних этапах культивирования различия в морфологической картине не визуализировались (16 сутки).
Для выявления клеток на исследуемом материале была выполнена окраска красителем Гимза на 26 сутки культивирования. После окраски на участках истончения материала достаточно четко визуализировались ядра клеток (рисунки 3.24 и 3.25). Рисунок 3.24 Клетки на материале «Гиаматрикс». Опыт. Краситель Гимза. об-в 5х, ок 10х
Также была произведена окраска клеток ядерным красителем DAPI на 21 и 26 сутки культивирования (DAPI - высокоспецифичный краситель ДНК, проявляет свою флуоресцентную активность только при прикреплении к группе оснований А-Т (аденин-тимин). В результате окрашивания в местах истончения биоматериала на его поверхности четко визуализировались ядра клеток (рисунки 3.26 и 3.27).
Таким образом, применение красителя Гимза с высокой концентрацией красителя в ядрах позволило визуализировать клетки на исследуемом материале. Окраска с помощью DAPI также показала наличие ядер клеток на материале. Максимально большие скопления клеток были выявлены на периферии материала, в центре отмечено менее плотное и более упорядоченное расположение клеток (по ориентации ядер).
Результаты изучения иммунофенотипа мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток На 19 и 26 сутки культивирования проводили оценку экспрессии поверхностных антигенов (CD90,44,45, HLA-A ВС, HLA-DR, 73,34, 105,14), характерных для мультипотентных мезенхимальных клеток в контрольной группе и всех сериях с материалами. Установлено, что исследуемые клетки в начале и по окончании эксперимента экспрессировали следующие антигены: CD90, CD44, HLA-ABC, CD73, CD105, наличие которых представляет собой характерный признак стромальных клеток (рисунки 3.28-3.31).
Результаты иммунофенотипического исследования свидетельствовали о стабильной принадлежности исследуемых клеток к группе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, что подтверждало отсутствие признаков гемопоэтической трансформации и изменений линейного происхождения.
Полученные данные подтвердили, что разработанный биоматериал не оказывает негативного влияния на мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки при совместном культивировании, не изменяет характеристики клеточной адгезии, не снижает темпов клеточного роста на материале, при этом положительно влияет на скорость пролиферации и морфологию клеток. на культуре дермальных фибробластов включало определение острой цитотоксичности, а также пролиферативной активности клеток и их адгезивной способности в присутствии материала «Гиаматрикс».
Дермальные фибробласты имели вытянутую или веретеновидную форму (при высокой плотности монослоя), 2-4 длинных отростка, равномерную цитоплазму. Границы клеток были четкие, ядра овальной формы, хорошо визуализировались, расположены, как правило, несколько эксцентрично, содержали 1 -2 ядрышка.
Через 2 ч после внесения клеток в культуральную посуду большая часть из них адгезировалась к пластику и распластывалась по нему. Через сутки клетки формировали неплотный равномерный монослой (рисунок 4.1). В процессе культивирования количество клеток возрастало, клетки соединялись между собой с помощью отростков. Плотность монослоя равномерно увеличивалась, на третьи сутки на дне культуральной посуды монослой приобретал характерный рисунок в виде «завитков» (рисунок 4.2). По мере увеличения плотности монослоя фибробласты располагались более плотно друг к другу и становились менее распластанными. К 7 суткам культивирования достигали 80%-ной конфлюентности и переходили в стационарную фазу (рисунок 4.3). Способность к клонообразованию у клеток данной культуры отсутствовала.
Характеристика ожоговой раны у животных на 1 сутки в условиях применения стандартной местной терапии
К 14 суткам животные проявляли обычную физиологическую активность. Потребление корма и жидкости в целом соответствовало среднесуточной потребности. Груминг по-прежнему представлен единичными элементами. У некоторых из животных замечены попытки доставання краев раны лапами. Вес крыс снижен относительно начала эксперимента. При осмотре шерсть оставалась тусклой с грязно-желтым оттенком.
Ожоговая рана покрыта струпом темно-вишневого или бурого цвета. При пальпации струп определялся как мягкий, сразу же из-под него выделялся мутноватый серозный экссудат. У 9 крыс отмечали фрагментацию струпа с его отхождением. В этих местах открывшееся осмотру дно раны было представлено грануляциями и небольшим объемом экссудата. Дополнительное наблюдение за этими животными позволило установить формирование струпа de novo, что в целом придавало ему неоднородность по толщине. Площадь раны больше, чем у опытных животных и составляет 6,54±0,05 (р 0,01) (рисунок 5.2).
