Введение к работе
Актуальность темы. Трансмембранний глпкопротенн Р-170 осуществляет защиту клетки от воздействия широкого круга токсических веществ. Р-170 работает как энергозавпепмый насос, выводящий из цпто-плазматнческого пространства инородные лнпофнльные вещества в весовом диапазоне от 500 до 1000 Дт, не сходные по структуре и механизмам действия. В круг этих веществ входят многие хпмпотерапевтнчеекпе препараты природного происхождения: растительные алкалоиды (среди них впнбластнп и колхицин), антрацнклшювыс антибиотики, эшшодофплло-токспны и др., а также флуоресцентные красители. Гиперфункция Р-170 приводит к множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) опухолевых клеток. Феномен МЛУ часто встречается при лечении онкологических заболеваний.
Регуляция активности Р-170 и механизмов, обеспечивающих выброс токсинов из клетки изучены недостаточно. Исследование Р-170 как одной из основных защитных систем клетки представляет существенный интерес. Одной из важных проблем в изучении этого белка является разработка методов наблюдения за функциональной активностью Р-170. Одним из таких методов является оценка скорости выведения из клеток флуоресцентных красителей, являющихся субстратами Р-170. Сообщения о применении подобных методик для исследования активности Р-170 начали появляться перед началом нашей работы. Однако для широкого применения этого метода необходимо было оценить его чувствительность. Нужно было проверить также, можно ли использовать флуоресцентные красители для исследования природных популяций, которые характеризуются гетерогенностью п невысокой степенью функциональной активности Р-170.
Развитие МЛУ клеток создает серьезное препятствие для химиотерапии онкологических заболеваний. В связи с этим важной практической проблемой остается диагностика МЛУ. Методы молекулярной биологии
позволяют определить, присутствуют ли клетки, экспресспрующне Р-170, в опухолевой ткани. Однако экспрессия в клетках Р-170 еще не говорит о том, что белок находится в активном состоянии. Поэтому важно определить не только уровень экспрессии гена, но и проявление функциональной активности сто продукта - белка Р-170. Развитие в клетках МЛУ - многоступенчатый процесс. Существуют противоречивые данные об участии Р-170 на ранних стадиях развития МЛУ. Поскольку в природе обычно клеткп обладают низкими уровнями устойчивости, то определение степени активности Р-170 на начальных этапах развития МЛУ представляет особенный интерес.
Важной теоретической проблемой является изучение механизмов появления клеток с МЛУ. Индукция экспрессии Р-170 химиопрспаратамп -одна из возможных причин возникновения резистентных вариантов. Однако механизм воздействия цптостатпков на клетки до енх пор подробно не изучен. Особенно неясным остается вопрос, как реагируют клетки с различным начальным уровнем устойчивости на воздействие цптостатпков.
Количественная оценка связывания антрациклпновых антибиотиков с ДНК - важный параметр эффективности действия лекарства. До сих пор не существует методов, позволяющих оценивать количество антибиотиков, связавшихся с мишенью действия.
Решение этих проблем актуально как для фундаментальных исследований, так и для клинической практики.
Цель работы.
Отработка методов с использованием флуоресцентных зондов для: а) измерения функциональной активности Р-170 в клетках; б) для измерения количества связавшегося с мишенью препарата - субстрата Р-170. Применение отработанных методов для решения некоторых экспериментальных и практических задач.
Задачи исследования:
-
Отработать методику выявления клеток с функционально активным Р-170 с применением флуоресцентных красителей Родамина-123 п Хехста-33258, определить разрешающую способность метода.
-
Изучить возможность оценки количественного связывания с ДНК антрацнклпновых антибиотиков и оценить, как активность Р-170 влияет на связывание антрацпклпнов с ДНК.
-
Применить отработанную методику с использованием Родампна-123 для оценки функциональной активности Р-170 в культивируемых клетках
>еловска п грызунов начальных этапов развития МЛУ.
-
Исследовать влияние цитостатика (колхицина) на функциональную ктивпость Р-170 в модельных системах - культивируемых клетках жн-ютных и человека с разной степенью экспрессии гепа MDR1.
-
Применить разработанную методику с использованием Родампна-123 іля изучения возможности выявлеппя клеток с активным Р-170 в при-юдных клеточных популяциях - у больных хроническим мпелондным
ІЄИК030М.
