Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Меланома кожи: современные представления о биологии и эпидемиологии опухоли 12
1.2. МикроРНК как эпигенетические регуляторы экспрессии генов 15
1.3. Роль микроРНКв развитии заболеваний 23
1.4. Роль микроРНК в развитии новообразований 26
1.5. МикроРНК при меланоме 29
1.6. МикроРНК и экспериментальная терапия злокачественных новообразований 33
1.7. Роль отдельных онко-микроРНК в патогенезе злокачественных новообразований 35
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 38
2.1. Характеристика образцов меланоцитарных новообразований 39
2.2. Экспериментальное моделирование меланомы кожи 41
2.3. Оценка динамики роста опухоли 44
2.4. Оценка метастазирования 45
2.5. Молекулярно-генетические методы исследования
2.5.1. Выделение мРНК 46
2.5.2. Реакция обратной транскрипции
2.5.3. ПНР с детекцией в реальном времени „, 47
2.6. Статистическая обработка материала 51
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 53
3.1. Анализ экспрессии микроРНК в биоптатах меланоцитарных новообразований 53
3.2. Анализ экспрессии микроРНК на экспериментальной модели мышиной меланомы 63
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 72
Выводы 88
Практические рекомендации 89
Список литературы
- Роль микроРНКв развитии заболеваний
- МикроРНК при меланоме
- Оценка динамики роста опухоли
- Анализ экспрессии микроРНК на экспериментальной модели мышиной меланомы
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Меланома кожи занимает лидирующее положение среди новообразований с непрогнозируемым течением, высоким уровнем смертности и низкой эффективностью терапии диссеминированных форм. За последний период времени частота меланомы кожи в нашей стране, как и во всем мире, значительно возросла (Новик А.В., 2011). В ряде стран наблюдается стабилизация уровня смертности от меланомы кожи, однако в РФ этот показатель сохраняет тенденцию к росту (Петрова Г.В. и др., 2014).
Меланома кожи (МК) - это опухоль нейроэктодермального происхождения, возникающая в результате злокачественной трансформации меланоцитов кожи (Демидов Л. В., 2013). Несмотря на то, что меланома относится к числу визуально диагностируемых опухолей, количество случаев позднего обращения за медицинской помощью остаётся по прежнему высоким. По гистогенезу, биологическим особенностям возникновения и роста, тяжести клинического течения опухолевого процесса меланома существенно отличается от новообразований другого генеза (Гилязутдинов И.А. и др., 2010). В связи с этим в последние годы неуклонно растёт интерес исследователей к изучению данного заболевания. Возросшая в настоящее время частота заболеваемости меланомой кожи в высокоразвитых странах объясняется не только учащением заболеваемости, но и улучшением диагностики, обусловленной высокой настороженностью людей к начальным проявлениям меланомы и возросшими знаниями предопухолевой патологии кожи у врачей. Ранняя диагностика и своевременное удаление первичной меланомы кожи являются основными составляющими успешной борьбы за излечение больного. Подавляющее большинство больных меланомой кожи -это взрослые люди, в основном трудоспособного возраста, что делает эту проблему социально значимой (Garbe С. et al., 2011). Более чем у половины больных меланома кожи развивается на фоне приобретенных или, реже, врожденных невусов (Menzies S.W., 2011). Для этой злокачественной опухоли, независимо от степени местной распространенности, характерно частое развитие отдаленных метастазов (Каштан М.А. и др., 2011).
В последние годы стало очевидным, что эпигенетические регуляторные механизмы играют ключевую роль в прогрессии опухолей и особая роль принадлежит некодирующим РНК. Необходим поиск молекулярных путей возникновения, развития и метастазирования меланомы кожи с целью дальнейшего возможного применения в диагностике и терапевтическом воздействии, что является крайне актуальным.
