Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. 11
1. Физико-химические и общебиологические характеристики декстранов, применение в биотехнологии 11
1.1. Общее описание. 11
1.2. Применение декстранов в биотехнологиях. 11
1.3. Биологические эффекты декстранов . 14
2. Эндосомально-лизосомальный компартмент 15
2.1. Эндосомы и лизосомы. 15
2.2. Регуляторы лизосомального биогенеза. 17
2.3. Механизмы активации белков TFEB и TFE3 18
2.4. Эффекты активации TFEB. 19
2.5. Лизосомы как сигнальные платформы. 20
2.6. Лизосомальная сигнальная трансдукция, ассоциированая с иммунными реакциями 22
3. Аутофагия . 23
3.1. Общее описание. 23
3.2. Аутофагия участвует в иммунном ответе на внутриклеточные патогены. 26
3.3. Аутофагия участвует в регуляции иммунных процессов . 27
3.4. Аутофагия и поляризация макрофагов. 28
4. Регуляторные функции внутриклеточных редокс-процессов. 29
4.1. Активные формы кислорода. 29
4.2. АФК как вторичные мессенджеры. 30
4.3. Редокс-контроль сигнальной трансдукции. 32
4.4. Редокс-контроль аутофагии 32
4.5. Регуляция продукции и концентрации АФК. 33
4.6. Сигнальная система Keap1/Nrf2/ARE. 33
4.7. Регуляция активности Nrf2. 34
4.8. Контроль метаболических процессов транскрипционным фактором Nrf2. 36
5. Болезни накопления 38
Глава 2. Материалы и методы 42
Глава 3. Результаты и обсуждение 52
1. Исследование кинетики эндоцитоза декстранов клетками различного гистогенеза 52
2. Влияние декстранов на состояние лизосомального аппарата в ранние сроки после нагрузки декстраном
3. Влияние декстранов с молекулярной массой 40 и 70 кДа на аутофагию в клетках J774 61
4. Исследование генерации АФК 65
4.1. Исследование генерации АФК при нагрузке лизосомального аппарата клеток декстранами 65
4.3. Влияние декстранов на индуцированное хлоридом аммония перекисное окисление липидов 70
5. Исследование влияния декстрана на индукцию сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE . 72
5.1. Результаты исследования транслокации Nrf2 в клеточное ядро. 72
5.2. Результаты исследования внутриклеточного содержания и распределения белка Keap1 в клетках J774 72
5.3. Результаты исследования экспрессии генов, контролируемых Nrf2
6. Влияние декстранов на стимулированную бактериальным липополисахаридом продукцию цитокинов макрофагами in vitro и in vivo. 79
7. Исследование регуляторной связи сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE и транскрипционных регуляторов лизосомального биогенеза .
7.1. Поиск регуляторных последовательностей ARE в генах мастер-регуляторов лизосомального биогенеза TFEB и TFE3. 83
7.2. Экспериментальная проверка возможности регуляции лизосомального биогенеза со стороны сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE 87
7.3. Исследование влияния индукторов Keap1/Nrf2/ARE на аутофагию 89
Заключение 93
Выводы 97
Список литературы. 99
- Биологические эффекты декстранов
- Аутофагия участвует в регуляции иммунных процессов
- Влияние декстранов на состояние лизосомального аппарата в ранние сроки после нагрузки декстраном
- Результаты исследования экспрессии генов, контролируемых Nrf2
Биологические эффекты декстранов
Декстраны используют как матрицы для конъюгации лекарственных соединений и белков. Наиболее эффективной формой для конъюгации является окисленный декстран. В настоящее время также предложены формы наноразмерных декстрановых гидрогелей, которые эффективно эндоцитируются и далее распадаются на отдельные фрагменты, несущие активное вещество [295]. Использование окисленных декстранов обусловлено тем, что они легко вступают в реакции с образованием иминов, что позволяет конъюгировать их с лекарственными соединениями и белками. Среди последних – конъюгаты декстранов с гемоглобином, калликреином, брадикинином [27]. Эти соединения оказывались неустойчивыми без дополнительной стабилизации, в то время, как конъюгат с трипсином такой стабилизации не требует [150]. Было показано, что конъюгаты декстрана с гормоном роста вызывают пролонгированную экспрессию ИФР-1, увеличивая так же уровень этого гормона в крови [27].
