Исследование механизмов нарушения морфо-функционального состояния культивированных клеток-зерен мозжечка при нейроцитотоксическом действии глутамата Стельмашук, Елена Викторовна

Введение к работе

За последнее десятилетие накопились данные как клинического, так и экспериментального характера, указывающие на то, что появление в мозге избытка эндогенных возбуждающих аминокислот является одним из патогенетических факторов повреждения нейронов при различных острых и хронических заболеваниях центральной нервной системы. В связи с этим особую актуальность приобрели исследования механизмов деструктивных процессов, происходящих в нейронах под действием токсических доз глутамата (ГЛУ) и его аналогов. Для объяснения механизмов, опосредующих нейродеструктивное действие глутамата, еще в начале 70-х годов Олни (Olney, 1978) предложил одну из первых гипотез токсичности возбуждающих аминокислот. Согласно этой гипотезе постоянная деполяризация нейронов, происходящая при продолжительном воздействии токсических доз глутамата, приводит к увеличению проницаемости цитонлазматической мембраны для различных ионов, что в свою очередь активирует энергозависимые механизмы, направленные на восстановление внутриклеточного ионного гомеостаза. Однако, энергетические ресурсы клеток быстро истощаются, и недостаточное функционирование ион-транспортных систем приводит к такому нарушению ионного баланса, при котором клетки оказываются необратимо поврежденными. Полученные в настоящее время данные во многом подтверждают гипотезу Олни. Показано, что активированные глутаматом рецепторы открывают связанные с ними ионные каналы, проницаемые для ионов Na⁺ и Са²⁺. Деполяризация мембраны, обусловленная в основном входом в нейроны ионов Na⁺, приводит к тому, что Са²⁺ начинает поступать в клетки и через потенциалзависимые Са²⁺-каналы. Избыточный вход Са²⁺ в клетки рассматривается многими исследователями как одна из основных причин повреждения нейронов в результате действия возбуждающих аминокислот in vitro (Choi, 1985), а также при гипоксии/ишемии, гипогликемии и эпилепсии. Вместе с тем, наряду с кальциевой перегрузкой при токсическом воздействии ГЛУ отмечается значительное увеличение в цитоплазме нейронов ионов натрия. В ряде работ отмечено, что удаление натрия из

инкубационного раствора может снижать токсичность ГЛУ. В последние годы экспериментально показано снижение уровня АТФ в клеточных культурах, подвергнутых цитотоксической обработке ГЛУ (Богачев с соавт., 1992), однако причины этого снижения остаются не до конца изученными, поскольку оно может происходить как в результете активации энергозависимых процессов, так и вследствие нарушения функционирования митохондрий - основного источника АТФ в клетках. Таким образом, вопрос о нарушении клеточной энергетики при токсических воздействиях ГЛУ, являющийся, фактически,ключевым в гипотезе Олни, на момент начала данного исследования оставался не ясен. Другие важные факторы повреждения нейронов - это стойкое повышение в них концентрации свободного цитозольного Са²⁺ ([Ca²⁺]i) после кратковременого (в течение нескольких минут) воздействия глутамата и причины, препятствующие нормализации [Ca²⁺]j после прекращения действия ГЛУ. Естественно поэтому было поставить вопрос о функционалных изменениях митохондрий, а также роли Na⁺/H⁺, Na⁺/Ca²⁺- обменников, Са²⁺- АТФазы и №⁺/К⁺-АТФазы в нейродеструктивных процессах, индуцированных кратковременным воздействием глутамата.

Цель настоящего исследования состояла в изучении морфо-функционального состояния митохондрий культивируемых клеток-зерен после цитотоксического действия ГЛУ, а также роли мембранных систем переноса ионов в нейродеструктивных процессах, индуцируемых ГЛУ.

Задачи исследования
исследование функционального состояния митохондрий
культивированных клеток-зерен после кратковременного

воздействия ГЛУ;

- исследование ультраструктуры клеток-зерен после глутаматиого
воздействия;

- изучение влияния уабаина, блокатора Na⁺/K⁺-АТФазы, на
цитотоксичность ГЛУ;

- исследование внутриклеточного рН при действии ГЛУ;

исследование влияния блокатора Ка⁺/Н⁺-обмена этилнзопропиламилорида (ЕІРА), в постглутаматпьш период на отсроченную гибель нейронов, вызванную глутаматом;

- исследование влияния блокады Ка⁺/Са²⁺-обмена с помощью 3,4-дихлоробензамипа (DCB) и удаления внеклеточного Na⁺ на нейротоксический эффект глутамата.