Степень разработанности темы исследования. Весьма значительным событием в биологии конца XX века стало открытие принципиально нового
класса малых молекул РНК (микроРНК), которые регулируют экспрессию генов (Никитин Е.Г. и др., 2014). Результатом данного открытия является возможность разъяснения молекулярных механизмов возникновения и развития меланомы кожи благодаря дальнейшему изучению и оценки регуляторов экспрессии генов на посттранскрипционном уровне, каковыми являются микроРНК, представляющие собой класс малых некодирующих РНК длиной 18-25 пар нуклеотидов, которые взаимодействуют по комплиментарному принципу с З'-нетранслируемыми областями мРНК-мишени. Это взаимодействие инициирует деградацию мРНК или препятствует её трансляции (Cullen B.R., 2009, Lewis В.P. et al, 2003). В ходе биогенеза микроРНК претерпевают ряд изменений - от молекулы при-микроРНК длиной 1000 нуклеотидов к конечной форме зрелой микроРНК (около 25 нуклеотидов). Делеции в генах микроРНК, а также сбой механизма их созревания могут являться важным звеном процесса трансформации клетки (Kumar M.S., 2007). Благодаря небольшому размеру каждая микроРНК, как правило может взаимодействовать с несколькими мРНК-мишенями - именно с теми, в которых имеются комплиментарные участки. В настоящее время известно, что микроРНК регулируют более 30% генов человека, включая гены, участвующие в развитии, клеточной дифференцировке, гемопоэзе, устойчивости к стрессу, метаболизме, клеточной пролиферации и апоптозе. (Esquella-Kersher A. et al., 2006.) Учитывая спектр генов, регулируемых микроРНК, очевидно, что нарушения в их функционировании могут существенно влиять на все стадии опухолевого процесса - от возникновения опухоли до метастазирования (Calin G. et al., 2006; Anand S. et al, 2011; Esteller M., 2008; He L. et al, 2004.; Ryan B.M. et al, 2011; Ventura A. et al, 2009).
Каждая опухоль имеет специфический набор активируемых микроРНК, но среди них можно выделить несколько микроРНК, которые наиболее часто встречаются в определенных опухолях (Calin G. et al., 2006). Перспективным для практического использования является оценка уровней экспрессии отдельных микроРНК, благодаря их тканеспецифичности, что делает возможным использование данных молекул в дифференциальной диагностике онкологических заболеваний.
Цель работы - исследовать особенности экспрессии онко-микроРНК при доброкачественных и злокачественных меланоцитарных новообразованиях in vivo и вероятную роль микроРНК в регуляции прогрессии меланомы.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Выявить особенности экспрессии онко-микроРНК (miR-21, miR-155, miR-200c, miR-205, miR-let-7b, miR-146a, miR-150, miR-196a, miR-218) в клетках меланомы и в доброкачественных меланоцитарных новообразованиях;
-
Определить связь относительных уровней экспрессии микроРНК (miR-21, miR- 155, miR-200c, miR-205, miR-let-7b, miR-146a, miR-150, miR-196a, miR-218) с патоморфологическими характеристиками новообразований;
-
Выявить особенности экспрессии онко-микроРНК (miR-21, miR-155, miR-200c, miR-205, miR-let-7b) в клетках первичной меланомы in vivo в преметастатическую и метастатическую фазы прогрессии опухоли;
4. Оценить особенности экспрессии онко-микроРНК (miR-21,miR-155,
miR-200c, miR-205, miR-let-7b) в органах-мишенях для метастазов меланомы
(легких, печени) in vivo на экспериментальной модели меланомы кожи В16 в
преметастатическую и метастатическую фазы развития опухоли.
Научная новизна. Впервые исследованы относительные уровни экспрессии микроРНК (miR-21, miR-155, miR-200c, miR-205, miR-let-7b, miR-146a, miR-150, miR-196a, miR-218) у пациентов с меланоцитарными новообразованиями в Красноярском крае.
Впервые выявлено in vivo, что в преметастатическую и метастатическую фазы развития меланомы относительные уровни экспрессии miR-21, miR-155, miR-205, miR-let-7b остаются неизменными в первичном опухолевом узле на экспериментальной модели меланомы В16.
Впервые показано, что в преметастатическую фазу развития меланомы в органах-мишенях для метастазов меланомы наблюдается повышение относительных уровней экспрессии miR-21, miR-205 и miR-let-7b, а в метастатичесую фазу определяется увеличение относительного уровня экспрессии miR-155 в легких, что свидетельствует о роли опухолевого микроокружения в развитии опухолевого процесса.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные экспериментальные данные раскрывают механизм канцерогенеза и вносят вклад в понимание и управление процессом метастазирования в клетках меланомы.