Взаимодействие белков с декстраном происходит случайным образом, и у части полученных конъюгатов оказываются закрыты активные сайты ферментов. Так конъюгат альдегиддекстрана с пенициллин G ацилазой снижал каталитическую активность фермента, в то же время, увеличивая его температурную устойчивость [142].
В статье [85] декстран небольшой молекулярной массы использовали для стабилизации белков, подвергшихся протеолитической деградации, которые затем идентифицировали при помощи SDS-PAGE. Такой комплекс в ходе электрофореза характеризовался бэндом, соответствующим молекулярной массе нативного белка. Использование декстрана в качестве стабилизатора белков для проведения SDS-PAGE требует дополнительного восстановления конъюгатов боргидратом натрия, поскольку их нагревание в растворе с SDS приводит к деградации комплекса.
Окисленные декстраны токсичны [211]. Токсичность альдегидных групп декстрана проявляется, начиная с концентрации 3 мкмоль/мл (т.е. 0,375 мкмоль/мл декстрана, содержащего 2% окисленных звеньев). Такая концентрация является IC50 по отношению к клеткам линии RAW 264.7 (мышиные макрофаги). В то же время, модификация альдегидных групп этаноламином полностью снижала его токсичность [272].
Гидрогели на основе модифицированных декстранов являются перспективными формами для использования в качестве раневых покрытий в силу низкой токсичности, биодеградируемости, возможности внесения в их состав биологически активных молекул (например, эпидермального фактора роста) или антибактериальных или противогрибковых лекарственных соединений. Так, группой исследователей из университета Джонса Хопкинса был разработан гидрогель на основе декстрана, модифицированного аллил-изоцианат-этиленамином, который был использован в качестве раневого покрытия в экспериментальных ожогах кожи мышей 3 степени. Через 5 недель после начала лечения, происходило полное восстановление морфологии и толщины эпидермиса, восстановление волосяного покрова на месте ожога. В настоящий момент проводятся доклинические исследования данного гидрогеля в качестве противоожогового средства.
Одной из удобных модификаций декстранов является их окисление, с образованием альдегидных групп в положениях 2- и 3- остатков глюкозы. Данная модификация удобна тем, что позволяет создавать конъюгаты декстранов с биологически активными веществами, например, с гормоном роста, фактором роста сосудистого эндотелия и др., которые под действием различных биологических факторов медленно диссоциируют, обеспечивая таким образом пролонгированное высвобождение биологически активных молекул[27, 142, 174].
Гидрогели на основе окисленного декстрана биодеградируемы, и скорость диссоциации зависит от количества окисленных звеньев декстрана, а также количества кросслинкера [173]. В качестве последнего могут быть использованы желатин, альбумин, хитозан и т.д.. Гидрогель, полученный из желатина и окисленного декстрана, с инкорпорированным эпидермальным фактором роста демонстрировал пролонгированную кинетику высвобождения последнего, поддерживая концентрацию фактора роста в ткани постоянной в течение 7 дней [72].
Различные гидрогели на основе окисленных декстранов демонстрируют хорошие адгезивные свойства [22, 126, 259], что наряду с их низкой цитотоксичностью, делает их удобными материалами для разработки биологических покрытий, в частности покрытий ожогов для предотвращения испарения жидкости с поверхности раны.
Одной из форм гелей на основе декстрана являются наногели, на создании которых сегодня сосредоточены многие группы исследователей. Такие наночастицы приобретают свойства «невидимости» благодаря гидрофильности декстранового покрытия, что позволяет им избегать опсонизации компонентами комплемента и фагоцитоза мононуклеарами [46]. Такие наногели могут быть применены для направленной доставки в опухолевые клетки химиотерапевтических препаратов [237].
Широкое распространение получили покрытые декстрановым гелем наночастицы оксида железа. Декстран позволяет, с одной стороны, снизить агрегацию наночастиц, с другой стороны введение в декстран модификаций позволяет присоединять к наночастицам различные химические соединения [265].