Научная новизна исследования определяется рядом впервые полученных данных. Было показано, что:

а) нейроцитотоксическая обработка ГЛУ культивированных
клеток-зерен мозжечка ведет к падению мембранного потенциала и
изменению ультраструктуры митохондрий этих нейронов;

б) ионы кобальта и МК-801 - блокатор активированных каналов,
ассоциированных с NMDA-рецепторами, предотвращают падение
мембранного потенциала митохондрий клеток-зерен, вызванное ГЛУ;

в) блокада транспорта кальция в митохондрии рутениевым
красным предотвращает падение митохондриального потенциала
клеток-зерен при действии глутамата;

г) предобработка культивированных клеток-зерен мозжечка
блокатором №⁺/К⁺-АТФазы - уабаином снижает токсический
эффект ГЛУ;

д) блокада Ка⁺/К⁺-АТФазы уабаином и Са²⁺-АТФазы эозином в
постглутаматном периоде увеличивает токсичность глутамата;

е) блокада Na⁺/H⁺-o6MeHa в течение постглутаматного периода
приводит к уменьшению, а блокада Na⁺/Ca²⁺ обмена - к увеличению
нейроцитотоксического эффекта глутамата.

Научно-практическое значение работы.
Данные, полученные в настоящем исследовании, могут служить
экспериментальным обоснованием для разработки

фармакологических препаратов, способных уменьшать или предотвращать иейродегенеративные изменения при острых и хронических патологических состояниях ЦНС.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Кратковременная обработка ГЛУ культивированных клеток-зерен мозжечка ведет к падению мембранного потенциала и изменению ультраструктуры митохондрий этих нейронов.

1. Одной из главных причин деэнергизации митохондрий является вызванный ГЛУ вход в клетку ионов кальция, так как ионы кобальта - конкурентного антагониста Са²⁺ , и МК-801 -блокатор каналов глутаматных рецепторов, предотвращают падение мембранного потенциала митохондрий клеток-зерен, вызванное ГЛУ.

2. Кальций, поступивший в клетку при действии ГЛУ, транспортируется в митохондрии и вызывает их деэнергизацию, поскольку ингибирование этого транспорта с помощью рутениевого красного предотвращает снижение мембранного потенциала митохондрий и оказывает выраженный защитный эффект.

4. В нормализации внутриклеточного ионного баланса,
нарушенного глутаматом, принимают активное участие АТФ-
зависимые системы транспорта ионов кальция и натрия, поскольку
блокада АТФаз в постглутаматном периоде ведет к увеличению
нсйроцитотоксичности глутамата.

5. Воздействие токсических концентраций ГЛУ вызывает стойкое снижение цитоплазматического рН культивированных клеток-зерен, что может активировать работу Na⁺/H⁺ -обменника и приводить к дополнительному увеличению [Na"¹"];.

6. Na⁺/H⁺ обмен участвует в реализации нейроцитотоксического эффекта возбуждающих аминокислот в течение постглутаматного периода, поскольку его блокада с помощью этилизопропиламилорида после обработки клеток глутаматом снижает степень повреждения культур. Это защитное действие, возможно, объясняется интенсификацией №⁺-зависимого вывода Са²⁺ в результате относительного снижения концентрации внутриклеточного Na⁺ при блокаде Na⁺/H⁺ обмена.

7. Na⁺/Ca²⁺ -обменник осуществляет выведение избыточного Са²⁺, накапливающегося в культивируемых клетках-зернах мозжечка, поскольку его блокирование с помощью DCB или путем удаления Na⁺ из солевого раствора в постглутаматном периоде усиливает нейроцитотоксическое действие ГЛУ.

8. Предобработка культивированных клеток-зерен мозжечка блокатором Na⁺/K⁺ - АТФазы - уабаином снижает токсический эффект ГЛУ, возможно, вследствие экспрессии нейротрофических факторов, вызванной сдвигом ионного баланса нейронов.

Апробация диссертационного материала Материалы настоящего исследования были представлены на Учредительном Конгрессе по патофизиологии (Москва, 1991); на международном симпозиуме Нейронаук (Киото, 1995); на третьих научных чтениях имени академика С.А.Саркисова и симпозиуме "Современные представления о структурно-функциональной организации мозга (Москва, 1995); на первом Конгрессе нейронаук (Берлин, 1996); 4-м Российско-Шведском симпозиуме "Новые исследования в нейробиологии" (Москва, 1996), на 2-й международной конференции "Гипоксия в медицине" (Москва, 1996), на научной конференции и Ученом Совете НИИ мозга РАМН (Москва, 1997).

Структура диссертации. Диссертация изложена на 156 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературных данных, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и список литературы, состоящий из 22 отечественных и 172 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 2 таблицами и 27 рисунками.