МикроРНК принимает активное участие в формировании микроокружения и условий возникновения метастазов в отдаленных органах-мишенях, подготавливая заранее микросреду и активируя сигнальные пути для миграции метастазов первичной опухоли в «преметаститические ниши». Тем самым микроокружение опухоли может являться объектом для модуляции с целью достижения противоопухолевого эффекта.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Относительные уровни экспрессии miR-205, miR-196а и miR-218 у человека снижены в клетках меланомы в сравнении с меланоцитарными невусами, что говорит об онкосупрессорной роли данных микроРНК. При локализации в области головы и шеи уровень miR-218 ниже, чем при локализации этой опухоли на нижних конечностях, что указывает на различные механизмы развития опухоли в зависимости от анатомического
расположения новообразования, а уровень miR-let-7b отмечается выше у лиц мужского пола, что может быть связано с характером гормональной регуляции miR-let-7b.
2. В динамике развития опухоли на экспериментальной модели in vivo уровни miR-21, miR-155, miR-205 и miR-let-7b сохраняются без изменений в первичном узле на 17 и 28 сутки после трансплантации клеток меланомы В16, что свидетельствует об отсутствии влияния данных микроРНК на прогрессию опухоли. В органах-мишенях метастазирования меланомы (легкие, печень) регистрируется повышение уровней онко-микроРНК miR-21, miR-205, miR-let-7b в преметастатическую фазу развития опухоли, а также miR-155 в легких в метастатическую фазу развития меланомы, что является свидетельством реорганизации опухолевого микроокружения в органах-мишенях для дальнейшего формирования дистантных метастазов меланомы.
Внедрение результатов исследования. Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, внедрены в учебный процесс кафедры патологической физиологии с курсом клинической патофизиологии имени проф. В.В.Иванова ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого Минздрава РФ».
Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Научно-практические аспекты современной онкологии» (Красноярск, 2013), на Всероссийской научной школе - конференции для молодых ученых по онкологии «Современная онкология: достижения и перспективы» (Новосибирск, 2013). На заседании проблемной комиссии ГБОУ ВПО КрасГМУ Минздрава РФ (протокол заседания № 2 от 06.05.2015).
Работа поддержана грантом фонда М. Прохорова, конкурс «Академическая мобильность, 2014» на средства которого была осуществлена научная стажировка в демонстрационной лаборатории компании «Агенство Химэксперт» представляющей компанию Life Technologies (США), по теме: «Введение в ПЦР в реальном времени. Теоретические основы. Анализ экспрессии генов» (Москва, 2014). Исследование поддержано грантом фонда Президента РФ (Р.Т.Г. МД-901.2013.7), Российским фондом фундаментальных исследований (Р.Т.Г. 13-04-01381), грантом Российского научного фонда (14-15-00074) и победой в конкурсе «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («УМНИК-2013») фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе патент на изобретение и 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России, содержащих результаты диссертационного исследования.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 113
страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 23 рисунка, 9 таблиц. Библиографический список содержит 183 источника, из которых 30 отечественных и 153 иностранных авторов.
Роль микроРНКв развитии заболеваний
Открытие РНК-интерференции (РНКи) в 2006 году американскими учеными Mello С. и Fire А., получившими Нобелевскую премию по физиологии и медицине, дало возможность к пониманию механизмов управления и регулирования процессов синтеза различных белков в клетках (Zhou X. et al, 2012; Lele R.D., 2009; Ebhardt H.A., 2007).
РНКи - это механизм подавления экспрессии гена на стадии трансляции (синтеза белка из аминокислот), либо нарушение транскрипции (перенос информации с ДНК на РНК) определенных генов. В процессе РНКи принимают участие два типа малых молекул РНК - микроРНК и малые интерферирующие РНК (siRNA). Малые РНК связываются со специфическими последовательностями других молекул РНК и повышают или понижают их биологическую активность. МикроРНК регулируют экспрессию генов, участвовавших в разнообразных биологических процессах, таких как, онкогенез, иммунный ответ, секреция инсулина, синтез нейромедиаторов и циркадный ритм (Zhou X. et al., 2012).
Известно, что более 75% генома человека способно транскрибироваться и больше половины этих транскриптов относятся к некодирующим РНК (ENCODE Project Consortium, 2012). Эти РНК не имеют открытых рамок считывания для трансляции белка. Они делятся на две весомые группы: на длинные некодирующие РНК размером от 200 до 10000 нуклеотидов и малые некодирующие РНК, размером менее 200 нуклеотидов. Среди последних наиболее исследован класс так называемых микроРНК, которые выполняют важнейшие регуляторные функции в жизнедеятельности нормальных клеток (Киселев Ф.Л., 2014).