В статье [24] описываются бактериостатические свойства диальдегиддекстрана. Показано, что бактерицидный эффект АД более выражен по отношению к Грам-позитивным штаммам, что вероятно связано с более тонкой клеточной стенкой. Важное замечание, сделанное в статье, относится к использованию совместно с АД флуоресцентных проб, содержащих аминогруппы. Propidium Iodide, 1-N-Phenylnaphtylamine (NPN) и Nile Red взаимодействовали с АД, что затрудняло анализ целостности плазматической мембраны. В данном исследовании АД так же ингибировал подвижность и хемотаксис E.Coli. Кинетика связывания и высвобождения АД с аминогруппами белков по-видимому зависит от количества остатков лизина в этих белках, доступных для реагирования с альдегидными группами АД. Так, BSA в котором эписилон-аминогруппы лизиновых остатков были ацетилированы, высвобождался из декстран-желатинового гидрогеля на 15-20% эффективнее, чем немодифицированный BSA [72]. Кристиан Де Дюв, исследуя лизосомотропные соединения, утверждал, что несмотря на химическую инертность декстранов, их накопление в лизосомах не может проходить бесследно в силу медленной деградации, и, следовательно, повышенной функциональной нагрузки на этот клеточный компартмент [76]. Действительно, наблюдаемая с помощью электронного микроскопа картина напоминает таковую при лизосомальных болезнях накопления, и сопровождается накоплением электронно плотного материала в лизосомах, а так же вакуолизацей клеток [230]. В то же время, накопление декстрана в лизосомах не сопровождается нарушением активности лизосомальных ферментов, что наблюдается, например, при накоплении клетками полимеров, приобретающих заряд в кислых условиях [140]. Лизосомотропные свойства декстрана, а также то, что он не вызывает повреждения лизосом и гибели клеток позволили использовать его в качестве матрицы для доставки индикаторов pH в лизосомы [210].
За более чем полувековой период использования декстранов, накопилось много данных об их биологических эффектах, некоторые из которых приведены ниже. Декстран влияет на механические свойства и лизируемость фибрина. Фибриноген, полимеризующийся в присутствии декстрана снижает адгезию тромбоцитов к нему, равно как и высвобождение серотонина [293]. Декстран массой 40кДа снижает спонтанную и агонист-индуцированную агрегацию тромбоцитов, а также поверхностную экспрессию маркеров активации тромбоцитов [231].
Аутофагия участвует в регуляции иммунных процессов
По всей видимости, к накоплению аутофагосом приводит нарушение их слияния с лизосомами в результате дисфункции последних, которая в свою очередь является следствием накопления недеградируемого материала [196] [166]. При этом отмечается накопление в клетках потенциально токсичных убиквитинированных белков (вероятно, белковых агрегатов), которые в норме устраняются аутофагией. Такие белки обнаруживаются как самостоятельно, так и в составе аутофагосом, что указывает на отсутствие рециркуляции аутофагии [260].
Избыточное аккумулирование аутофагосом приводит к тому, что заместительная терапия рекомбинантным ферментом альфа-глюкозидазой оказывается неэффективной, т.к. фермент накапливается в эндосомах и амфисомах (результат слияния аутофагосом с эндосомами), где его активность далека от максимальной (которая достигается в лизосомах, при кислых значениях pH) [166].
Искусственное увеличение экспрессии белка TFEB приводит к существенному снижению количества аутофагосом в этих клетках, что является следствием их слияния с лизосомами [274]. Слияние лизосом и аутофагосом необходимо для экзоцитоза содержимого лизосом, что было показано в модели болезни Помпе, которая характеризуется накоплением гликогена преимущественно в миоцитах скелетной мускулатуры и кардиомиоцитов [78].
В классическом представлении, в основе патогенеза болезни Помпе лежит лизосомальная дисфункция, которая приводит к нарушению слияния лизосом и аутофагосом, и накоплению большого количества аутофагосом. Однако работы коллектива авторов [87] показали, что накопление аутофагосом, содержащих миозин, является первичным процессом, связанным с индукцией экспрессии генов Beclin1, Atg12, GABARAP и LC3. Авторы предположили, что невозможность гидролиза гликогена до глюкозы приводит к локальному голоданию и активации аутофагии [86].
