Введение к работе
,/ .
'""Актуальность темы. Химерные животные, в которых сосущесгву-эт7~^уЬ|щионируюг и включены в общую регуляторную систему орга-мзма клетки с разнородной генетической информацией, представ-іяют собой модель, удобную для изучения широкого спектра проб-іем экспериментальной эмбриологии (мс Laren, 1976 ).
Повышение жизнеспособности в химерах клеток с метаболическими и генетическиш нарушениями (Surani et al.,I977;^ennet,I978), і также возможность успешного соединения зародышей различных вдов и получения половозрелых межвидовых химер
позволяет надеяться на создание способных к размножению организмов, в которых сохранена генетическая информация іредставителей исчезнувших видов (Веприниев, Р'отт, 1978; IS84). ice эти и многие другие исследования основываются прежде всего \а получении химер.
Основным модельным объектом для изучения приемов и методов создания химерных животных являются, мыши. Использование эмбрио-іов мышей связано с их доступностью и сравнительно высокой сте-іенью изученности, но вместе с тем лимитируется техникой микро-ланипуляшй и некоторой сложностью работы с мелкими животными іри получении и трансплантации эмбрионов (Дыбан, IS74).
Несмотря на то, что методы получения химер в основном разра-ютаны, используемые подходы не позволяют обеспечить оптималь-ше пути их реализации. Видимо, это обусловлено не только слож-юстью экспериментов, но и тем, что первые работы по химерам /.ышей появились сравнительно недавно (Tarkowski,, I96I-, Mintz, .ъ&'г), и наблюдается ещё некоторое несоответствие мевду теоретическими предположениями и их экспериментальными подгвержде-
ШЯМИ .
Исследования отдельных этапов процесса получения химер, та-<их, как микрохирургия, вымывание и трансплантация эмбрионов, :ами по себе представляют значительный теоретический и практи-іеский интерес, т.к. необходимы для внедрения результатов экс-іериментальной эмбриологии в практику животноводства, гинекологии и экспериментальной медицины.
Дели и задачи исследования. Цель исследования заключалась в )азработке комплекса экспериментальных подходов, оптимизирующих условия восстановления генотипа посредством получения и скрещи-іания химерных животных.
Работа выполнена в соответствии с плановой тематикой Инсти-:ута "Длительное сохранение генетической информации, физикохи-шческие основы консервации клеток и клеточных систем/ J* гос-
регистрации is.28.3.г. 1 и по Программе сотрудничества стран-членов СЭВ и СФРЮ по проблеме "Исследования в области биологической физики" на IS84 - Ib»o годы (тема III).
Б соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи: 1) Разработать метод нехирургического (нетравматического) пилучения доимплантаиионных эмбрионов. 2) Разработать метод -получения химерных эмбрионов, позволяющий работать с ограниченным количеством донорского материала. 3) Разработать метод нехирургической (нетравматической) трансплантации эмбрионов, уменьшающий' потери и повреждения при манипуляциях. 4) Разработать устройства для хирургической трансплантации в матку и яйцевод, позволяющие повысить надежность этой операции. 5) Добиться рождения мышат из химерных эмбрионов, полученных различными способами. 6) Получить половозрелых химер и потомство от них, оценив возможность скрещивания химер между собой и особенности фенотипа у потомства.
Научная новизна диссертационной работы состоит в следующем: I. Экспериментально продемонстрирована возможность реализации генетической информации, посредством получения и скрещивания соответствующих химер, при условии отсутствия взрослых особей данного генотипа в исходном материале. 2. Рйзработаны методы и устройства, повышающие надежность микроопераций, вымываний и трансплантаций эмбрионов. Предложенные подходы позволяют работать с ограниченным количеством донорского материала и повышают возможность реализации генетической информации каждого отдельно взятого животного. 3. Показано, что вне зависимости от способа получения химерных- эмбрионов существует корреляция между числом, стадией развития, взаиморасположением донорских клеток относительно репишентных и фено.типом химер, не выявляемая при изолированном рассмотрении каждого из условий. 4. Показано расщепление потомства химер на исходные линии и их гибриды. Обнаружено, что расщепление идет в том же соотношении, в каком соотносятся признаки родительских линий в химерах.
Практическое значение. В результате проведенных исследований предложены и нашли практаческое применение следующие методы и инструменты: І) шіетод нехирургического вымывания эмбрионов, пригодный для получения доимплаятационных эмбрионов у мелких животных.
стеклянных юлкроинструкентов для манипуляций с бластомерами и способ защиты микроинструментов от механических повреждений. 6) Способ получения химер путем инъекции бластоыеров под прозрачную оболочку zona peiiucida 7) Устройства для хирургических трансплантаций эмбрионов в яйцевод и в матку. 8) Нехирургическая трансплантация экбрионов, осуществляемая на основе разработанного комплекса приспособлений. Предложенные методы использу-отся в /шституте биологической физики (ИБФ) АН СССР (Пущино), 'інституте экспериментальной медицины (НЯйЭМ) АМН СССР (Ления-?рад), Институте криобиологии и нриомедииины (Ш1К и К) АН УССР Царьков), Зоологическом институте (3/ІН) АН СССР и институте акушерства и гинекологии (НАГ) АШ СССР (Ленинград), ВНШФБ и 1 с-х животных (Боровск), институте исследования аозвоночннх швотных (Берлин, ГДР), институте молекулярной генетики (ИМГ) ЮАН (Прага, ЧССР).
Апробация работы. Основные положения и результаты диссертации были доложены на Всесоюзном рабочем совещании по консервацій генетических ресурсов, г.Пущино, 1985 г., на II Всесоюзном ювещании по морфогенетически активным веществам "Морфоген-2" '.Пущино, 1988 г., на 24 международном симпозиуме по биомоделям 988 г., ЧССР, и на Всесоюзном рабочем совещании "Создание ге-етических коллекций лабораторных животных", 1989 г., г.Пущино.
Публикации. Но результатам диссертации опубликованы 7 и ринято в печать 3 работы в виде статей и тезисов докладов. Поучено 3 авторских свидетельства на изобретения СССР и 10 удос-оверений на рационализаторские предложения.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из вве-ения, обзора литературы, описания методов исследования, экспе-иментальной части, обсуждения результатов, выводов. Список и тируемой литературы состоит из "ZVO ссылок: SO на отечественно и /0 на зарубежные источники. Работа изложена на /^~