В последние годы наметилось направление в ранней диагностике онкологических заболеваний, связанное с открытием в геноме человека генов, кодирующих регуляторные молекулы - микроРНК, которые негативно регулируют экспрессию многих генов (Sen С.К. et al., 2007). Известно, что микроРНК участвуют практически во всех биологических процессах клеток организма в норме и при разных патологических состояниях. По современным представлениям нарушение экспрессии отдельных микроРНК, регулирующих онкогены и раковые супрессорные гены, является одним из механизмов канцерогенеза. Сами микроРНК могут выступать в роли как онкогенов, так и супрессоров опухолевого роста (Krutovskikh V.A., 2010). Более того, они могут быть использованы в качестве биомаркеров в диагностике и прогнозе многих онкозаболеваний (Forte S. et al., 2015; Takahashi R.U. et al., 2015) в том числе и при меланоме кожи (Howell М.Р., et al.,2010).
МикроРНК представляют собой многочисленный класс эндогенных рибонуклеиновых кислот, состоящих из 21-25 нуклеотидов и не являются кодирующими последовательностями, которые образуют в результате созревания предшественников, премикроРНК, обладающих характерной шпилько-подобной вторичной структурой. В процессинге миРНК, который начинается в ядре и продолжается в цитоплазме, участвуют эндонуклеазы Drosha и Dicer, коактиватор DGCR8 и другие факторы (Bartel D.P., 2004; Kim V.N., 2005). Гены микроРНК в геноме могут располагаться рядом друг с другом, образуя кластеры, которые транскрибируются как единые полицистронные транскрипты. МикроРНК способны регулировать на посттранскрипционном уровне экспрессию генов-мишеней, мРНК которых у животных имеют, как правило, в З -нетранслируемой области (НТО) комплементарные сайты связывания микроРНК. Ключевой участок микроРНК, ответственный за узнавание мРНК-мишени, включает со 2-ого по 7-ой нуклеотид с 5 -конца и называется «8ееё»-областью (или областью затравки). (Bartel D.P., 2009). В комплексе с белками микроРНК связываются с З -НТО и вызывают деградацию и/или ингибирование трансляции целевой мРНК (мРНК-мишени, «target mRNA») (Bartel D.P., 2004; Filipowicz W. et al., 2008; Guo H. et al, 2010; Hendrickson D.G. et al, 2009). Как правило, мРНК может быть мишенью сразу нескольких микроРНК, а одна микроРНК может регулировать экспрессию нескольких генов-мишеней. (Bartel D.P., 2004; Kim V.N., 2005). По мнению отдельных авторов, экспрессия от 30 до 60% генов человека контролируется микроРНК (Lewis В.Р. et al, 2003; Friedman R.C. et al.,2009).
Уровни экспрессии микроРНК зачастую различаются между клетками различных тканей и опухолей, что может помочь в определении органной принадлежности опухолей, предсказании ответа на терапию и определения прогноза течения болезни.
Образование микроРНК (miRNA) начинается с транскрипции кодирующих генов с помощью РНК полимеразы П. Известно, что у млекопитающих более 90 % микроРНК кодируются нуклеотидными последовательностями, которые находятся в интронах (участках ДНК, являющихся частью генов, но не содержащих информации о
последовательности аминокислот кодируемого им белка). Для сравнения, только 14 % микроРНК червей и мух кодируются генами, локализованными в интронах (Rodriguez A. et al, 2004; Kim Y. et al, 2007). Интрон, состоящий из 400 пар нуклеотидов, вырезается из первичного транскрипта и становится первичной микроРНК (pri-miRNA). На следующем этапе pri-miRNA под действием РНКазы III, названной Drosha, совместно с другими факторами превращается в «шпильку» — последовательности длиной в 70 нуклеотидов, называющиеся pre-miRNA (рис. 1).
МикроРНК при меланоме
На последующем этапе исследования были проведены исследования на экспериментальной мышиной модели меланомы кожи in vivo.
При работе с экспериментальными животными соблюдались основные принципы, изложенные в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных», (2007), а также приказа МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики».