Еще одной особенностью болезни Помпе, как и многих других болезней накопления, является повреждение клеточных мембран в результате ПОЛ [37, 115, 288]. В частности, липиды лизосомальной мембраны подвержены перекисному окислению при аккумулировании наночастиц различной природы, что преимущественно связано с накоплением свободного двухвалентного железа в просвете лизосом, являющегося сильным триггером ПОЛ [35, 287]. Результатом, в частности, является повреждение лизосомальной мембраны, ведущее к лизосомальной дисфункции. В конечном итоге это приводит к нарушению энергетического метаболизма митохондрий и увеличению генерации ими АФК, что в условиях интактного клеточного гомеостаза тщательно регулируется клеткой – в частности, с помощью селективной аутофагии, устраняющей поврежденные митохондрии. Однако, поскольку эффективная аутофагосомная деградация происходит только при наличии интактных лизосом, такой механизм также страдает при лизосомальной дисфункции [108].
Сигнальная система Keap1/Nrf2/ARE, участвующая в регуляции сигнальной трансдукции, опосредуемой АФК, необходима для выживания клеток, подверженных различным стрессирующим воздействиям [16, 106]. То же относится и к аутофагии [206, 271]. Обе системы участвуют в регуляции продукции АФК, и, таким образом, защищают клетки от окислительного повреждения.
В этой связи интересно, что в клетках млекопитающих существуют эволюционно консервативные сигнальные взаимодействия, связывающие в единую регуляторную сеть функционирование лизосомального аппарата, аутофагию и АФК, играющие роль важных сигнальных медиаторов [69]. С этой точки зрения, увеличение генерации АФК в клетках не всегда означает развитие окислительного стресса, и может отражать активацию ассоциированной с АФК сигнальной трансдукции, в частности участвующей в активации механизмов выживания клеток при повреждении [69].
Активация этих систем по отдельности описана для различных лизосомотропных воздействий, к каковым относятся и лизосомальных болезней накопления. Очевидно, что выполняя защитную функцию на ранних этапах развития этих заболеваний, интенсификация данных внутриклеточных процессов обречена стать неэффективной в связи с наличием генетических дефектов тех или иных ферментов. С другой стороны, активация этих механизмов в условиях обратимого состояния лизосомального накопления (в частности, при нагрузке клеток декстранами) может иметь терапевтическое значение как в целях снижения токсичности терапевтических препаратов, так и для возможных самостоятельных эффектов, в частности иммуномодулирующего, поскольку указанные выше сигнальные и эффекторные системы участвуют также в регуляции неспецифических иммунных реакций.
Гипотеза данного исследования состоит в том, что накопление декстрана в лизосомах сопровождается последовательностью событий, аналогичной накоплению гликогена на ранних этапах гликогеноза типа II. При этом затрудняется гидролиз крупномолекулярных соединений до низкомолекулярных, необходимых для обеспечения анаболизма клеток – состояние, аналогичное голоданию. Дефицит нутриентов сопровождается повышенной продукцией АФК вследствие дефицита одноэлектронных переносчиков (NADPH и NADH), что приводит к повышенному образованию супероксид-аниона в митохондриях клеток вследствие разобщения цепи переноса электронов. Оба обстоятельства характеризуются активацией соответствующей сигнальной трансдукции, приводящей к стимуляции экспрессии генов лизосомального биогенеза и стресс-индуцируемых генов, в первую очередь опосредованной транскрипционными факторами Nrf2 и NF-B. Исходя из ранних исследований, основной предполагаемой мишенью накопления декстранов в организме человека и мыши являются клетки моноцитарно-макрофагального ряда, и предполагаемые внутриклеточные события могут сопровождаться стимуляцией продукции цитокинов первого типа и снижением генерации противовоспалительных цитокинов.
