Введение к работе
Актуальность проблеми. Одна из центральных проблем биологии развития заключается в том, чтобы понять, как на уровне данного эмбрионального зачатка возникает информация о взаимном расположении и размерах различно дифференцированных областей, на которые он подразделяется в ходе развития - позиционная информация по терминологии Вольперта (woipert, i96i,i989), В частности, в случае вычленения нейроэктодермы из эктодермального зародышевого листка в раннем эмбриогенезе позвоночных важно выяснить, каким образом в этом зародышевом листке возникает информация о положении границы, определящей размеры нейроэктодермального компартмента.
Согласно современным данным у амфибий такая информация появляется на уровне эктодермального пласта (как целого) не ранее
СТаДИИ ГаСТРУЛЯЦИИ (Albers, 1987; Saxen, 1989). В СВЯЗИ С ЭТИМ
широко обсуждаются два предполагаемых способа ее возникновения: і) в результате передачи в явном виде от подстилащего эктодерму нейрального индуктора - осевой мезодермы; 2) путем пространственной ' самоорганизации в эктодермальном пласте
(Slack,1983; Nieuwkoop, Albers,1990; Sharpe, Gordon,1Э90; Sive et al.,1990).
Очевидно, что информация, "поступающая" в зачаток в явном виде от осевой мезодермы, должна была бы" представлять собой заранее упорядоченный в пространстве набор значений некоторого параметра(ов) - как бы прообраз будущей организации зачатка. Напротив, при самоорганизации первоначально отсутствует какая-либо пространственная упорядоченность, способная служить прообразом будущей структуры. Согласно общей теории самоорганизующихся систем - синергетике (Хакен, 198о) - такая упорядоченнссті возникает в самой системе на основе действующих в ней механизмов, необходимым условием которых являются дальне-дистантныз
ВЗаИМОДеЙСТВИЯ И ЛОКаЛЬНЫЙ аВТОКатаЛИЗ (Turing, 1952; Николае, Пригожий, 1979; Белинцев, 1983).
В настоящее время все еще отсутствуют данные, позволяющие сделать окончательный выбор в пользу одного из указанных способов детерминации размеров нейрального зачатка, несмотря на то, "что в рамках синергетики уже разработаны достаточно четкие критерии, дающие возможность экспериментально выявлять наличие самоорганизационных эффектов в различных системах.
В случае обнаружения подобных эффектов в эктодермальном
зародышевом листке , было бы также важно определить тип дальнодействущей связи, обеспечивающей данную самоорганизацию. В настоящее время считается, что в развивающихся зачатках такая связь вероятнее всего могла бы осуществляться либо посредством механических натяжений, создащихся сократительными системами клеток, либо с помощью диффузии локально синтезирующихся веществ -
МОрфОГеНОВ (Turing,1952; ; Harris et
al.,1984; Belintsev et al.,1987). Эксперименты, ГОЗВ0ЛЯПЦИЄ
решить вопрос о реальности самоорганизации на базе механических натяжений при детерминации размеров зачатка ЦНС, могли бы быть поставлены на основе предсказаний, полученных' в результате теоретического моделирования такой самоорганизации.
Пели. И задачи работы. Основной целью работы было экспериментальное выявление саыоорганизационшх эффектов в экгодермальном пласте при детерминации размеров зачатка ЦНС у зародышей шпорцевой лягушки (xenopus %iaevis). В случае обнаружения таких эффектов планировалось выяснить, являются ли они проявлением самоорганизации, протекающей на основе механических натяжений, или же какого-то иного типа дальнодействия.