Создание экспериментальной модели меланомы кожи происходило на мышах линии С57В1/6, которые являются стандартной линией для создания модели меланомы кожи in vivo в соответствии с протоколом, описанным (Аксененко М.Б. и др., 2013). Для создания модели меланомы in vivo животные были получены из вивария ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук». Мышам была произведена трансплантация культуры клеток меланомы В16, полученная из института ФБГНУ «НИИ фундаментальной и клинической иммунологии».
Меланома В16 является высокометастатической линией, широко используемой для изучения механизмов метастазирования, а также тестирования различных терапевтических агентов. Меланома В16 метастазирует в 2 этапа: сначала в лёгкие, а затем из лёгких в другие системы органов (Stackpole C.W. et al, 1991). Как правило, высокометастатические линии опухолей способны сформировать отдаленные метастазы при подкожной имплантации. (Miller F.R. et al., 1990).
Перевивка клеток меланомы В16 двум животным производилась путём подкожного введения 0,5 мл взвеси опухолевых клеток по стандартным методикам, при этом была использована доза 1 105 клеток/мышь, которая превышает минимальную туморогенную дозу здоровых мышей в 1,5-2 раза. После размораживания ампулы с культурой клетки, в шприц набирали клеточную взвесь, обрабатывали место инъекции животного 70 % спиртовым раствором. Оттягивая кожу в месте инъекции, вкалывали иглу поверхностно, чтобы её было видно через полупрозрачную кожу, далее продвигали иглу под кожу на 5-10мм. Введение клеточной взвеси производилось под визуальным просмотром до появления чётко определяемой папулы. Далее осторожно извлекали иглу, аккуратно протирали место инъекции, поместив мышь обратно в клетку. От введения последних 0,5 мл оставшихся в шприце отказывались, так как обычно опухолевые клетки имеют тенденцию к оседанию, что приводит к непропорционально большому количеству опухолевых клеток в последующих инъекциях.
После трансплантации клеток меланомы мышей наблюдали в течение 14 дней: ежедневно измеряли вес мыши и оценивали размер опухолевого узла. Когда опухолевый узел достигал в объеме более 1 см , производилось умерщвление животных под воздействием эфирного наркоза путем дислокации шейных позвонков, с последующим выделением опухолевого узла. Используя анатомический пинцет и малые остроконечные ножницы, захватывали кожный лоскут по средней линии нижней части брюшной стенки. Производили разрез кожи в сагиттальном направлении и 2 перпендикулярных разреза по направлению к подмышечной и паховой впадинам со стороны локализации опухолевого узла. Кожный лоскут оттягивали пинцетом и фиксировали к лотку фиксирующими иглами. Используя чистый анатомический пинцет и чистые большие ножницы с изогнутыми браншами максимально щадяще для исключения перфорации брюшной полости или кожи отсепаровывали опухолевый узел, который помещали на стерильную чашку Петри №1. Далее используя малый анатомический пинцет и малые остроконечные ножницы, освобождали опухолевый узел от капсулы и возможных некротических участков, которые помещали в крышку чашки Петри №1.Подготовленные опухолевые массы промывали избыточным объемом питательной среды 199, которую набирали в 20 мл шприц с помощью длинной иглы большого сечения. Промытые фрагменты опухоли переносили с помощью пинцета во взвешенную заранее чашку Петри №2 с указанной на упаковке массой, которую помещали в упаковочный материал, взвешивали на обычных весах и фиксировали массу чашки с опухолевым материалом, по разнице масс определяем массу опухоли для перевивки. После чего взвешенную массу опухоли в чашке Петри №2 измельчали с помощью больших закругленных изогнутых ножниц под полуприкрытой крышкой для исключения контакта с окружающим воздухом. После измельчения готовили опухолевую взвесь 10% концентрации (1 г/10 мл), добавляя к опухолевой массе рассчитанный ранее нужный объем питательной среды. Равномерно размешивали приготовленную опухолевую взвесь, готовили инокулят для трансплантации. Непосредственная перевивка опухоли опытным животным производилась путём подкожного введения 0,5 мл взвеси опухолевой ткани в среде 199. Животные контрольной группы оставались не привитыми.