В ранее проведенных исследованиях обнаружено, что основные эффекты декстранов (например, стимуляция продукции лизосомальных гидролаз и фагоцитоза) при добавлении к культурам клеток in vitro развиваются спустя несколько суток после их воздействия в различных режимах [1]. В то же время, накопление декстранов в лизосомах происходит в течение 12 часов после начала экспозиции с клетками, а в первые 24 часа в макрофагах мышей отмечается выраженная продукция АФК [7]. Таким образом, индукция внутриклеточного ответа на накопление декстранов начинается уже в ранние сроки после начала инкубирования с макрофагами [7], в связи с чем, исследование данной диссертационной работы посвящено поиску событий, происходящих в первые сутки после нагрузки макрофагов декстранами.
Влияние декстранов на состояние лизосомального аппарата в ранние сроки после нагрузки декстраном
Декстран с молекулярной массой 40 кДа в концентрации 2 мг/мл при четырехчасовой экспозиции не вызывает достоверно значимого увеличение количества LC3-позитивных клеток (Рис. 3.7). При этом соотношение количества клеток в экспериментах с блоком и без блока лизосомального слияния не изменяется по сравнению с контролем. Экспозиция в течение 24 часов несколько изменяет картину: происходит некоторое уменьшение доли позитивных клеток в группе без обработки хлорохином, что свидетельствует об активации лизосомальной компоненты аутофагии.
Увеличение концентрации декстрана с молекулярной массой 40 кДа до 20 мг/мл в первые 4 часа приводит к некоторому уменьшению доли LC3-позитивных клеток в отсутствие хлорохина и повышению таковой после обработки хлорохином (Рис 3.7). При этом существенно возрастает значение F (в 1,45 раза по отношению к контролю), что указывает на усиление аутофагосомально-лизосомального слияния. В то же время, более продолжительная экспозиция с декстранами сопровождается накоплением аутофагосом в клетках без обработки хлорохином и снижением величины F, что указывает на торможение лизосомального слияния, вероятно, связанное с лизосомальной перегрузкой.
Декстран массой 70 кДа в целом демонстрирует похожий эффект (Рис 3.7). Так, в концентрации 2 мг/мл он практически не влияет на соотношение количества LC3-позитивных клеток без блока и с блоком лизосомального слияния. Увеличение концентрации до 20 мг/мл приводит к увеличению доли LC3-позитивных клеток в группах без обработки хлорохином при незначительном увеличении таковой в группах с использованием хлорохина. Это может свидетельствовать об индуцирующем воздействии декстрана с молекулярной массой 70 кДа на аутофагию.
Через 24 часа картина существенно меняется, и декстран с массой 70 кДа демонстрирует существенное увеличение значения F в обеих использованных концентрациях (в 1,52 и в 1,17 раза по сравнению с 4-часовым инкубированием), что наряду с сохранением уровня индукции аутофагии свидетельствует также и о стимуляции аутофагосомально-лизосомального слияния.
В качестве препарата сравнения была использована сахароза в тех же массовых концентрациях, что и декстран. Согласно литературным данным, сахароза и трегалоза в аналогичном диапазоне концентраций оказывают выраженное влияние на индукцию аутофагии [111, 285, 320]. В то же время для них характерно накопление большого количества вакуолярных структур в цитоплазме, что, вероятно связано с перегрузкой лизосомального аппарата, а следовательно, аутофагия в таких клетках протекает с низкой активностью.
Полученные в настоящем исследовании экспериментальные данные свидетельствуют о том, что сахароза время- и дозозависимо увеличивает процент клеток с индуцированной аутофагией как в группах с добавлением ингибитора лизосомального слияния, так и без него (Рис. 3.9). Это указывает не столько на индукцию аутофагии, сколько на торможение лизосомального слияния.
Поскольку сахароза была использована в тех же массовых концентрациях, что и декстран, и, следовательно, осмолярности использованных растворов близки, можно предположить, что во влиянии на процесс аутофагии преимущественную роль играет молекулярная масса полисахарида. При этом декстран с массой 70 кДа демонстрирует наиболее выраженное индуцирующее влияние, а также стимулирует аутофагосомально-лизосомальное слияние. Это предположение согласуется с полученными данными о различии влияния декстранов различных молекулярных масс на лизосомальный pH (Рис.3.3 и Рис. 3.6), а также о различии влияния сахарозы и декстранов на размеры отдельных лизосом.