6. Определить, размножаются ли преимущественно у больных хро-
шчеекпм мпелондным лейкозом клетки, экспресспруюшпе одновременно
іва антигена - белок Р-170 и маркер стволовых клеток костного мозга
іеловека CD3i.
Научная новизна и практическая значимость работы
В результате проведенных исследований впервые показано, что метода с использованием флуоресцентных зондов обладают высокой разрешающей способностью, позволяющей выявлять минимальные изменения гктнвности Р-170 п малые фракции клеток с активным Р-170 в гетерогенных клеточных популяциях.
Впервые на экспериментальных моделях показано, что функциональная активность Р-170 проявляется в опухолевых клетках человека с минимальным (2-кратным) уровнем резистентпости к селективному агенту, что свидетельствует о том, что не только в клетках грызунов, НО II в клетках человека первые этапы МЛУ могут обеспечиваться повышением гктнвности Р-170. Выявлена активация работы Р-170 в клетках человека и крысы после кратковременного воздействия колхицина. Показано, что :тспснь активации белка зависит от исходного уровня экспрессии гена VIDR1 в клетках.
Исследование природных клеточных популяций - клеток периферической крови больных хроническим мпелондным лейкозом - показало, что зысокому уровню экспрессии Р-170, выявляемому с помощью монокло-іальньїх антител, не во всех случаях соответствует высокая функциональная активность белка. Эти данные свидетельствуют о необходимости сочетапного применения нммуногистохпмпческого определения Р-170 і исследования его функциональной активности при изучении клшшче-:кого материала. Обнаружено, что в ряде случаев хронического шіело-ідного лейкоза происходит преимущественная пролиферация стволовых :лсток системы кроветворения, несущих Р-170 и антиген CD3-1. Эти дан-іьіе позволяют надеяться, что в результате дальнейших исследований южно будет выделить подтип бластного криза хронического мнелонд-
ного лейкоза, имеющего данную характеристику. Впервые показано, что использование ДНК - специфичного красителя Хехст-33258 - позволяет оценивать количество антрацпклиновых антибиотиков, связавшихся с ДНК клеток. Впервые обнаружено, что сопоставление активности Р-170 в клетках различных линий с количеством антибиотика, дошедшего до ДНК этих клеток, позволяет выявить случаи, в которых фенотип МЛУ определяется не только функционированием Р-170, но и дополнительными механизмами.
Публикации
По теме диссертации опубликовано четыре статьи и шесть докладов. Две статьи приняты к печати.
Апробация результатов работы
Основные положения работы доложены на заседании Ученого совета НИИ канцерогенеза (21 января 1994 г.), на конференции по генетике соматических клеток в культуре (Черноголовка, 22-24 ноября 1993), а также на Международном симпозиуме "Использованпе приборов фирмы "Becton Dickinson" в научной п клинической практике". Диссертация апробирована и рекомендована к защите на заседании кафедры цитологии и гистологии биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова. Основные результаты диссертации изложены в 6 статьях и 6 тезисах докладов.
Объем и структура работы
Метод регистрации функциональной активности Р-170 основан на измерении скорости выведения из клеток флуоресцентных красителей, которые являются субстратами Р-170 (Neyfakh, 1988). Наиболее удобным и часто употребляемыми являются красители Родамин-123 и Хехст-33258. Родамин-123 при определенных внешних концентрациях практически одинаково накапливается клетками, устойчивыми к колхицину и клетками дикого типа. Скорость выведения красителя из клеток зависит от уровня пх устойчивости к селективному агенту. Время полного освобождения клеток от родамина при помещении их в среду без красителя - от нескольких минут для высокоустойчпвых популяций, до нескольких суток
для клеток исходных линий. В присутствии блокатора работы Р-170 ве-рапамнла ускоренного выведения красителей резистентными клетками не происходит, что свидетельствует о том, что оно было вызвано работой Р-170.
Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста н включает разделы: введение, обзор литературы, четыре главы собственных результатов' исследования, обсуждение полученных результатов и выводы. Список цитируемой литературы содержит более 150 источников. Работа иллюстрирована 2 таблицами п 28 рисунками.