Животные содержались в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (Страсбург, 1985), при температуре 18-22 0 С со свободным доступом к воде и пище. Животные были разделены на 3 группы: I группу составили контрольные здоровые животные без трансплантированной меланомы, прожившие 17 суток (п=10), II группу составили опытные животные с трансплантированной меланомой, прожившие 17 суток (п=10) и выведенные из эксперимента на этапе локализованной опухоли в преметастатической фазе, III группу составили опытные животные с трансплантированной меланомой кожи, которые прожили 28 суток (п=10), выведенные из эксперимента на этапе диссеминированной опухоли в метастатической фазе развития.
В ходе эксперимента регистрировали число животных, у которых развилась опухоль. Линейные размеры опухоли измеряли в двух взаимно перпендикулярных направлениях каждые три дня, начиная с пятого дня после трансплантации клеток меланомы. Во всех имеющихся группах каждые 3 дня определяли объем опухолей по формуле: TV = L W /2, где TV- объем опухоли, L - длина опухоли и W - ширина опухоли (Киселев В.И. и др., 2012). 2.4. Оценка метастазирования
При вскрытии все внутренние органы животных подвергались визуальному осмотру. Подсчёт количества метастазов в лёгких, печени животных, проводился при помощи лампы-лупы. После чего препараты фиксировались в 10 % забуференном формалине, затем заключались в парафин. Далее с каждого органа была получена серия гистологических срезов толщиной 4-5 мкм, которые в последствии окрашивались гематоксилин-эозином. Микропрепараты оценивались под микроскопом Olympus ВХ 41. при ув. 600 с помощью программы «Infinity Capture», камеры (Lumenera Corporation) и программного обеспечения V.4.6.O. при увеличении хЮО, х400, хбОО. Подсчёт метастазов производился в основных органах метастазирования: лёгких, печени. Определялось количество метастатических очагов на микропрепарате, при подсчёте парные органы рассматривались как единый органокомплекс и для них рассчитывалось среднее значение.
Оценка динамики роста опухоли
Вместе с тем, было выявлено, что уровни miR-21, miR-205 и miR-let-7b повышаются в ткани легкого и печени в преметастатическую фазу в сравнении с контрольной группой, при этом различий между преметастатической и метастатической фазой различий не выявлено. MiR-155 значительно возрастает в легких, а именно в группе «Метастатическая фаза» в сравнении с группой «Контроль», при этом в печени различия для данной микроРНК отсутствуют. Также для miR-200c статистически значимых различий в органах-мишенях выявлено не было.
При анализе относительных уровней экспрессии для всех трех экспериментальных групп, а именно в контрольной группе в нормальных меланоцитах кожт по сравнению (преметастатическая и метатстатическая фазы) с опухолевыми клетками меланомы для двух экспериментальных групп, выявлены статистически значимые различия для группы «Контроль» в сравнении с группами «Преметастатическая фаза» и «Метастатическая фаза» для таких исследуемых микроРНК, как miR-21, miR-155, miR-205, miR-let-7b. Для miR-200c статистически значимых различий выявлено не было (табл. 9, рис.21). Таблица 9.
Далее переходили к многогрупповому анализу с помощью критерия Краскела-Уоллиса. При сравнении уровней экспрессии микроРНК в нормальных меланоцитах кожи мышей контрольной группы и опухолевых клеток первичного узла двух экспериментальных групп, выявлено, что miR-21 и miR-let-7b повышен в опухолевых клетках меланомы как в преметастатической, так и в метастатической фазах в сравнении с нормальными меланоцитами, выступая в этом случае в роли опухолевого активатора, a miR-155 и miR-205 снижен в опухолевых клетках, при этом miR-155 значимо снижен в метастатической фазе, a miR-205 в преметастатичекой и метастатической фазах в сравнении с нормальными меланоцитами, что свидетельствует об их действии как онкосупрессоров при канцерогенезе (рис.19). При анализе miR-200c значимых различий выявлено не было, р=0,94 (рис.20).