Микроскопическое исследование экспериментального материала, полученного от крыс с ожогами на фоне стандартной медикаментозной (местной) терапии позволило выявить признаки продолжающегося воспаления (рисунок 5.5). Со стороны гиподермы венозное полнокровие не разрешилось, сохранялся ее отек. Очаги некротизированной ткани, которые преимущественно диффузно инфильтрированы макрофагами и умеренным количеством полиморфноядерных лейкоцитов, перемежаются с очагами грануляционной ткани. Просвет некоторых из вновь образованных сосудов грануляционной ткани расширен. Изучение качественного цитологического состава грануляционной ткани показало, что основными клетками были преимущественно фибробласты, умеренное число макрофагов, единичные лимфоциты. Периваскулярно были локализованы единичные тучные клетки.
Эпителизация раневого дефекта происходила с краев, где отмечены единичные митозы. Ни в одном случае не было отмечено процессов регенерации кожи за счет ее дериватов.
Общее состояние животных к 30-м суткам можно было охарактеризовать как активное. Потребление корма выше среднесуточного. Крысы при опустошении кормушки периодически активно осуществляли его поиск. Потребление воды в пределах стандартного среднесуточного объема. Дефицит веса сохранялся. Элементы груминга прослеживались. Некоторых животных особо беспокоила раневая поверхность. Отмечены признаки экскориаций у 5 животных.
При осмотре шерсть сохраняет несколько тусклый вид. Область экспериментальной раны значительно уменьшена по сравнению с предыдущими днями, однако превышает значения площади опытной группы (5,08±0,11; р 0,01) (рисунок 5.2). На поверхности раны небольшие участки струпа чередуются с зонами его отсутствия. На тех участках, где он сохраняется, цвет струпа темно-коричневый, струп сухой, ригидный. При пальпации отделяемого из раны нет. Гиперемия вокруг раны застойная, небольшая в виде узкого ободка. Отек прилежащих тканей отсутствует (рисунок 5.6).
При гистологическом исследовании экспериментальных образцов отмечено, что непосредственно под сохранившимся струпом ожоговый дефект выполнен гиповаскуляризованной соединительной тканью, в которой межклеточное вещество преобладает и представлено утолщенными коллагеновыми волокнами. Наряду с имеющимися в ней фибробластами, отмечены скопления небольшого числа макрофагов и лимфоцитов.
Процесс краевой эпителизации под струпом на данном сроке продолжается. Ближе к периферии регенерирующей ожоговой раны эпидермис многорядный, неравномерный по толщине, располагается на поверхности зрелой грануляционной ткани, последняя - с признаками фиброзной трансформации и многочисленными тяжами, деформирующими эпидермальные слои (рисунок 5.7). Эпидермис состоял из 7-8 рядов клеток, толщина его была неравномерной, отмечалась очаговая гиперпролиферация. В шиповатом слое встречались вакуолизированные кератиноциты с пикнотичными ядрами (рисунок 5.8).
В гиподерме признаки незначительного отека сохранялись. Крыса №15 Зона термического поражения, 30 сутки эксперимента. Группа сравнения. Вновь образованный эпидермис, многорядный, равномерный по толщине. Лечение ожоговой раны мазевыми препаратами. Окраска гематоксилином и эозином, об. 10х, ок. 10х Зона термического поражения, 30 сутки эксперимента. Группа сравнения. Лечение ожоговой раны мазевыми препаратами. Вновь образованный эпидермис. Окраска гематоксилином и эозином, об. 40х, ок. 10х
К 45 суткам эксперимента животные вели себя активно, потребляли корм в несколько больших количествах по сравнению со среднесуточными нормативами. Потребление воды в среднесуточном объеме. Элементы груминга прослеживаются. Дефицит веса к этому сроку у 80% животных компенсирован. Шерсть опрятная, но тусклая.
При осмотре межлопаточной области отмечено, что струп отсутствовал у всех крыс этой группы, что свидетельствовало о завершении процессов краевой эпителизации раны (рисунок 5.9).
На этом сроке экспериментальная рана имела несколько цианотичную окраску и была представлена рубцом полигональной формы, выступающим над поверхностью здоровой кожи, размером 2,76±0,09 (р 0,01) (рисунок 5.2). Шерсть в проекции рубца отсутствовала.