В связи с этим ставились следующие задачи:
1) клонировать матрицу нуклеотидного зонда и подобрать
моноклональные антитела для выявления эпидермальных маркеров
зародышевой эктодермы: продуктов экспрессии (белка и РНК)
кератинового гена хкві (кератин типа I);
2) отработать методику гибридизации in situ , пригодную для
работы с серийными срезами ранних зародышей амфибий;
3) изучить .динамику- установления границы, разделяющей в
эктодерме область экспрессии кератинового гена XK8I (презумптивный
эпидермис) и область, где данный ген не эксцрессируется
(презумптивная нейроэктодерма), в период нейруляции;
-
выяснить, демонстрирует ли подразделяющийся на нейроэктодерму и эпидермис эктодермальный пласт один из достаточных признаков самоорганизации: масштабную регуляцию (зависимость размеров образующихся комлартментов от общих размеров пласта);
-
Разработать теоретическую модель самоорганизации, эпителиального пласта на основе дальнодействунцих механических натяжений, порождаемых локальной механо-химической активностью
клеток. С помощью модели проанализировать особенности протекания такой самоорганизации в условиях растяжения или сжатия пласта внешней силой.
6) разработать методики, позволяющие на длительный период
времени (>10 час.) уменьшать или увеличивать тангенциальные
механические НатЯжеНИЯ В ЭКТОДерме ЗарОДШПеЙ X. laeris in vivo;
7) экспериментально исследовать зависимость окончательного
размера зачатка ЦНС от степени тангенциального растяжения
эктодермального пласта в период гаструляции и нейруляции.
Научная новизна И практическая значимость работы.. В результате изучения экспрессии кератинового гена XK8I показано, что в нормальном эмбриогенезе детерминация размеров эпидермального (экспрессирущего данный ген) и нейрального (не экспрессирувдего его) компартментов осуществляется в результате постепенного "дрейфа" границы, разделяющей эти компартменты, к месту своей окончательной локализации. При этом в ходе нейруляции происходит постепенное увеличение компартмента, экспрессирущего кератиновый ген и, соответственно, уменьшение компартмента, в котором экспрессия данного гена не наблюдается.
Впервые показано, что детерминация количества эктодермального материала, образующего зачаток ШС, а также количественная детерминация зачатков хорды и сомитной мезодермы являются результатом самоорганизационных процессов, протекающих в эктодермальном и мезодермальном зародышевых листках в период гаструляции и нейруляции.
Получены данные, опровергающие гипотезу об участии механических натяжений в обеспечении самоорганизационного дальнодействия при детерминации размеров зачатка ЦНС.
Практическая значимость работы определяется : а) возможностью использовать разработанный комплекс методик гибридизации in situ и иммуногистохимии для изучения пространственно-временных закономерностей экспрессии генов в раннем эмбриогенезе. б) возможностью применения разработанного экспериментального подхода (исследование масштабной регуляции, выявление зависимости дмфференцировки от механических натяжений) . для изучения самоорганизации в других развивающихся системах.
Апробзпия работа. Материалы диссертации представлены, на X Международном конгрессе Международного общества биологов развития
(Лос-Анжелос, США, 1985), Всесоюзном рабочем совещании по немышечной подвижности (Чернигов, 1988), Симпозиуме им.. М. Зингера по развитию, регенерации и нейроанатомии (Итака, США, 1990), Европейском конгрессе по биологии развития (Иерусалим, Израиль, 1991), Советско-финском симпозиуме по биологии развития (Суздаль, 1991).
Пугідтпсятпта. ш теме диссертации опубликовано 15 работ..
Материалы и методы Яяротгшш. для гибридизации in situ использовали зародышей альбиносной линии лягушек, чтобы избежать трудностей, связанных с выявлением радиоавтографического сигнала. Для иммуногистохимии использовали пигментированных зародышей х. laev-is. Для морфометрических опытов в каждом опыте получали икру только от одной пары лягушек. В этих случаях зародышей для экспериментов и для контролей готовили заранее, отбирая под стереомикроскопом икринки одинакового диаметра. Данная процедура является необходимым условием для работ по морфометрии, так как у х. laevis размер икринок даже в одной и той же кладке сильно варьирует. Стадии развития определяли по таблицам Ньюкупа и Фабера
(Nieuwkoop, Faber, 1956).