Оценивая относительные уровни экспрессии исследуемых микроРНК в органах-мишенях метастазов меланомы (легкие и печень) на экспериментальной модели для всех трех опытных групп, выявлено, что miR-21, miR-155, miR-205, miR-let-7b статистически значимо изменяются при сравнении групп «Контроль» и «Преметастатическая фаза» в легочной ткани (рис.21). Увеличивая уровни экспрессии в преметастатическую фазу для miR-21, 205 и miR-let-7b и в метастатическую фазу для miR-155 по сравнению с нормальной тканью легких контрольной группы
Помимо этого, значимо изменяются относительные уровни экспрессии miR-21, miR-205, miR-let7-b в ткани печени при сравнении групп «Контроль» и «Преметастатическая фаза» (рис.22). 1200 1000 600 600 400 200
При этом видно, что уровни экспрессии микроРНК значительно выше в ткани легкого в группе «Преметастатическая фаза» в сравнении с группой «Контроль» для miR-21, miR-205, miR-let-7b, a miR-155 значимо увеличен в группе «Метастатическая фаза» в отличие от группы «Контроль», также в ткани печени наблюдается увеличение уровней экспрессии miR-21, miR-205, miR-let-7b в преметастатическую фазу в сравнении с контрольной группой (рис.22).
Выявлено, что в группе «Преметастатическая фаза» на 17 сутки определяется 100% отсутствие метастазов, а в группе «Метастатическая фаза» на 28 сутки процесс метастазирования в легкие наблюдался в 60% случаев, при этом метастазирование в печень не наблюдалось.
В опухолевой ткани животных для двух экспериментальных групп преметастатической и метастатической фаз уровень экспрессии микроРНК (miR-21, miR-155, miR-200c, miR-let-7b) в динамике роста опухоли оставался неизменным, р>0.05 (табл.8).
Анализ экспрессии микроРНК на экспериментальной модели мышиной меланомы
Злокачественные новообразования кожи, включая меланому, в структуре всех злокачественных опухолей человека составляют более чем одну третью часть, что делает их одними из наиболее часто встречающихся типов злокачественных новообразований (Pollock P.M. et al, 200). Несвоевременность диагностики меланомы кожи значительно влияет на прогноз заболевания и на показатели выживаемости, и обусловливает необходимость разработки мер вторичной профилактики меланомы кожи, направленной на раннюю диагностику меланомы, когда толщина опухоли незначительна для получения наиболее эффективного лечения.
Проблемой, остающейся актуальной до сегодняшнего дня, является повышение эффективности диагностики, а также терапии злокачественных новообразований. Несмотря на значительные достижения, связанные с применением в онкологии цитостатиков, высокая токсичность, недостаточная избирательность и эффективность действия имеющихся химиотерапевтических препаратов заставляет исследователей обращаться к поиску иных средств и методов воздействия на опухоль.
В настоящее время хорошо известно, что изменение экспрессии микроРНК наблюдается при многих видах рака, включая меланому. МикроРНК являются перспективными биомаркерами при онкологических заболеваниях. Современными лабораториями активно проводятся исследования, посвященные поиску микроРНК-маркеров канцерогенеза при раке груди, легких, кишечника и других, при этом для меланомы имеются только единичные результаты исследований, большинство из которых являются пилотными, и проводятся на выборках малых объемов (Бутенко Е.В. и др., 2014). В связи с этим результаты нашего исследования внесут существенный вклад в изучение данной проблемы. Полученные нами данные относительных уровней экспрессии микроРНК в невусах и меланомах, образцов, полученных от пациентов, согласуются с результатами зарубежных исследователей для трех из исследуемых микроРНК: активность miR-205, miR-196a, miR-218 в клетках меланомы достоверно ниже таковых в нормальных клетка - меланоцитах. Таким образом, данные микроРНК являются генами-онкосупрессорами при развитии меланомы кожи, как следствие, играя важнейшую роль, в предотвращении процесса канцерогенеза и свидетельствуя о нарушениях их функциональной активности при возникновении онкологического процесса.
По имеющимся литературным данным miR-205 выступает в роли онкосупрессора, в частности, при раке молочной и щитовидной желез (Колесников Н.Н. и др., 2013). Помимо этого, соответствуя накопленной информации в обзорах литературы о характеристиках miR-205 и неоднозначной роли при различных видах онкологических процессов, имеется информация о том, что в некоторых случаях выявлены данные об обратной роли miR-205 в инициировании опухоли, прогрессировании и появлении метастазов, действуя при этом как онкоген, через облегчение инициирования опухоли и пролиферации, а в некоторых случаях в качестве супрессора опухоли через ингибирование пролиферации и вторжения опухолевых клеток (Orang A.V. et al., 2014). Учитывая критические эффекты нерегулируемого miR-205 на процессы, связанные с туморогенезом, они имеют потенциал как новые терапевтические мишени и биомаркеры.