Эти результаты интересны также в контексте описанных выше результатов исследования лизосомального pH, увеличение которого наблюдается при нагрузке клеток декстранами с молекулярной массой 70 кДа. Сохранение интенсивности аутофагосомально-лизосомального слияния указывает на то, что, несмотря на перегрузку декстраном, лизосомальный аппарат клеток сохраняет стабильный функциональный статус. Это подтверждается и исследованием среднего значения лизосомального pH в клетках, которое существенно снижается при 24-часовой экспозиции клеток с декстраном, что свидетельствует о стимуляции активности V-АФТазы. Такой эффект ожидаем в рамках сформулированной гипотезы и вероятно, является результатом снижения поступления в клетку низкомолекулярных нутриентов, которое происходит вследствие перегрузки лизосом и способствует увеличению количества субъединиц V-АФТазы в эндосомальных и лизосомальных мембранах [278].
Сохранение функционального статуса лизосом может быть следствием активации транскрипционных факторов TFEB и TFE3, являющихся главными регуляторами биогенеза лизосом и аутофагии в клетках млекопитающих. В то же время остается неизвестным, насколько эффективно протекает гидролиз содержимого аутофагосом. Дополнительным вопросом является природа увеличения интенсивности аутофагии по сравнению с контролем, поскольку декстран локализуется исключительно в изолированном лизосомальном компартменте, и, следовательно, рецепторы, детектирующие попадание чужеродных соединений в цитозоль, не имеют к нему доступа.
В то же время индукция аутофагии при нагрузке декстраном лизосом может объясняться описанным выше эффектом макромолекулярной перегрузки, который сопровождается инактивацией mTORC1 и, как следствие, интенсификацией неспецифической аутофагии. С другой стороны, для mTORC1 характерно сохранение активного статуса при стабильных кислых значениях pH, а декстраны поддерживают, или даже увеличивают кислотность лизосомального компартмента. Другой вероятной причиной может быть активация генерации АФК, которые являются сильными индукторами аутофагии [43, 81, 107, 167].
Результаты исследования экспрессии генов, контролируемых Nrf2
Влияние декстранов на активацию HMOX1 (с учетом вышесказанного) и ассоциированное с этим снижение интенсивности индуцированного ПОЛ указывает на то, что данный защитный механизм действительно ассоциирован с лизосомальным пулом железа. Вероятно, повышенная нагрузка на лизосомы вследствие накопления декстрана сопровождается увеличением активности лизосомальных мембранных систем, в частности, белков, участвующих в катаболизме потенциально опасных соединений.
Возвращаясь к возможной роли ферритина в протективных эффектах декстрана, следует отметить, что белок Bach1, связывающийся с последовательностью ARE независимо от Nrf2, негативно контролирует экспрессию гена ферритина [113], а также иные гены, находящиеся под контролем ARE [13]. Будучи антагонистом Nrf2, в нормальных условиях Bach1 поддерживает антиоксидантную защиту клеток на конститутивном уровне, и активация Nrf2 может вызывать снижение репрессорного воздействия на ген ферритина, таким образом внося существенный вклад в протекторный эффект декстрана.
В ходе данной работы было исследовано содержание про- и противовоспалительных цитокинов в плазме мышей C57Bl6/J через 24 часа после интраперитонеального введения бактериального липополисахарида и LPS в сочетании с декстраном в концентрации 2 мг/мл (3.20). Кроме того, поскольку основным модельным объектом данного исследования являлись макрофаги, аналогичный эксперимент проводили in vitro на культуре перитонеальных макрофагов мышей той же линии (3.21).