Микрооперации. Микрооперации на зародышах проводили в стерильном растворе Нью-Твитти с антибиотиками. Такой же раствор использовали для инкубации оперированных и контрольных зародышей. Эксплантацию и рассечения тканей осуществляли с помощью микроножа и стеклянной палочки. Инекшш вазелинового масла в бластоцель проводили с помощью микроинектора через стеклянную микрошшетку с диаметром кончика 10-15 мкм.
Витальное мечений заттотэтпей. Витальное мечение зародышей проводили по методике Келлера (кєііег, 1976), вводя в микроразрезы тканей на 4-5 мин. кусочки'агара, окрашенного нейтральным красным.
Гистологические cpeSiL. Для морфометрии обемов осевых структур зародышей фиксировали жидкостью Буэна, проводили через бутанольную проводку и заключали в парафин. Серийные срезы (14 мкм) окрашивали гематоксилином Зрлиха. Для морфометрии" клеток в эктодерме зародышей фиксировали и заключали в Эпон 812 по стандартной методике для электронной микроскопии (Гайер, 1974). Полутонкие эпоновые срезы (1.5 мкм) окрашивали толуидиновым синим.
Молекулярное клонирование. При клонировании фрагмента кератиювого гена XK8I использовали метод амплификации ДНК с
ПОМОЩЬЮ ТермОСТабИЛЬНОЙ ДНК-ПОЛИМерЗЗЫ (Carman, Kidd, 1989), а Также Набор стандартных ГеННО-ИНЖеНерНЫХ МеТОДИК (Maniatis et al., 1982).
Гибритзаїтя in situ.* При оптимизации гибридизации in situ для работы с серийными срезами ранних зародышей шпорцевой лягушки использовали элементы различных описанных в литературе вариантов этого метода , а также следующие изотопы для меченая зонда: Зн, 1 i,32p, 33р,. 35s. Для отработки метода, кроме кератинового, использовали также зонды к РНК генов с-тус и р-53 человека, с-субединицы гга*,к*-лФазы свиньи. Авторадиографию препаратов
ПРОВОДИЛИ С ПОМОЩЬЮ ЭМУЛЬСИИ NTB2 ("Kodak"). ПОСЛЄ ПР0ЯВЛЄНИЯ
эмульсии препараты окрашивали dapi (і мкг/мл) для визуализации клеточных ядер.
иммуногистотимия . Зародышей фиксировали в охлажденном до -70 этаноле в течение 3-х суток и заключали в парафин через бутанольную проводку. Иммунофлуоресцентное окрашивание 14 мкм срезов проводили по следующей методике (Гельштейн и др.,1985). Стекла с депарафинизированными срезами инкубировали в течение I часа с цельной культуральной средой из-под клеток гибридных клонов продуцирупцих моноклональные антитела против цитокератинов. В качестве вторичных антител использовали коньюгированные с
фЛуореСЦеИН-ИЗОТИОЦИанаТОМ аНТИТела ПРОТИВ МЫШИНЫХ IgG ("Sigma").
Так же, как и при гибридизации in situ препараты окрашивали dapi.
Иеяение КЛЕШЕ, наружного слоя эктодермы. Для прослеживания судьбы клеток наружного слоя эктодермы у зародышей на стадии 10 1/4 проводили мечение поверхности клеток, обращенной во внешнюю среду, путем включения Н в состав поверхностных сизловых кислот го следующей методике (Габриэлян и др., 1990): окисление сиаловых кислот 4 тШаю-4 (1о мин. в темноте), отмывка, восстановление
СИаЛОВЫХ КИСЛОТ NaB3H4 (0,5 иСі/ml; ЗО МИН.).
Морйометрия. Морфометрические измерения, а также их статистическую обработку проводили с помощью автоматического анализатора изображений