Анализируя исследования Dar А.А. и соавторов на клетках меланомы В16 in vitro в отношении miR-205, в которых стабильная избыточная экспрессия miR-205 подавляет размножение клеток меланомы. Выявленные нами результаты совпадают с опубликованными данными, подтверждая действие miR-205 как онкосупрессора in vivo (Dar А.А., et al., 2011).
В исследованиях отдельных авторов показано, что miR-205 функционирует в качестве онкосупрессора в равной степени, как и miR-200c (Xu Y. et al., 2012). Выявлено, что два вышеуказанных вида микроРНК были единственными из 735 тестированных в материалах меланомы кожи, выделенных из парафиновых блоков и показавших статистически достоверное снижение при меланоме по сравнению с невусами, а также статистически значимые различия между первичными меланомами и метастазами. При этом дальнейшие исследования in vitro для оценки интенсивности пролиферации, инвазивного роста в трансфектированных клетках меланомы кожи с повышенной экспрессией miR-205, miR-200c не дали достоверных различий с контролем. По результатам других исследований, выявлено снижение уровней экспрессии miR-200c в клетках меланомы в сравнению с невусами (Liu S. et al., 2012). По нашим данным относительные уровни экспрессии miR-200c определить не удалось, возможно вследствие слишком низких уровней экспрессии даже в ткани невусов. Поэтому роль данной микроРНК в нашем исследовании при анализе уровней экспрессии в биоптатах фиксированных в формалине и заключенных в последствии в парафин выявлена не была. Хотя в исследованиях на профили микроРНК, в отличие от других, miR-200c совместно с miR-205 показали значительные снижения в ткани меланомы в сравнении с тканью невусов (Xu Y. et al., 2012). Результаты нашего исследования доказывают роль miR-205 как онкосупрессора при возникновении меланомы кожи.
Относительно другой микроРНК, соответствуя опубликованным исследованиям, miR-196a значительно снижается в злокачественных клетках меланомы и образцах ткани в сравнении с нормальными меланоцитами. Как уже было сказано выше miR-196a может негативно регулировать экспрессию фактора транскрипции. Некоторые гены-мишени факторов транскрипции принимают участие в таких процессах, как онкогенез, клеточная адгезия, пролиферация и апоптоз. Необходимо держаться направления на дальнейшее расследование потенциального действия miR-196a — факторы транскрипции гены-мишени факторов транскрипции (Mueller D.W. et al., 2011). Известно, что в клетках меланомы miR-196a регулирует гены-мишени, отвечающие за клеточную адгезию, реконструкцию цитоскелета, инвазивное поведение опухоли (Mueller D.W. et al., 2011). По результатам проведенного нами исследования достоверно значимо снижается экспрессия данной микроРНК в ткани меланомы в сравнении с невусами, доказывая ее действие как онкосупрессора.
Также в нашем эксперименте мы наблюдали снижение miR-218 в ткани меланом в сравнении с тканью невусов, заключенных в парафиновые блоки, что подтверждается другими исследованиями, проводимыми с нативной тканью меланом и невусов, где miR-218 регулирует пролиферацию, миграцию и вторжение клеток меланомы, снижаясь в меланоме (Wei Y. et al., 2014). Наше исследование подтверждает роль данной микроРНК как онкосупрессора при меланоме с возможностью определения экспрессии в ткани фиксированной в формалине и заключенной в парафин.
По другим микроРНК значимых различий выявлено не было, что возможно может быть связано с гетерогенностью опухоли и/или отсутствием тканиспецифичности при данном опухолевом процессе для данных микроРНК. Что подтверждает необходимость дальнейшего исследования этих микроРНК-маркеров. По отдельным результатам зарубежных исследований имеются данные о том, что miR-21 активно участвует как онкоген, регулируя клетки меланомы, участвуя в инвазии и росте опухоли, но при этом доказано отсутствие влияния на пролиферацию и миграцию клеток меланомы (Martin del Campo S.E. et al., 2015). Kim N. и соавторы оценивая в NK-клетках мышей и человека уровни экспрессии miR-150 показали роль данной микроРНК как онкогена на посттранскрипционном уровне, доказав, что при терапевтическом контроле данной микроРНК повышается иммуннотерапия против опухоли (KimN, et al., 2014).