Введение LPS приводило к увеличению сывороточной концентрации IL6 и MCP-1, а также сильного провоспалительного цитокина TNF, однако снижался уровень IL10, что характерно для мышей линии C57Bl (Рис. 3.20). Добавление декстрана с молекулярной массой 70 кДа существенно изменило наблюдаемую картину. Так, декстран в сочетании с LPS значительно увеличивал продукцию IL12, уровень которого в присутствии одного лишь LPS не менялся. В то же время падала стимулированная липополисахаридом продукция IL6, MCP-1, а также в еще большей степени снижалась продукция IL10. Несмотря то, что декстран также выраженно влиял на уровень продукции TNF, в целом, LPS вызывал очень низкое повышение продукции этого цитокина, и колебания его концентрации в экспериментальных группах незначительны. Это, в целом согласуется с известной из литературы динамикой продукции этого цитокина, состоящей в выраженном увеличении в течение 2 часов после введения LPS и резким падением в последующем [218].
Для того чтобы проверить, какая часть модуляции цитокинового профиля может быть делегирована макрофагам (Рис. 3.21), нагруженным декстранами, была исследована продукция цитокинов in vitro в культуре изолированных перитонеальных макрофагов. В данном случае, характер ответа цитокинов IL10 и IL12, а также цитокинов, IL6, MCP-1 на LPS был аналогичен таковому в эксперименте in vivo, однако добавление декстрана с молекулярной массой 70 кДа изменяло уровень этих цитокинов в гораздо меньшей степени, чем при исследовании in vivo. Влияние декстранов на уровень продукции TNF макрофагами отсутствовало.
Среди описанных цитокинов IL6 и MCP-1 продуцируются не только макрофагами [65], но и многими другими типами клеток. Декстран с молекулярной массой 70 кДа существенно снижал продукцию этих цитокинов in vivo, но не in vitro, что может указывать на то, что мишенью декстрана являются не только не моноцитарное клеточное звено, но и другие типы клеток, в частности, эпителиальные или тканевые фибробласты. С учетом того, что декстраны способны аккумулироваться в этих клетках, как показано выше (стр. 52), данное предположение придставляется вполне вероятным. По всей видимости, тем же можно объяснить выявленное in vitro отсутствие влияния декстрана на продукцию TNF, главным источником которого в организме являются активированные макрофаги.
С другой стороны, преимущественным источником IL10 также являются макрофаги, и влияние декстрана на продукцию этого цитокина наиболее выражено. Увеличение продукции IL10 в ответ на внесение в культуральную среду LPS – типичная реакция [132], которая в том числе является частью механизма отрицательной обратной связи, участвующего в переключении активной фазы воспалительного ответа на репаративную. Снижение декстраном стимулированной продукции IL10 может отражать как негативное влияние на продукцию этого цитокина макрофагами, так и снижение выраженности ответа на LPS, что закономерно сопровождается и более низкой продукцией IL10.
Еще одной важной особенностью результатов эксперимента in vitro было то, что декстран ни в одном из случаев не оказывал самостоятельного влияния на уровень продукции цитокинов. Это может свидетельствовать в пользу того, что его эффект не зависит от взаимодействия с паттернраспознающими рецепторами, для которого можно было бы ожидать изменение цитокинового профиля. В то же время выраженный эффект, оказываемый декстраном в присутствии LPS, указывает на его существенное влияние на внутриклеточную сигнальную трансдукцию. Выраженный уровень провоспалительных цитокинов, равно как и противовоспалительных, в высокой степени зависит от повреждения тканей, вызванного эффекторным звеном иммунной системы (гранулоциты и цитотоксические лимфоциты). Избыточная активность последней ассоциирована с деструктивными процессами, приводящими к выраженному повреждению тканей и последующему фиброзу. Возможно, наблюдаемый эффект влияния декстрана на LPS-индуцированную продукцию цитокинов, равно как и в случае
с ожоговым повреждением тканей [9], связан не столько с его иммуномодулирующим воздействием, сколько со способностью защищать ткани от выраженного повреждения, в том числе и со стороны факторов иммунной системы, что в свою очередь приводит к быстрому регрессу острой воспалительной реакции и способствует эффективной репарации тканей.
Полученные результаты также свидетельствуют о том, что декстран с молекулярной массой 70 кДа может контролировать адаптивный иммунитет, стимулируя Th1-звено иммунного ответа, одновременно ингибируя Th2, на что указывает снижение LPS-стимулированного уровня продукции IL10 и потенцирование продукции IL12 [2].